增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的治療的制作方法
【專利說(shuō)明】増生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的治療
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 要求2013年10月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/887,747號(hào)的權(quán)益；其通過(guò)引 用完整地并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本文提供了用于通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶l(TAK-l)的活性來(lái)治療增生性 玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)的方法。還提供了用于在所述治療中使用的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0004] 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)是發(fā)展為在視網(wǎng)膜脫離(RD)時(shí)的并發(fā)癥的結(jié)疤過(guò) 程，并且它是RD治療上外科手術(shù)失敗的最常見原因（Ho等，Br J Ophthalmol 1985,69:584-587) WVR是一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，其特征在于在脫離的視網(wǎng)膜上形成纖維化組織而阻止視網(wǎng)膜的 復(fù)位，并且最終可能引起失明（Lambert等，Seminars in ophthalmology 1995，10:49_52)〇 通常位于視網(wǎng)膜的外細(xì)胞層的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞是眼部纖維化疾病發(fā)展的最關(guān)鍵 造成因素。在PVR期間，RPE細(xì)胞通過(guò)被稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過(guò)程轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣 細(xì)胞(Takahashi等，J Biol Chem 2010,285:4060-4073)。在從上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞 的過(guò)程中，它們失去其上皮細(xì)胞特征，如極性和特殊的細(xì)胞與細(xì)胞接觸，并獲得迀移性間充 質(zhì)細(xì)胞性能(Grisanti等，Invest Ophthalmol Vis Sci 1995,36:391-405)。通過(guò)細(xì)胞表面 分子的表達(dá)、細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分介導(dǎo)這些過(guò)程(Thiery等，Cell 2009， 139:871-890;Kalluri等，J Clin Invest 2009,119:1420-1428)^]^可以被不同的信號(hào)分 子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)激活，然而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子i3-l(TGF-0 1)被認(rèn)為是 EMT 的主要調(diào)節(jié)因子（Garweg 等，Surv Ophthalmol 2013,58:321_329; Lamouille等，I 2007，178:437-451;Charteris，B;r J 0phthalmoll995,79:953_960)〇
[0005] 已在各種細(xì)胞類型中觀察到TGF-β介導(dǎo)的EMT，包括晶狀體上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì) 胞以及其他細(xì)胞（Saika S，Lab Invest 2006,86:106-115) JGF-β是具有一系列生物學(xué)效 應(yīng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，通過(guò)雙刃劍效應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激的免疫調(diào)節(jié)的一種多 功能的細(xì)胞因子（Desmouliere等，J Cell Biol 1993，122:103_lll;Yoon等，Oncogene 2005，24:1895-1903)。下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至TGF-β受體復(fù)合物由Smads家族經(jīng)典通路介 導(dǎo)（Zhang等，Cell Res 2009,19:128-139)。近期報(bào)告已經(jīng)證明了絲裂原活化蛋白（MAP)激 酶激酶激酶家族的成員轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1(TAK1)參與非經(jīng)典通路中的TGF-iH言號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)（Mu Y等，Cell Tissue Res 2011，347:ll-20;Yamaguchi等，Science 1995,270:2008_ 2011;Kajino等，J Biol Chem 2007,282:9475-9481)。然而至今為止，TAK1 在RPE細(xì)胞信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)和介導(dǎo)PVR發(fā)展中的作用還未知。TAK1是被TGF-βΙ迅速地活化然后活化其他MAP激酶如 p38的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶(Ma等，Am J Physiol Renal Physiol 2011，300 :F141〇-1421;Wang等，J Biol Chem 1997,272:22771-22775)。此外，研究表明TAK1 可以通過(guò)誘導(dǎo) Smad7表達(dá)以及還通過(guò)與Smad蛋白MH2結(jié)構(gòu)域的直接相互作用干擾R-Smad反式激活來(lái)調(diào)節(jié) Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TGF-β誘導(dǎo)的活化（Brown等，J Cell Biochem 2007,101:9-33) JAK1 除了 調(diào)節(jié)Smad功能的作用外，在特定的TGF-β 1革El標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控中在Smad與TAK1的下游革巴標(biāo) 如P38MAPK和ATF2之間存在交互對(duì)話（cross-talk)(Zhang等，Cell Res 2009,19:128-139; Mu Y等，Cell Tissue Res 2011,347:11-20)。盡管TAK1 活化和TGF-βΙ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，眾 所周知TAK1的活化也可以通過(guò)各種刺激引起，這些刺激包括:環(huán)境壓力，促炎性細(xì)胞因子如 腫瘤壞死因子a(TNF-c〇、白介素（IL)-l以及脂多糖(LPS) (Conner等，Biochem J 2006，399: 427-434)。活化的TAK1可將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到數(shù)個(gè)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括MKK4/7-JNK、MKK3/6-P38MAPK和核因子-kB(NF-kB)誘導(dǎo)激酶（ΝΙΚ)-ΙκΒ激酶（IKK)(Hanada等，Biol Chem 2001， 276:5753-5759)。
[0006] 用于RD控制的目前可用的外科手術(shù)的選擇是充氣性視網(wǎng)膜固定術(shù)、鞏膜扣帶術(shù)、 玻璃體切除術(shù)和睫狀體平坦部玻璃體切除術(shù)(PPV)。盡管PVR主要是手術(shù)上的控制，并且其 在技術(shù)上有巨大的進(jìn)步，但是在1988至2003年間的PVR患者數(shù)量仍舊保持相似。對(duì)于PVR該 高發(fā)病率可能的解釋可以解釋為沒有防止使用玻璃體切除術(shù)發(fā)生的一定程度的細(xì)胞粘附 和病理學(xué)變化的能力。因此，繼續(xù)需要開發(fā)出能夠?qū)崿F(xiàn)RD的較好治療效果的PVR療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文公開了 TAK1在RPE細(xì)胞中介導(dǎo)TGF-m誘導(dǎo)的EMT的觀察結(jié)果。本發(fā)現(xiàn)使得能夠 開發(fā)用于治療PVR的藥物組合物及其使用方法。
[0008] 因此，本文提供了一種用于在對(duì)象中預(yù)防或治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR) 的藥物組合物，其包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1 (TAK-1)的活化或激酶活性中至少一種的 抑制劑。還描述了用于抑制或預(yù)防RPE細(xì)胞中的ΕΜΤ的類似配制的組合物。
[0009] 本文還描述了用于在對(duì)象中預(yù)防或治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)的方法， 其包括向有此需要的對(duì)象施用治療上有效量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶l(TAK-l)的活化或 激酶活性中至少一種的抑制劑，從而預(yù)防或治療PVR。
[0010]此外，描述了用于在對(duì)象中抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的 方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用治療上有效量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶l(TAK-l)的 活化或激酶活性中至少一種的抑制劑，從而預(yù)防或治療PVR。
[0011]根據(jù)參照附圖進(jìn)行的下列詳細(xì)描述，前述和其他的目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得更 加明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1顯示在RPE細(xì)胞中TAK1在TGF-m刺激下被活化。RPE細(xì)胞用TGF-m (2.5ng/ml) 處理指定的時(shí)間或不處理。然后用磷酸化-Thr 187TAK1抗體(綠)和DAPI (藍(lán))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免 疫染色。示出三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性照片。對(duì)于所有圖像，比例尺為1〇μπι。
[0013] 圖2顯示在TGF-β刺激下的RPE細(xì)胞中ΤΑΚ1調(diào)控EMT表現(xiàn)型。圖2Α:將RPE細(xì)胞血清饑 餓16小時(shí)，用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)預(yù)處理或不處理1小時(shí)。然后細(xì)胞用TGF-βΙ (2.5ng/ml) 處理24小時(shí)，并且用α-SMA抗體(紅）和DAPI (藍(lán))進(jìn)行免疫染色。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性照 片。圖2B:將RPE細(xì)胞血清饑餓16小時(shí)，然后用絲裂霉素 C(10ng/ml)處理3小時(shí)。其后，細(xì)胞用 5Z-7-〇xozeaenol(lyM)或二甲亞砜(DMS0)預(yù)處理1小時(shí)。在此過(guò)程后，在細(xì)胞單層中實(shí)施 刮劃，并且用TGF-01(2.5ng/ml)補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基或不補(bǔ)充。在指定時(shí)間對(duì)劃痕拍照記錄 (上圖），并且使用Image-J軟件測(cè)量它們的寬度。柱狀圖（下圖）說(shuō)明每一時(shí)間點(diǎn)剩余間隙相 對(duì)于初始間隙寬度的百分比，其基于三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。柱狀條為平均值土 SD。圖2C:將RPE細(xì) 胞血清饑餓16小時(shí)，然后用5Z-7-〇xozeaenol(lyM)、SB431542(10yM)或DMSO預(yù)處理1小時(shí)。 然后用含有或不含有TGF-βΙ (2.5ng/ml)的無(wú)血清培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，并在24小時(shí)后收集不 同處理的上清液。通過(guò)明膠酶譜檢測(cè)處理總MMP-9活性(上圖），并通過(guò)Quantity One? 1-D 分析軟件計(jì)算帶強(qiáng)度值。示出顯示在不同處理中MMP-9分泌水平的柱狀圖（下圖）。
[0014] 圖3顯示TGF-β通過(guò)TAK1調(diào)控RPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄變化。圖3A:將RPE細(xì)胞接種 于纖連蛋白涂覆的蓋玻片上，并血清饑餓16小時(shí)，用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)或SB431542( 10 μΜ)或DMS0預(yù)處理1小時(shí)，然后用或不用TGF-βΙ處理2天。處理后，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(肌動(dòng) 蛋白纖維-綠)和DAPI(藍(lán))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過(guò)共聚焦顯微鏡可視化。細(xì)胞大小用白色 箭頭指示。比例尺：20μΜ。圖3B:血清饑餓的RPE細(xì)胞用5Z-7-〇xozeaenol (ΙμΜ)或DMS0預(yù)處理 1小時(shí)，并如圖3Α暴露于TGF-β。在每一時(shí)間點(diǎn)提取總RNA并進(jìn)行qPCR。在6小時(shí)、16小時(shí)和24 小時(shí)后測(cè)定CTGF的轉(zhuǎn)錄水平。柱狀條代表在相同樣品中相對(duì)于GAPDH mRNA的特定mRNA的 量。所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。示出來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性柱狀圖。圖3C:接種RPE細(xì)胞 并如圖3A進(jìn)行處理。處理后，用E-鈣黏著蛋白抗體(綠)和DAPI(藍(lán))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。示 出兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性照片。
[0015]圖4顯示TAK1的抑制消除了 TGF-M言號(hào)級(jí)聯(lián)的活化。圖4A :用或不用5Z-7-oxozeaenol(ΙμΜ)預(yù)處理血清饑餓的RPE細(xì)胞1小時(shí)，然后用TGF-0(2.5ng/ml)處理指定