一種包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子的脂質(zhì)磷酸鈣納米粒的制備及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體磷酸鈣納米粒(Lipide calcium phosphate nanoparticles LCP NP)，具體是以脂質(zhì)體包裹的磷酸鈣納米粒為載體及傳遞介質(zhì)，在其中包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)制備成化妝品原料或活性添加成分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑或膏霜?jiǎng)?。所述組合物具有滋潤(rùn)、保濕、修復(fù)、抗衰的作用，脂質(zhì)體磷酸鈣納米粒還能使攜帶的活性成分深入深層皮膚，活化深層皮膚細(xì)胞，起到重建皮膚屏障，修復(fù)敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。
【專利說(shuō)明】
-種包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子的脂質(zhì)磯酸巧納米粒的制備及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供一種W脂質(zhì)磯酸巧核必的組合物，具體是W脂質(zhì)體磯酸巧納米粒為主 要材質(zhì)，其可單獨(dú)使用，和/或作為載體及傳遞介質(zhì)，包裹細(xì)胞重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)生物活性蛋白制備成化妝品原料或活性添加成分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、 乳劑、凝膠劑、膏霜?jiǎng)?。屬于美容護(hù)膚品的技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 生物護(hù)膚品的主要成分生物活性多膚大部分是細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子（FGF)無(wú)疑是當(dāng)中的伎伎者。它們?cè)隗w內(nèi)含量極微，但生物活性極高，對(duì)多種細(xì)胞生理 功能和代謝活動(dòng)發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用，直接或間接地影響多種類型細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化、 增殖和遷移，在美容護(hù)膚、整形外科、燒傷潰瘍W及各種皮膚病的傷口修復(fù)與愈合中有重要 作用。但是皮膚致密的屏障功能使大分子FGF的經(jīng)皮吸收率低，無(wú)法發(fā)揮其優(yōu)良的生物活 性。提高FGF體外皮膚給藥的生物利用度一直是生物美容領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。
[0003] 現(xiàn)代制劑技術(shù)水平的提高，微囊包裹技術(shù)在醫(yī)藥行業(yè)的廣泛運(yùn)用，然而因其 在外用皮膚給藥方面的顯著優(yōu)勢(shì)也使其近年來(lái)在化妝品行業(yè)嶄露頭角。脂質(zhì)磯酸 巧化(P)納米粒是一種新型的基因轉(zhuǎn)染非病毒載體，已經(jīng)不僅成功用于體外將核酸遞 送入細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)，且有報(bào)道用于負(fù)載吉西他濱和Trp2多膚等抗腫瘤成分能顯著地 增強(qiáng)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[Zhang Y，Kim WY，Huang L. Systemic delivery of gemcit曰bine triphosphate vi曰 LCP nanoparticles for NSCLC 曰nd pancreatic cancer therapy [Jl.Biomaterials，2013, 34(13) ;；3447 ~；3458 ;Xu Z, Ramishetti S, Tseng YC,. Multifunctional nanoparticles co-delivering trp2peptide and CPG adjuvant induce potent cytotoxic t-lymphocyte response 曰g曰inst mel曰nom曰曰nd its lung metastasis[J].J Control Release, 2013,172(1) :259 ~26 引。該納米粒不但具備了脂質(zhì) 體和磯酸巧良好的生物粘附性和生物相容性，生物利用度及安全性高等特點(diǎn)，而且改變了 單純磯酸巧納米粒容易聚合的特點(diǎn)，大大提高了大分子活性成分的包封率和穩(wěn)定性，從而 提高內(nèi)含活性成分的療效。
[0004] 本發(fā)明公開了一種W脂質(zhì)磯酸巧納米粒為核必的組合物，具體是W脂質(zhì)磯酸巧納 米粒作為載體及傳遞介質(zhì)，包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FG巧生物活性蛋白制備而成的化妝品原料 或活性添加成分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜?jiǎng)?。具有滋?rùn)、保濕、 巧角質(zhì)、抗衰、抗氧化的作用。與市場(chǎng)上現(xiàn)有的產(chǎn)品比較，本發(fā)明的脂質(zhì)磯酸巧納米粒還能 使攜帶的活性成分深入深層皮膚，清除皮膚內(nèi)部自由基，活化深層皮膚細(xì)胞，特別適用于敏 感肌膚，起到重建表皮，修復(fù)敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種W脂質(zhì)磯酸巧納米粒的組合物，具體是W脂質(zhì)磯酸巧納米粒作 為載體及傳遞介質(zhì)，包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FG巧生物活性蛋白制備而成的化妝品原料或活性 添加成分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜?jiǎng)?。所述組合物具有滋潤(rùn)、保 濕、修復(fù)的作用，脂質(zhì)體磯酸巧納米粒還能使攜帶的活性成分深入深層皮膚，活化深層皮膚 細(xì)胞，起到重建皮膚屏障，修復(fù)受損及敏感肌膚，抗皺嫩膚的作用。
[0006] 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種W脂質(zhì)磯酸巧為核必的組合物，其包含1~ 50重量％的脂質(zhì)體，1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF。
[0007] 其中所述脂質(zhì)磯酸巧是W納米粒的形態(tài)存在，其粒徑為50nm~200nm。
[0008] 其中所述的FGF為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人 FGF(rhFGF)。主要包括重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFGF)，和重組人堿性成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子（riibFG巧中的一種。所述重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFG巧的氨基酸 序列（GenBank N0;AAB29057. 2)。所述的重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（riibFG巧的氨 基酸序列為（GenBank NO ;AAB21432. 2)。
[0009] 在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種脂質(zhì)磯酸巧納米粒為載體的包裹FGF的活性 半成品及其制備方法。
[0010] 其中所述包裹FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒的制備方法為：
[0011] (1)將表面活性劑、助表面活性劑和有機(jī)溶劑A按照混合，構(gòu)成油相Η元體系。將 氯化巧水溶液（10~250mM)、磯酸鹽水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/ mL)混合，制成水化將水相緩慢加入油相充分?jǐn)埌?，制成油包水的微乳，室溫靜置5~ 15min產(chǎn)生磯酸巧沉淀，將巧樣酸鋼溶液巧~50mM)逐滴加入微乳中，攬拌混合均勻，體系 又恢復(fù)澄清透明。微乳過(guò)Ig 60~200目的硅膠填充的硅膠柱，用體積比1~5 : 1的己 醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干己醇后即得磯酸巧納米粒水溶液。
[0012] (2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī)溶劑B中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除 去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾 膜，得到脂質(zhì)體溶液。
[001引 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0014] 步驟（1)中所述的有機(jī)表面活性劑為泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基離、十二烷基 硫酸鋼或聚山梨醇中的一種或幾種；
[0015] 所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、丙Η醇、己醇、異丙醇中的一種或幾種；
[0016] 所述的有機(jī)溶劑A為環(huán)己焼、正己焼、正辛焼中的一種；
[0017] 所述的表面活性劑；助表面活性劑：有機(jī)溶劑A=1~5 : 1~5 : 1~5。
[0018] 所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。
[0019] 所述的riiFGF為重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組 人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFG巧和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (riibFG巧中的一種。
[0020] 所述的氯化巧水溶液：磯酸鹽水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~ 200 : 10 ~50。
[0021] 步驟（2)中所述的有機(jī)溶劑B為氯仿、二氯甲焼、己醇中的一種或幾種混合；
[0022] 所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DS陽(yáng)-PEG2000)中的一種或幾種，優(yōu)選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0023] 所述的包裹FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒亦可通過(guò)W下制備方法獲得：
[0024] (1)將氯化巧水溶液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合， 作為混合液A。將磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作為混合液B。將 A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g離必5~30min，己醇洗2-3遍后揮干己醇， 加1~lOmL去離子水制成包含F(xiàn)GF的磯酸巧納米粒混懸液。
[00巧](2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī)溶劑B中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除 去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾 膜，得到脂質(zhì)體溶液。
[002引 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0027] 步驟（1)中所述的油相為環(huán)己焼/壬基酪聚氧己帰離巧0-80% : 50-20% )。氯 化巧水溶液；FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。
[0028] 所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。
[0029] 所述的FGF為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人 FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFG巧和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (riibFG巧中的一種。
[0030] 步驟（1)中所述的磯脂為1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜膽堿 值0PC)、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧中的一種，優(yōu)選1,2-油醜磯脂酸值0PA)。
[0031] 所述的磯酸鹽水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~30 : 0. 05~1。
[0032] 步驟（2)中所述的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一種或幾種混合；
[0033] 所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DSPE-PEG2000)中的一種或幾種，優(yōu)選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0034] 本發(fā)明所述包裹細(xì)胞生長(zhǎng)因子的脂質(zhì)磯酸巧納米?？蛇M(jìn)一步制備成泡沫劑、水 劑、乳劑、凝膠劑或膏霜?jiǎng)?br>[0035] 因此，本發(fā)明提供下述：
[0036] 1. -種W脂質(zhì)磯酸巧納米粒為核必的組合物，其包含1~50重量％的脂質(zhì)體， 1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF。
[0037] 2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的組合物，其中所述脂質(zhì)磯酸巧納米粒的粒徑為lOOnm~ 500nm。
[0038] 3.根據(jù)第1項(xiàng)所述的組合物，其中FGF為通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的重組人 FGF (rhaFGF 和 rlAFG巧。
[0039] 4.根據(jù)第1項(xiàng)所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體磯酸巧W納米粒形式存在，所述納 米粒負(fù)載有FGF，形成包裹有FGF的脂質(zhì)體磯酸巧米粒，其制備方法為；（1)將表面活性劑、 助表面活性劑和有機(jī)溶劑A按照混合，構(gòu)成油相Η元體系。將氯化巧水溶液（10~250mM)、 磯酸鹽水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，將水相緩 慢加入油相充分?jǐn)埌?，制成油包水的微乳，室溫靜置5~15min產(chǎn)生磯酸巧沉淀，將巧樣酸 鋼溶液巧~50ml)逐滴加入微乳中，攬拌混合均勻，體系又恢復(fù)澄清透明。微乳過(guò)Ig 60~ 200目的硅膠填充的硅膠柱，用體積比1~5 : 1的己醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 揮干己醇后即得磯酸巧納米粒水溶液。（2)取磯脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī) 溶劑B中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠 育0. 5~化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶液。（3)將（1)、（2)制備所得的溶液按照 0. 1~10 : 1混合即得。
[0040] 5.根據(jù)第4項(xiàng)步驟（1)中所述的有機(jī)表面活性劑為泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基 離、十二烷基硫酸鋼或聚山梨醇中的一種或幾種；所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、 丙Η醇、己醇、異丙醇中的一種或幾種；所述的有機(jī)溶劑A為環(huán)己焼、正己焼、正辛焼中的一 種；所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。所述的 riiFGF為重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人FGF(rhFGF)。主 要包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFG巧和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（riibFG巧中的一 種。步驟（2)中所述的有機(jī)溶劑B為氯仿、二氯甲焼、己醇中的一種或幾種混合；所述的磯 脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1，2-二油帰氧基3-Η甲 氨基丙焼值0ΤΑΡ)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值SPE-PEG2000)中的一種或幾 種，優(yōu)選1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0041] 6.根據(jù)第1項(xiàng)所述的組合物，其還可W通過(guò)下述制備所得；（1)將氯化巧水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合，作為混合液Α。氯化巧水溶 液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。將磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作為混合液B。磯酸鹽水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~ 30 : 0. 05~1。將A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g離必5~30min，己醇洗 2- 3遍后揮干己醇，加1~10血去離子水制成包含F(xiàn)GF的磯酸巧納米?；鞈乙骸＃?)取磯 脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī)溶劑B中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成 均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸傭水室溫賠育0. 5~化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶 液。做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[004引 7.根據(jù)第6項(xiàng)步驟（1)中所述的油相為環(huán)己焼/壬基酪聚氧己帰離 巧0-80% : 50-20% )。氯化巧水溶液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~ 30。所述的磯酸鹽水溶液為磯酸二氨鋼、磯酸氨二鋼、Η聚磯酸鋼中的一種或幾種。所述 的FGF為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人FGF(rhFGF)。主要包括 酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFG巧和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（riibFG巧中的一種。步驟 (1)中所述的磯脂為1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜膽堿值0PC)、二油醜基 磯脂醜己醇胺值0P巧中的一種，優(yōu)選1,2-油醜磯脂酸值0PA)。步驟（2)中所述的有機(jī)溶 劑為氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一種或幾種混合；所述的磯脂為大豆磯脂、卵磯脂、氨 化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1,2-二油帰氧基3-H甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二 醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值S陽(yáng)-PEG2000)中的一種或幾種，優(yōu)選1,2-二油帰氧基 3- H甲氨基丙焼值0TAP);
[0043] 8.第1-7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)磯酸巧組合物可作為化妝品原料或活性添加成 分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜?jiǎng)?br>[0044] 9.根據(jù)第8項(xiàng)所述的脂質(zhì)磯酸巧納米粒在其它制劑中的添加量為1~5重量％。
[0045] 10. -種皮膚修護(hù)系列化妝品，其包含有效量的1-9項(xiàng)中任一項(xiàng)的包裹細(xì)胞生長(zhǎng) 因子的脂質(zhì)磯酸巧納米粒組合物。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的一種包裹FGF的脂質(zhì)磯酸巧納米粒具有下述優(yōu) 點(diǎn)：
[0047] 1、細(xì)胞生長(zhǎng)因子常溫穩(wěn)定性差，易降解，易失活；生物利用率低、半衰期短、代謝迅 速等特點(diǎn)，在常規(guī)劑型應(yīng)用中存在諸如穩(wěn)定性差，給藥方式單一、用藥損傷大、生物利用度 低等眾多特點(diǎn)。由于穩(wěn)定性的限制，市售的FGF主要有凍干制劑和液體制劑，其他劑型較為 少見。磯酸巧W其良好的穩(wěn)定性目前已被廣泛應(yīng)用于口腔正崎護(hù)理、骨替代物、藥物遞送材 料及血管支架中，而脂質(zhì)體近年來(lái)也同樣被廣泛利用于多膚和蛋白的載體。W脂質(zhì)包裹磯 酸巧納米粒為載體極大程度地提高FGF的穩(wěn)定性。
[0048] 2、脂質(zhì)體與磯酸巧均為緩釋制劑載體，使內(nèi)含物緩慢釋放，延長(zhǎng)內(nèi)含物作用時(shí)間， 在細(xì)胞內(nèi)外持久的發(fā)揮作用。減少使用量，提高使用安全性。
[0049] 3、極高的組織相容性，脂質(zhì)磯酸巧納米粒增加皮膚對(duì)FGF的吸收，外層脂質(zhì)的生 物膜類似結(jié)構(gòu)與皮膚角質(zhì)層磯脂結(jié)構(gòu)相互作用，改變角質(zhì)層對(duì)藥物的屏障作用，通過(guò)吸附、 融合等方式將藥物釋放到皮膚細(xì)胞間隙。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 附圖1FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒制備流程圖。
[0051] 附圖2FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒制備流程圖。
[0052] 附圖3Bal b/c 3T3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)倒置顯微鏡下（40X)細(xì)胞狀態(tài)圖對(duì)比。（1)為 aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒組；（2)為空白對(duì)照組。（1)組比（2)組細(xì)胞顯著增加。表明aFGF 在制備成脂質(zhì)磯酸巧納米粒后仍然保持極高的增值活性。
[0053] 附圖4Bal b/c 3T3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖情況對(duì)比圖。
[0054] 附圖5aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒與aFGF原液穩(wěn)定性比較。（1)為4°C條件下存放時(shí) 兩種樣品的活性變化；（2)為25Γ條件下存放時(shí)兩種樣品的活性變化；（3)為4(TC條件下 存放時(shí)兩種樣品的活性變化。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于送些具體的實(shí)施例。
[0056] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，如無(wú)特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中所用的試劑均為市售分 析純級(jí)別的試劑。
[0057] 實(shí)施例1FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒的制備（方法一）
[0058] (1)將聚己二醇辛基苯基離燈riton X-l)2. 52mL、正己醇1. 68mL、環(huán)己焼2. 8血混 合，構(gòu)成油相Η元體系7血。將250mM氯化巧水溶液100 μ L，250mM磯酸氨二鋼100 μ L W 及25 μ L0.1 mg/mL的aFGF或bFGF混合，制成水相，將水相緩慢加入油相充分?jǐn)埌?，制成?包水的微乳，室溫靜置15min產(chǎn)生磯酸巧沉淀，將125 μ L 15mM的巧樣酸鋼溶液逐滴加入微 乳中，攬拌混合均勻，體系又恢復(fù)澄清透明。微乳過(guò)Ig 60~200目的硅膠填充的硅膠柱， 用體積比3 : 1的己醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干己醇后溶于5mL的蒸傭水中。
[0059] 似取D0TAP (購(gòu)自西安瑞樓生物科技有限公司）與膽固醇按質(zhì)量比4 : 1的比例 混合，溶于無(wú)水己醇5mL中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫 的5mL蒸傭水水合化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶液。
[0060] 做將（1)、似巧[J備所得的溶液按照1 : 1的體積混合即得aFGF或bFGF脂質(zhì)磯 酸巧納米粒。
[0061] 實(shí)施例2FGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒的制備（方法二）
[0062] (1)取 300 μ L 500mM 的氯化巧水溶液，100 μ L 2mg/mL aFGF 或 bFGF 溶液，15血環(huán) 己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合作為溶液A。將300 μ L25mM磯酸氨二鋼溶液（pH =9. 0),15血環(huán)己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合后加入200uL，20mg/血D0PA(購(gòu) 自西安瑞樓生物科技有限公司）攬拌均勻作為溶液B。將溶液A和溶液B混合20min，加入 30血己醇，12000g離必15min，己醇洗2~3遍后揮干己醇，用1血去離子水溶解。即得包 含F(xiàn)GF的磯酸巧納米?；鞈乙?。
[006引 似取D0TAP與膽固醇（均購(gòu)自西安瑞樓生物科技有限公司）按質(zhì)量比4 : 1的 比例混合，溶于無(wú)水己醇中，于5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入 同溫的5mL蒸傭水水合化，過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶液。
[0064] (3)將500 μ L磯酸巧納米粒（Ca巧加入50 μ L脂質(zhì)體溶液，混合均勻即得。
[0065] 實(shí)施例3aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒凝膠劑的制備
[0066] 按照實(shí)施例1制備包含aFGF的脂質(zhì)磯酸巧納米粒凍干粉備用，并按照下述方法制 備凝膠劑：
[0067] 各組分的質(zhì)量百分比如下（質(zhì)量％ ):
[0068]
[0069]
[0070] 將aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒凍干粉lOg用蒸傭水溶解備用，加入卡波姆Ig、甘油 8邑、山梨酸鐘0. 1 Ig，攬拌溶解，加入Η己醇胺2g調(diào)節(jié)抑值到6-7,加入蒸傭水至全量，攬拌 均勻，制成凝膠lOOg，即得到包含aFGF的脂質(zhì)磯酸巧納米粒凝膠劑。
[0071] 該凝膠劑同樣具有良好的創(chuàng)面修復(fù)作用，由于凝膠的膠黏特性，作用時(shí)間更持久， 保濕效果更好，并能有效的隔絕作用部位與空氣的接觸，避免傷口的感染發(fā)炎，并降低過(guò)敏 的發(fā)生率。使用方便，清洗簡(jiǎn)單。
[0072] 實(shí)施例4皮膚修復(fù)乳液
[0073] 組成乳液的產(chǎn)品的組分及百分?jǐn)?shù)含量為：
[0074]
[00巧]制備方法：
[0076] (1)將A組加熱到8(TC后攬拌5min溶解均勻，靜置冷卻至4(TC。
[0077] (2)按照實(shí)施例1所述方法制備aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒。將事先混合溶解的B組 分加入上述A組分的混合溶液攬拌均勻。
[0078] (3)將C組分的加入上述兩組分的混合溶液，攬拌均勻即得。
[0079] 實(shí)施例5皮膚修復(fù)霜
[0080] 組成霜的產(chǎn)品的組分及百分?jǐn)?shù)含量為：
[0081]
[0082] 制備方法：
[008引 （1)將A組加熱到8(TC后攬拌5min溶解均勻，靜置冷卻至4(TC。
[0084] (2)將C組分用適量去離子水溶解備用，將C組分加入A組分中，攬拌3min使其均 勻。
[0085] (3)按照實(shí)施例1所述方法制備aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒。將事先混合溶解的B組 分加入上述兩組分的混合溶液攬拌均勻即得。
[0086] 實(shí)施例6aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒促進(jìn)3T3細(xì)胞增殖作用
[0087] 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3細(xì)胞（3T3細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中必） 用含10% FBS(FBS購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基 購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）常規(guī)培養(yǎng)至80%~90%匯合，用0. 25%膜酶消化，W 0. 5X 105個(gè)/ ml的細(xì)胞數(shù)目接種于96孔板，培養(yǎng)2地后，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后將培養(yǎng)基吸出 后分別加入濃度為50、25、12. 5、6. 25、3. 125 μ g/mL的實(shí)施例1制備的包裹aFGF脂質(zhì)磯酸 巧納米粒、aFGF原液W及空白的脂質(zhì)磯酸巧納米粒（不含aFGF)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空 白組為六個(gè)復(fù)孔。給藥后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2地，加入10 μ 1喔哇藍(lán)（MTT) (0. 5mg/ml)， 培養(yǎng)箱中賠育地后，吸出孔中溶液并加入150 μ 1 DMS0,振蕩后于570皿波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度 0D值。結(jié)果見圖3和圖4。
[0088] 圖3結(jié)果顯示與空白脂質(zhì)磯酸巧納米粒對(duì)照組比較，aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒具有 顯著的促細(xì)胞增殖作用。圖4結(jié)果顯示aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒與aFGF細(xì)胞原液同樣具有 顯著的細(xì)胞增殖效果，且具有良好的濃度依賴性，表明w脂質(zhì)磯酸巧納米粒為載體包裹的 FGF仍然保持著良好的細(xì)胞增殖活性。
[0089] 實(shí)施例7包裹重組人細(xì)胞生長(zhǎng)因子的脂質(zhì)磯酸巧納米粒穩(wěn)定性考察
[0090] 分別將上述3批aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米?；疌P-aFG巧和aFGF水溶液于溫度4°C、 25°C和4(TC的條件下密閉放置。于放置后0、1、3、5、10、30、60、90天分別檢測(cè)兩者活性。結(jié) 果見圖5。
[0091] 圖5中（1)為4°C條件下存放時(shí)兩種樣品的活性變化；（2)為25°C條件下存放時(shí) 兩種樣品的活性變化；（3)為4(TC條件下存放時(shí)兩種樣品的活性變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4Γ、 25°C和4(TC的條件下的aFGF脂質(zhì)磯酸巧納米粒組比aFGF原液組降解速度顯著降低。表明 脂質(zhì)磯酸巧納米粒作為載體具有顯著提高內(nèi)含物細(xì)胞生長(zhǎng)因子的穩(wěn)定性，使活性成分在常 溫使用條件下仍能保持較高活性，便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，延長(zhǎng)產(chǎn)品有效期。
[0092] 應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述， 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神 和范圍的條件下，可W在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可W進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意 組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以脂質(zhì)磷酸鈣納米粒為核心的組合物，其包含1~50重量％的脂質(zhì)體，1~50 重量％磷酸鈣，0. 0001~1重量％的細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)磷酸鈣納米粒的粒徑為50nm~ 200nm〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中FGF為通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的重組人FGF，主 要為重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFGF)和重組人堿性細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhbFGF)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體磷酸鈣以納米粒形式存在，所述納 米粒負(fù)載有FGF，形成包裹有FGF的脂質(zhì)體磷酸鈣米粒，其制備方法為：（1)將表面活性劑、 助表面活性劑和有機(jī)溶劑A按照混合，構(gòu)成油相三元體系。表面活性劑：助表面活性劑： 有機(jī)溶劑A=I~5 : 1~5 : 1~5。將氯化鈣水溶液（10~250mM)、磷酸鹽水溶液 (10~250mM)以及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，氯化鈣水溶液：磷酸鹽 水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~200 : 10~50。將水相緩慢加入油相充分?jǐn)嚢瑁?制成油包水的微乳，室溫靜置5~15min產(chǎn)生磷酸鈣沉淀，將檸檬酸鈉溶液（5~50mM)逐滴 加入微乳中，攪拌混合均勻，體系又恢復(fù)澄清透明。微乳過(guò)Ig 60~200目的硅膠填充的硅 膠柱，用體積比1~5 : 1的乙醇/水為洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干乙醇后即得磷酸鈣 納米粒水溶液。（2)取磷脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī)溶劑B中，于50°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸餾水室溫孵育0. 5~3h，過(guò)0. 22 μ m 微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶液。（3)將（1)、（2)制備所得的溶液按照0.1~10 : 1混合即得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4,步驟（1)中所述的有機(jī)表面活性劑為泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基 醚、十二烷基硫酸鈉或聚山梨醇中的一種或幾種；所述的助表面活性劑為正己醇、丙二醇、 丙三醇、乙醇、異丙醇中的一種或幾種；所述的有機(jī)溶劑A為環(huán)己烷、正己烷、正辛烷中的一 種；所述的磷酸鹽水溶液為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三聚磷酸鈉中的一種或幾種。所述的 rhFGF為重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人FGF (rhFGF)。主 要包括酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhbFGF)中的一 種。步驟（2)中所述的有機(jī)溶劑B為氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一種或幾種混合；所述的磷 脂為大豆磷脂、卵磷脂、氫化磷脂、二油?；字Ｒ掖及罚―OPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲 氨基丙烷（D0TAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一種或幾 種，優(yōu)選1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其還可以通過(guò)下述制備所得：（1)將氯化鈣水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL)以及油相混合，作為混合液A。氯化鈣水溶 液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~30。將磷酸溶液（10~50mM，pH = 9.0)，油相以及磷脂混合，作為混合液B。磷酸鹽水溶液：油相：磷脂=0.05~I : 10~ 30 : 0.05~1。將A、B混合20min，加入10~50mL乙醇，12000g離心5~30min，乙醇洗 2-3遍后揮干乙醇，加1~IOmL去離子水制成包含F(xiàn)GF的磷酸鈣納米?；鞈乙?。（2)取磷 脂和膽固醇按1~10 : 1混合，溶于有機(jī)溶劑B中，于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，形成 均勻脂質(zhì)薄膜。加入同溫的蒸餾水室溫孵育〇. 5~3h，過(guò)0. 22 μ m微孔濾膜，得到脂質(zhì)體溶 液。⑶將（1)、（2)制備所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。7. 根據(jù)權(quán)利要求6,步驟（1)中所述的油相為環(huán)己烷/壬基酚聚氧乙烯醚 (50-80% : 50-20% )。氯化鈣水溶液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~ 30。所述的磷酸鹽水溶液為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三聚磷酸鈉中的一種或幾種。所述 的FGF為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選自基因工程技術(shù)獲得的重組人FGF (rhFGF)。主要包括 酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhaFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhbFGF)中的一種。步驟 (1)中所述的磷脂為1，2-油酰磷脂酸（DOPA)，1，2-二油?；字Ｄ憠A（DOPC)、二油?；?磷脂酰乙醇胺（DOPE)中的一種，優(yōu)選1，2_油酰磷脂酸（DOPA)。步驟（2)中所述的有機(jī)溶 劑為氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一種或幾種混合；所述的磷脂為大豆磷脂、卵磷脂、氫 化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、1，2_二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)、聚乙二 醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一種或幾種，優(yōu)選1，2_二油烯氧基 3_三甲氨基丙烷（DOTAP)。8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)磷酸鈣組合物可作為化妝品原料或活性添加成 分，并可進(jìn)一步制備成泡沫劑、水劑、乳劑、凝膠劑、膏霜?jiǎng)?. 根據(jù)權(quán)利要求8,所述的FGF脂質(zhì)磷酸鈣納米粒在其它制劑中的添加量為1~5重 量％。10. -種皮膚修護(hù)系列化妝品，其包含有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的包裹細(xì)胞生 長(zhǎng)因子的脂質(zhì)磷酸鈣納米粒組合物。
【文檔編號(hào)】A61Q19/00GK105878047SQ201410815272
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日
【發(fā)明人】黃亞?wèn)|, 項(xiàng)琪, 貝煜, 鄭青, 肖巧學(xué)
【申請(qǐng)人】廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心, 廣州市暨鵬生物科技有限公司