專利名稱：：TGF-β活化反應(yīng)阻礙物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及阻礙TGF-(3活化反應(yīng)的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)化生長因子(TransformingGrowthFactor(TGF)-|3)Mil強(qiáng)力促駐間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生同時(shí)抑制上皮細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致肝纖維似肝硬化、動脈硬化、肺纖維癥、硬皮癥、腎機(jī)能不全(腎小球腎炎)、骨髓纖維化等硬化性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等病態(tài)；另外由于其抑制皮膚角化細(xì)胞的增殖、機(jī)能，誘導(dǎo)凋亡，因此與脫毛關(guān)系密切；財(cái)卜其也抑制免疫細(xì)胞的機(jī)能等，是一種表現(xiàn)出多種生物活性的分子量為25kD的同型二聚體多功能細(xì)胞因子。由使用針對TGF-J3的中和抗體的動t^莫型的研究可知，Mil抑制TGF-P的功能能夠預(yù)防、治療硬化性疾病。例如文獻(xiàn)報(bào)道可以通過fOTTGF-P的中和抗體、TGF-(3受體的抗體的抗體療法^M[吏用顯性失活TGF-|3受體基因或可溶性TGF-P受體基因的基因治療狄口制止TGF-(3的作用(日本特開2004-121001號公報(bào)；Schuppan等人，Digestion59:385-390,1998;Qi等人，ProcNatlAcadSciUSA96:2345-2349,1999;Ueno等人，HumGeneTher11:3342,2000)。但是，在抗體療法或基因治療中在必要量和給藥方法方面存在問題，不能馬上在臨床應(yīng)用。因此，進(jìn)行了基于TGF-卩的作用機(jī)理的低好阻礙齊啲開發(fā)。本發(fā)明的研究者在動物模型上研究發(fā)現(xiàn)低分子化合物cytoxazone(iM卜M)l抑制TGF-P的信號傳導(dǎo)31^柳制肝臟疾病的病態(tài)形成(國際公開^V02005/039570號)，但是尚未鑒定出Cytoxazone直接作用的耙蛋白。另外，著眼于TGF-卩作為潛活形式被產(chǎn)生出來、由于穀U蛋白酶的作用而轉(zhuǎn)換為活性型分子(TGF-P活化反應(yīng))，在動物模型上研究顯，逝OT低M合成蛋白酶抑制劑(Okuno等人，Gastroenterology120:18784-1800,2001)或抗體(日本特開2003-252792號公報(bào)；Akita等人，Gastroenterology123:352-364，32002)阻礙TGF-|3的活化反應(yīng)，有可能能夠預(yù)防疾病。但是現(xiàn)在的蛋白酶抑制劑的抑制譜寬，用于人體有可能有副作用。另外現(xiàn)在的抗體由于有效濃度比較高，用于人時(shí)由于必須要大量純化抗體，費(fèi)用可能會比駄。另外，本發(fā)明人在世界范圍內(nèi)首次測定了上述的TGF-卩活化反應(yīng)時(shí)被切斷的部位，成功制備了識別所述切斷面的抗體，并且〗頓該抗體證明了在人肝疾病中蛋白存TGF-P活化反應(yīng)在發(fā)揮作用(國際公開WO2005/023870號)。過去，報(bào)告了一禾中由8-17個(gè)氨基酸組成的肽，其能在永生化毛乳頭細(xì)胞株中抑制TGF-卩的產(chǎn)生(日本特開2005-239695號公報(bào))，但是沒有揭示包括是否抑制基因表達(dá)、是否抑制活化反應(yīng)的作用機(jī)制以及在體內(nèi)的有效性。另外，美國阿拉巴馬大學(xué)的Murphy-UMch的研究小組ffl^t糖蛋白血小板反應(yīng)蛋白1引起的附著型TGF-I3活化反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，血小板反應(yīng)蛋白1的第412415的序列KRFK與LAP的第54-57的序列LSKL結(jié)合弓|起活化，并且發(fā)現(xiàn)合成肽KRFK活化TGF-卩，而合成肽LSKL抑制TGF-|3活化反應(yīng)(Schultz-Cheny等人，J.Biol.Chem.270:7304-7310,1995;Crawford等人，Cell93:1159-1170,1998;Ribeiro等人，J.Biol.Chem.274:13586-13593,1999;Murphy-UllrichandPoczatekCytokine&GrowthFactorReviews11:59-69,2000)。作為LAP的第54-57的序列的LSKL，與本發(fā)明人測定的纖溶酶切斷部位K56-L57—致。血小板反應(yīng)蛋白1M31與該部分結(jié)合^l過蛋白酶切斷該部分阻礙該部分與活性型TGF-pi肝間糊哄價(jià)結(jié)合，結(jié)果活性型TGF-pi肝從潛復(fù)合體中釋放出來，即該部分為引起TGF-(31活化反應(yīng)的部分。但是，通過本發(fā)明的研究者的重復(fù)i(驗(yàn)，沒有再現(xiàn)合劍太KRFK誘導(dǎo)TGF-(3活化反應(yīng)以及合成肽LSKL抑制TGF-P活化反應(yīng)。Muiphy-Ullrich等揭示了血小板反應(yīng)蛋白1依存附著型TGF-P活化反應(yīng)與肺^I夷臟的病態(tài)形成的關(guān)系，但是沒有研究與肝病的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題。即本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能夠阻礙TGF-(3活化反應(yīng)的物質(zhì)，特別是提供育,阻礙TGF-P活化反應(yīng)本發(fā)明人為解決戰(zhàn)技術(shù)問^it行了深入研究，在本發(fā)明人的TGF-(3在肝臟通過稱為纖溶酶、血漿mi太釋放酶的蛋白酶被活化，從而發(fā)揮生物活性這一過去的發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，成功地合成了會嫩在低濃度穩(wěn)定地抑制纖溶隞血漿激肽釋放謝衣存性TGF-(3活化反應(yīng)的肽，從而完成了本發(fā)明。艮P，M31本發(fā)明提供(1)包含11~50個(gè)氨基酸殘基的肽，該肽含有Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中XI至X4分別獨(dú)立地表示任意的氨基酸殘基，XI-X2-X3-X4新Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列)表示的氨基,列。(2)如(1)所述的肽，其中X1和X3為堿性氨基酸以外的氨基酸殘基。(3)包含ll50個(gè)氨基l^戔基的肽，其含有下記的(i)至(iv)中的任意的氨基酸序列。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4)如(1)~(3)中任一項(xiàng)所述的肽，其長度為1120個(gè)氨基^^基。(5)肽，其包含Gln-Ue-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中XI至X4分別獨(dú)立i條示任意的氨基酸殘基，Xl-X2-X3-X4標(biāo)Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列)表示的氨基,列。(6)活性型TGF-P生成抑制劑，其含有(1)(5)中任一項(xiàng)所述的肽。(7)用于治療和/或預(yù)防與TGF-卩相關(guān)的病態(tài)的藥物，其含有(1)(5)中任一項(xiàng)所述的肽。(8)肝再生劑或肝纖維化抑制劑，其含有(1)(5)中任一項(xiàng)所述的肽。在活體內(nèi)，特別是在肝臟疾病的病態(tài)形成過程中，TGF-P的特定部位被蛋白酶切斷，釋放出活性型TGF-P?；钚孕蚑GF-P誘導(dǎo)肝纖維俗肝硬化，抑制肝細(xì)胞的增殖、即肝再生。本發(fā)明的肽作為作用于該切斷部位的蛋白酶的誘餌，競爭性地抑制TGF-P活化反應(yīng)，能夠高效地抑制與TGF-P相關(guān)的病態(tài)的形成。圖1表示QP肽、QPA肽和T200肽。圖2表示來自TGF-P活化蛋白酶切斷序列的月M肝星狀細(xì)胞的活化抑制。圖3g來自TGF-p活化蛋白酶切斷序列的月樹肝再生不全的改善(照片)。圖4g來自TGF-P活化蛋白酶切斷序列的月樹肝再生不全的改善(數(shù)值化)。圖5表示QPQ肽的序列。圖6表示QP肽和QPQ肽對LAP切斷反應(yīng)的抑制。圖7表示QP肽、QPA肽、QPQ肽、T200肽對培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的影響的觀察結(jié)果。圖8表示^^牛培養(yǎng)基中的活性型TGF-卩生成量的測定結(jié)果。圖9表示QP肽、QPA肽和QPQ月M肝再生不全的改善(照片)。圖10表示QP肽、QPA肽和QPQli!^t肝再生不全的改善(數(shù)值化)。圖11表示肝組織中的TGF-(31生成量的測定結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。轉(zhuǎn)化生長因子(TransformingGrowthFacto《TGF)"P)與各種5更化性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的病態(tài)形成相關(guān)、與脫毛關(guān)系密切、抑制免疫細(xì)胞的機(jī)能；另外它也能通過抑制蛋白酶的過量產(chǎn)生而防止肺組織分解而導(dǎo)致肺氣腫、抑制癌細(xì)胞的增殖等，是一種顯示多種生物活性的分子量為25kD的同型二聚體多功能細(xì)胞因子。人類存在TGFH31—P3的3種異構(gòu)體(isoform)。TGF-P作為不能與受體結(jié)合的分子量約300kD的無活性潛在型產(chǎn)生，在耙細(xì)胞表面或其周圍被活化，成為能與受體結(jié)合的活性型，進(jìn)而發(fā)揮作用。TGF-p對革巴細(xì)胞的作用通過稱為Smad的擔(dān)當(dāng)信號傳導(dǎo)的一系列蛋白的磷謝^各傳達(dá)。首先，活性型TGF-P與靶細(xì)胞表面存在的II型TGF-P受體結(jié)合，形成包含2肝n型受體與2舒I型TGF-(3受體的受體復(fù)合物，n型受俐每I型受體磷酸化。接著，磷酸化的I型受糊每Smad2或Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2或Smad3與Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至核，與目標(biāo)基因啟動子區(qū)蹄在的稱為CAGAbox的耙序列結(jié)合，與輔激活物一同誘導(dǎo)耙基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)潛在型TGF-(3在肝臟由于蛋白酶的切斷而活化，發(fā)揮出強(qiáng)的纖維形成誘導(dǎo)能力、肝細(xì)胞增殖抑制能力，因此導(dǎo)致肝纖維俗肝硬化、肝再生不全(肝再生不全)；并且報(bào)道了使用蛋白酶抑制齊柳制TGF-p的活性會,抑制病態(tài)形成(OkunoM等，Gastroenterology2001;120:1784-1800;AkitaK等，Gastroenterology2002;123:352-364)。基于以上認(rèn)識，報(bào)道了使用抗蛋白酶的抗體的治療法(日本特開2003-252792號公報(bào))。接著，將抑制TGF-p的信號傳導(dǎo)的物質(zhì)與抑制TGF-P活化的蛋白酶抑制劑并用，以期肖灘取得協(xié)同的病態(tài)形成抑制效果，篩選TGF-(3信號傳導(dǎo)抑制物質(zhì)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了具有囌唑烷酮環(huán)的cytox氾one，報(bào)告了{(lán)頓cytoxazone的基于抑制TGF-(3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)ffi^各的TGF-P相關(guān)疾病的治療法、預(yù)防法(國際公開WO2005/039570號公報(bào))。另外，測定了在蛋白酶依存TGF-(3活化反應(yīng)的M^呈中纖溶酶、血漿mH太釋放酶所切斷的位點(diǎn)為潛在型TGF"P1好的N末端側(cè)LAP(Latencyassociatedprotein)序列的Lys56和Leu57之間以及Arg58和Leu59之間，成功制備了特異性識別切斷面的抗體，即病態(tài)組織-異構(gòu)懶寺異性活化反應(yīng)識別抗體(國際公開WO2005/023870號公報(bào))。本發(fā)明確認(rèn)含有潛在性TGF-(31針中的纖溶酶、血漿MH太釋放酶的切斷位點(diǎn)Lys56與Leu57以及Arg58和Leu59的包含由Gln52至Pro62的11個(gè)氨基酸的序歹啲合成肽(稱其為QP肽)、將Lys56與Leu57以及Arg58和Leu59全部替換為Ala使其不被蛋白酶切斷的變異肽(稱其為QPA肽)、將Lys56與Leu57以及Arg58和Leu59全部替換為Gln使其不被蛋白酶切斷的變異肽(稱其為QPQ肽)通過競爭性抑制纖溶酶/血漿激肽釋放酶依存TGF-卩活化反應(yīng)，招氐濃度穩(wěn)定抑制活性型TGF-p的生成，抑制肝病的病態(tài)形成，奠定了基于TGF-p活化反應(yīng)的特異性抑制的TGF-卩相關(guān)疾病的治療法、預(yù)防法開發(fā)的基礎(chǔ)。本發(fā)明的肽為含有Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基酸序列、包含11-50個(gè)氨基酸殘基的肽。上式中X1至X4分另鵬立地表示任意的氨基酸殘基可列舉天然型的20種氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬翻安、谷氨醐安、賴氨酸、精氨酸、胱氨酸、藤酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、脯氨酸)。但是Xl-X2-X3-X4標(biāo)Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列。為了使其不易受到TGF-(3活化蛋白酶的活性的影響，皿X1和X3為堿性氨基酸以夕卜的氨基酸殘基。此處，堿性氨基酸表示賴氨酸、精氨酸、組氨酸。本發(fā)明的肽的長度為1150個(gè)氨基,基即沒有特別柳蹄U;雌11~30個(gè)氨基酸殘基；更雌1120個(gè)氨基,基；進(jìn)一步雌1115個(gè)氨基酸殘基;特別imil個(gè)氮基酸殘基。本發(fā)明的肽比11個(gè)氨基酸長時(shí)，向Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氮基,列的N末端側(cè)和/或C末端側(cè)附加氨基,列。作為附力啲氨基,歹何以選擇以下記載的TGFjl、TGF-P2或TGF-P3的畫了下劃線的氨基,歹啲N鄉(xiāng)側(cè)和/或C末端側(cè)的氨基酸序列或其一部分。例如，當(dāng)為TGF-卩1時(shí)，Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基MJ^列的N^側(cè)可以附加G、RG、IRG、息G、E息G、正AIRG、RIEAIRG、KRIEAIRG、RKRIEAIRG、KRKRIEAIRG、VKRKRIEAIRG、LVKRKRIEAIRG、ELVKRKRIEAIRG、MELVKRKRIEAIRG、DMELVKRKRIEAIRG、IDMELVKRKRIEAIRG、TIDMELVKRKRIEAIRG、KTTDMELVKRKR1EAIRG、CKTIDMELVKRKRIEAIRG或TCKTIDMELVKRKRIEAIRG表示的氨基,列。同樣，當(dāng)為TGF-f31時(shí)，Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro表示的氨基1W列的C末端側(cè)可以附加P、PS、PSQ、PSQG、PSQGE、PSQGEV、PSQGEVP、PSQGEVPP、PSQGEVPPG、PSQGEVPPGP、PSQGEWPGPL、PSQGEVPPGPLP、PSQGEVPPGPLPE、PSQGEWPGPLPEA、PSQGEVPPGPLPEAV、PSQGEVPPGPLPEAVL、PSQGEWPGPLPEAVLA、PSQGEVPPGPLPEAVLAL、PSQGEVPPGPLPEAVLALY、PSQGEVPPGPLPEAVLALYN表示的氨基,列。當(dāng)為TGF-卩2或TGF-卩3時(shí)，可以以下記氨基,歹偽基礎(chǔ)，同樣地附加氨基列。TGF-i31(N末端)-TCKTIDMELVKRKRIEAIRO"QILSKLRLASP-PSQGEVPPGPLPEAVLALYN-(C東端)(SEQIDNO.6)TGF-j32(N末端)-TCSTLDMDQFMRKRIEAIR(H3ILSKLKLTSP^EDYPEPEEVPPEVi:SIYNS-(C末端)(SEQIDN0-7)TGF-/33(N末端)-TCTTLDFGHIKKKRVEAIRG~QILSKLRLTSP-PEPTVMTHVPYQVLALYNST-(C末端〉(SEQIDNO.8)對本發(fā)明的肽中的氨基酸殘基的種類沒有特別限制，天然型氨基酸殘基、非天然型氨基酸殘基、或它們的衍生物均可。即氨基酸可以是L氮基酸，也可以是D-氨基酸，還可以是它們的混合物。另夕卜氨基酸辦中類可以是cx-氨基酸、(3-氨基酸、Y-氨基酸、S-氨基酸的任意一種，但作為天然型氨基酸的a-氨基酸。本說明書所述非天然型氨基酸是指構(gòu)成天然型蛋白質(zhì)的20種天然型氨基酸(甘氨酸、L"丙氨酸、L"纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬醐安、L-谷氨醐安、L-賴氨酸、L-精氨酸、L胱氨酸、L-驗(yàn)酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸)以外的全部氨基酸。具體而言，例如可以舉出(1)天然型氨基酸中的原子被其它物質(zhì)置換懼換)糊1=天然型氨基酸；(2)天然型氨基酸的側(cè)鏈的旋光異構(gòu)體(光學(xué)異性體.)；G)天然型氨基酸的偵賺導(dǎo)入取代基的非天然型氨基酸以及(4)將天然型氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行取代，使船K性、反應(yīng)性、帶電狀態(tài)、M的大小、氫結(jié)合能等發(fā)生變化得到的非天然型氨基酸等。本說明書所述氨基酸的"衍生物"是指進(jìn)行了化學(xué)修飾和生物學(xué)修飾等的氨基酸的衍生物。修飾的例子可以舉出例如烷基化、酯化、鹵素化、或氨基化等的官能團(tuán)的導(dǎo)入、氧化、還原、加成或脫離等引起的官能團(tuán)變換、糖化合物(單糖、J、驟糖或多糖)或脂質(zhì)化合物等的導(dǎo)入、磷酸化或生物素化等，但不限于這些。上述的本發(fā)明的肽的形態(tài)可以是游離形態(tài)，也可以以酸加成鹽或堿加成鹽形式提供。作為酸加成鹽，可以舉出例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機(jī)酸鹽；或者對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、酒石,等有機(jī)酸鹽。作為堿加成鹽，可以舉出例如鈉鹽、鉀鹽、藥鹽、鎂鹽等金屬鹽；銨鹽；甲基銨鹽、三乙基銨鹽等有機(jī)銨鹽。有時(shí)也與甘氨酸等氨基酸形成鹽。另外也有在分子內(nèi)形成平衡離子的情況。另外，肽或其鹽有時(shí)作為水合物或蹄(j化物存在?！繼肽具有多個(gè)不對稱碳。對各不對稱碳的立鵬型沒有特殊限制，但氨基酸殘基為L"氨基酸?；谶@些不對稱碳的旋光體(光鞭性體)、非對映異構(gòu)體等立體異構(gòu)體、立體異構(gòu)體的任意混合物、外消旋體等均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的肽可以通ffl^領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法合成。例如可以舉出疊氮法、酰氯法、酸酐法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、羰基咪唑(力少求《夕'y—小)法、氧化還原法等。另外，其合成可以4柳固相合戯和液相合淑去中的任意一種。即可以艦使能構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸與其余部分縮合，生成物有保護(hù)基時(shí)使保護(hù)基脫離來合成目的肽?？s合方法、保護(hù)基的脫離可以使用公知的任意方法(例如可以參照BodanszkyMandM.A.Ondetti,PeptideSynthesis,IntersciencePublishers,NewYork(1966)、SchroederandLuebke,ThePeptide,AcademicPress,NewYork(1965)、泉屋信夫等，肽的合成的基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)，丸善(1975)等)。反應(yīng)后可以組合使用通常的純化法，例如溶劑提取、蒸餾、柱色譜、液相色譜、重結(jié)晶等來純化本發(fā)明的肽。另外本發(fā)明的肽的C末端通常是羧基(畫COOH)或羧酸根(-COO—)，但C末端也可以是醐安(-CONH2)或酯(-COOR)。作為酯中的R，可列舉碳原子數(shù)為1-12的烷基、碳原子數(shù)為3-10的環(huán)烷基、碳原子數(shù)為6-12的芳基、碳原子數(shù)為7-12的芳烷基等。本發(fā)明的肽也包含N末端的氨基被保護(hù)割呆護(hù)的肽或結(jié)^^辦連的糖肽等的復(fù)合肽等。本發(fā)明的肽的其它的制造方法可以是例如禾,編碼本發(fā)明的肽的氨基,列的基因，采用遺傳工程的手法在微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等宿主生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)(肽)的方法。得到的重組肽可以采用}過濾、反相HPLC、離子効奐柱純化等通常的用于純化蛋白質(zhì)或肽的方法^it行純化。本發(fā)明的肽由于顯示TGF-(3產(chǎn)生抑制作用，會,作為TGF-P產(chǎn)生抑制劑使用。另外，本發(fā)明的肽由于顯示TGF-I3產(chǎn)生抑制作用，育,用作治療和/或預(yù)防與TGF-(3相關(guān)的鄉(xiāng)的藥物。例如，育,用作肝再生f腿劑劍干纖維化抑制劑。作為與TGF-p相關(guān)的疾病，可以舉出例如伴隨著組織(肺、肝臟、腎臟、皮膚等)的纖維化的疾病，具體可以舉出例如肺纖維化、肝硬化、腎疾病(腎炎、腎硬化病)、血管再狹窄、動脈硬化癥、牛皮癬、硬皮病、先天性過敏癥(7卜t。一)、瘢痕瘤或關(guān)節(jié)炎等。另外本發(fā)明的肽可以直接或以含有藥物制造領(lǐng)域通常使用的各種固體載體、液體載體、乳化分散劑等的形式作為藥tH頓。具體而言，將本發(fā)明的肽以醫(yī)藥組合物的形態(tài)〗柳時(shí)，其制劑総可以根據(jù)4頓目的或4頓對象適當(dāng)選擇，例如可以舉出片抓丸劑、散劑、溶液劑、龍懸劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、注射劑(溶液劑、？昆懸劑等)等形態(tài)。另外，作為形成片齊'財(cái)使用的載體，可以4頓例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳化轉(zhuǎn)、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸等賦形劑；含有水或醇類的淀粉、明膠、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、甲基纖維素(MC)、羥基丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、磷酸韓、聚乙烯吡咯烷酮等粘合劑；干燥淀粉、瓊月謝、、昆布多糖粉、碳,鈉、碳酸藥、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、淀粉、乳糖等崩解劑；白糖、甘油三硬脂酸酯、可可粉、氫化油糖(水素弒口油糖)的崩解控制劑；季胺堿、十二烷基硫酸鈉、膠#^1犬硅酸等吸附劑；純化滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉、聚乙二醇等潤滑齊(傳。進(jìn)一步地根據(jù)需要可以將片劑制成包有通常的包衣的片劑，例如糖衣片、明膠包衣片、腸溶包衣片^5U1片、多層片。另外將本發(fā)明的肽制成注射劑時(shí)，將溶液劑、乳劑和混懸劑進(jìn)行殺菌，且與血液等張等；形成這些形態(tài)時(shí)，可以使用水、乙醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇(求y才年、乂化W只亍"/KT小:n—/"、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯類等稀釋劑；另外根據(jù)需要，可以配合使用亞硫酸氫鈉、焦亞硫勝內(nèi)等穩(wěn)定抓羧甲基纖維素、藻酸鈉、單硬脂酸鋁等混懸抓氯化鈉、葡萄糖、甘油等等張劑、對羥基苯甲酸酯、苯甲醇、氯丁醇等保存劑，另外還可配合使用溶液輔助劑、緩沖劑、無痛化劑等。上述各形態(tài)的醫(yī)藥組合物中，根據(jù)需要可以進(jìn)一步地配合使用慣用的著色劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑等，另外也可以含有其它藥物有效成分。將本發(fā)明的肽用作藥物時(shí)，4細(xì)時(shí)一般使雜藥物中含有0.001-90重fi0/。，雌0.001-80重1%。本發(fā)明的肽，可以施與包括人類的哺乳動物。給藥途徑可以是經(jīng)口施與也可以是非經(jīng)口施與。本發(fā)明的肽的給藥量應(yīng)當(dāng)根據(jù)患者的年齡、性別、體重、癥狀以及給藥途徑等條件的不同進(jìn)行適宜的增減。一般而言，作為有$;分量，成人一日為lpg/kgl,000mg/kg左右的范圍，優(yōu)選10[ig/kg100mg/kg左右的范圍。，的給藥量可以一日一次施與也可以一日分成數(shù)次施與。另外給藥時(shí)間以及給藥間隔沒有特別柳蹄ij，可以每天給藥也可以間隔數(shù)日給藥。以下ffl51實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限定。實(shí)施例實(shí)施例1:QP肽和QPA，M肝星狀細(xì)胞的活化抑制按照已知的方^(OkunoM等，Gastroenterology2001;120:1784-1800)自雄性Wistar大鼠(體重350400g;JapanClea)的肝臟分離肝星狀細(xì)胞，在每個(gè)3.5cm塑料培養(yǎng)皿中布放lxl()6個(gè)細(xì)胞，在lml含有10%胎牛血清(FCS;GIBCO公司制造)的Dulbecco'sModifiedEagle培養(yǎng)基(DMEM;SIGMA公司律U造)中培養(yǎng)。自分離肝星狀細(xì)胞第一日起，向培養(yǎng)液中添加QP肽(Gln-Ile-Leu-Ser國Lys-Leu-Arg誦Leu-Ala-Ser-Pro)(SEQIDNO.9)、QPA肽(Gln-He國Leu-Ser曙Ala-Ala-Ala畫Leu-Ala-Ser-Pro)(SEQIDNO.IO)以及作為對照的、偏離本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的TGF-卩活化控制區(qū)域(Gly51Arg110)(國際公開WO2005/023870號公報(bào))的預(yù)想對TGF-P活化反應(yīng)沒有影響、并且報(bào)告具有TGF-(3活化能力的不含有絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)蛋白酶(近藤等，日本血栓止血學(xué)會志，2003:14:210-219;Annes等,JCellSci2003;116:217-224)的一般切斷序列的包含11個(gè)氨基酸的潛在型TGF-piLAP序列的合成肽(Thr-Gly-Val-Val-Arg-Gln-Tip-Leu-Ser-Arg-Gly;將其稱為T200肽)(SEQIDNO.11)(參見圖l)，持續(xù)培養(yǎng)7天，在顯微鏡下觀察各月樹通過在塑料培養(yǎng)皿上培養(yǎng)誘發(fā)的肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(也稱為肝星狀細(xì)胞的活化)的影響。各肽配制成60mM儲備7K溶液，溶解于培養(yǎng)基使終濃度為ImMo至分離第3日，在含有10。/。FCS的DMEM培養(yǎng)基中^i，在第4印每培養(yǎng)基換成含有終濃度為lmM的各肽的加入0.P/。牛血清白蛋白(BSA)的DMEM，將進(jìn)一步培養(yǎng)2-4日的培養(yǎng)基作為條件培養(yǎng)基回收，用PROMEGA公司制造的ELISA試劑盒對條件培養(yǎng)基中存在的活性型TGF-pi的量進(jìn)行定量，同時(shí)用顯微鏡(DMIRB;Leica公司制造)觀察細(xì)胞的形態(tài)，并拍攝照片。MM微鏡得到的觀察結(jié)躲于圖2。如圖2所示，QPA肽顯著抑制肝星4魏胞的活化(伴有含有維生素A的油滴的消失的絲變化)。與此相對，QP肽顯示弱的抑制效果，T200肽沒有顯示抑制效果。進(jìn)一步地，劍牛培養(yǎng)基中的活性型TGF-卩生成量的測定結(jié)^^表1。如表1所示，QPA肽顯著地將條件培養(yǎng)基中的活性型TGF-卩量降低至對照的1/55(2%)。與此相對，沒有觀察到顯著的星糊胞活化抑制活性的T200肽將條12件培養(yǎng)基中的活性型TGF-(3量M^、至對照的74%。表1:來自TGF-(3活化蛋白酶切斷序列的月太對伴有肝星狀細(xì)胞活化的活性型TGF-pi生成的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由以上結(jié)果可知，QPA肽抑制纖溶藤血漿激肽釋放酶引起的TGF-p活化反應(yīng)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化。實(shí)施例2:QP肽和QPAftW肝再生不全的改善接著，使用已經(jīng)證明血漿^H太釋放^^存TGF-P活化反應(yīng)為其原因的肝再生不全的動物模型，即內(nèi)毒素(LPS)前施與部分肝切除肝再生不全模型小鼠(Akita等.，Gastroenterology2002;123:352-364)，進(jìn)行評價(jià)QP肽和QPA肽在體內(nèi)的効深的動物實(shí)驗(yàn)。i力驗(yàn)引入26只出生后五周齡的雄性C3H/HeN系小鼠。在檢疫、環(huán)境馴化后按照分組當(dāng)天的體重分組如下。即分成施與鹽7jC(Saline)的鹽7jC施與組(Gl:n=6)、施與LPS的鹽7k施與組(G2:n=6)、施與LPS的QP肽施與組(G3:n=4)、施與LPS的QPA肽施與組(G4:n=4)和施與LPS的T200肽施與組(G5:n=6)的5組(表2)。it驗(yàn)開始后，腹腔內(nèi)施與LPS7嗎(Gl為鹽水)，48小時(shí)后對全部小鼠進(jìn)行肝臟部分切除。再過48小時(shí)后，將生存的供試動物全部剖檢。剖檢時(shí)，在采血后，將各組1-3只在用4%多聚甲醛(PFA)進(jìn)行全身灌流后摘出肝臟，將全葉用包埋齊lfTissueMount"冷凍包埋。另夕卜對于剩余的1-3只，不進(jìn)行全身灌流，一部分用福爾馬林固定，其余采取后作為冷凍試樣(mRNA用和蛋白定量用)。對于進(jìn)行了福爾馬林固定的臟器，制成塊，與冷凍i辦一起在-8(TC的低溫冰箱保存。表2:試驗(yàn)組的構(gòu)成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>i^驗(yàn)材料和方法如下。1.誘發(fā)物質(zhì)1.l誘發(fā)物質(zhì)名稱脂多糖類(Lipopolysaccharides)(LPS;來自Escherichiacoli0111:B4)(SIGMA公司制)保存方法冷藏、遮光、密閉1.2翻U名稱滅菌生理食鹽水(嫁制藥株式會社制)2受試物質(zhì)2.1QP肽名稱TGF-piLAP肽氨基,列N-52QILSKLRLASP62誦C保存方法冷藏2.2QPA肽名稱TGF-卩1LAP肽(N-52QILSKLRLASP62-C的突^l太)氨基,列N-52QILSAAAAASP62國C保存方法冷藏2.3T200肽名稱TGF-P1LAP肽(與活化反應(yīng)無關(guān)的部分的肽)氨基,列N-200TGVVRQWLSRG210-C保存方法冷藏3.供試動物動物種小鼠系統(tǒng)C3H/HeNSlc供給源日本工7工/^一株式會社，靜岡微生物學(xué)品質(zhì)無特定病原(SpecificPathogenFree,SPF)性別雄周齡弓l入時(shí)5周齡(供試時(shí)6周齡)4.動物的飼養(yǎng)管理在將弓l入的動物在新的飼養(yǎng)環(huán)境別l化的同時(shí)，從籠子外面以能夠確認(rèn)的程度每^a見察動物的狀態(tài)，確認(rèn)其一般狀態(tài)(一般狀態(tài))良好。飼養(yǎng)時(shí)間弓1入后5天試驗(yàn)時(shí)間8天5.供試動物的分組5.1實(shí)施時(shí)間動物引入7天后5.2分組方法考慮動物引入5天后的全部動物的體重，4柳分組系統(tǒng)Statlight針l分組(二、;/夕厶7株式會社，東京)按照隨機(jī)分組法進(jìn)行分組。5.3籠子的識別粘貼寫明組名、試驗(yàn)編號、系統(tǒng)名、施與樣品名、有無灌流、個(gè)體編號、引入編號和籠子編號的標(biāo)簽。6.動物的識別分組后，進(jìn)行單飼養(yǎng)(単飼育)。由于可以通過籠子謝Ti只別，故此不再進(jìn)行各個(gè)體的識別。7.誘發(fā)物質(zhì)的施與7.1LPS施與樣品的配制配制頻率1次(用時(shí)配制)配制方法向l只裝入5mgLPS的小瓶(/MT/WfS)中添加少量的鹽水使其溶解。接著轉(zhuǎn)移至其它容器，繼續(xù)添加鹽水至總量為5ml。此為l^nl的溶液。自該溶液準(zhǔn)確量取350^1，將其加入裝入了4.65ml滅菌生理食鹽7JC的容器。隨后用0.22,的濾器滅菌過濾后，作為施與樣品。7.2LPS施與方法施與量7pg/頭施與路徑腹腔內(nèi)施與施與容量0.1mJ/頭施與次數(shù)1次(單次)施與時(shí)間肝部分切除48小時(shí)前對象動物G2G5(G1施與鹽水)8.受試物質(zhì)的施與8.1肽施與樣品的配制配制頻率l次配制方法用鹽7j^t解，使達(dá)到2mg/ml，用作施與樣品。保存方法^ffl前在冰箱(設(shè)定為4")保存。8.2肽的施與方法施與量200pg/頭施與路徑靜脈內(nèi)施與施與容量o.lmV頭施與時(shí)間肝部分切除的50、38、24、14、2小時(shí)前以及10、24、34小時(shí)后施與次數(shù)2W日，4天(原則上9:00和19:00)，計(jì)8次。對象動物G3G5(G1、G2施與鹽;R)9.肝部分切除(2/3partialhepatectomy;PH)9.1處置方法將小鼠進(jìn)行乙醚吸入麻醉，自胸部至腹部剃毛，背位固定后用聚烯吡酮碘消毒手術(shù)部皮膚。切開腹部，自切開口取出肝外側(cè)左葉、內(nèi)側(cè)右葉、內(nèi)側(cè)左葉至體外，用線系住這些肝葉的根部，切除取出至體外的肝臟。擦去血液，用年77—示、，于年7封閉腹部，用聚烯吡酮碘消毒皮膚，處置完成。9.2處置只數(shù)全部26只9.3處置時(shí)間LPS施與48小時(shí)后10.—般狀態(tài)觀察和體重測定10.1—般狀態(tài)觀察試驗(yàn)開始后，每日一次，觀察全部個(gè)體的一般狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)異常時(shí)進(jìn)行詳細(xì)記錄。10.2體重測定it驗(yàn)開始后，每日一次以上測定全部個(gè)體的體重，保存記錄(打印紙)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。11.剖檢11.1剖檢時(shí)間PH48小時(shí)后11.2剖檢方法3M:腹腔內(nèi)施與戊巴比妥鈉40mg/kg將小鼠麻醉后，用未處理注射:tl通過腹部大動脈盡可能采集血液，使其失血致死。采血后，將各組l-3只在用4。/。PFA進(jìn)行全身灌流后摘出肝臟，全葉用包埋劑"TissueMount"冷凍包埋。另外對于其余的1-3只，不進(jìn)行全身灌流，一部分用10%中性緩沖福爾馬#^浸漬固定，其余作為冷凍i辦(mRNA用和蛋白定4il)在液氮中冷凍。11.3血液的處理將血液在采血后1小時(shí)內(nèi)用3,000r.p.m,10併中7賴口(設(shè)定為4。C)離心分離。采集血清至其它容器，冷凍保存(設(shè)定為-8(TC)至提出時(shí)。12.病理組織標(biāo)本的制作制作臟器肝臟制作標(biāo)本石蠟塊制作方法10%中性緩沖福爾馬林液固定后，將肝臟切出，按照常規(guī)方法進(jìn)4亍^7K、石蠟包埋。13.組織切片的制作和染色將包埋的肝組織用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica社)制成厚度為5,的肝組織切片。增殖細(xì)胞核抗原PCNA(proliferating^el1NuclearAntigen;增殖細(xì)胞的標(biāo)記)的染色使用匕7卜77^乂試劑盒(二于1^^一才寸,^>^社)按照已經(jīng)報(bào)道(GreenwellA等，Cancerlett1991;59:251-256)的方法進(jìn)行。即按照試劑^^f附帶的說明書，將除去石蠟的肝組織切片(厚度5叫)按照以下的操作進(jìn)行染色。在95。C水浴中與檸檬酸緩沖液pH6溫育10倂中。-在室溫與3%過氧化氫7]<:溫育20併中。(以下，在加濕室內(nèi)、室溫)-與試劑盒附帶的封閉緩沖液溫育60併中。.與小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(Dako社制)原液溫育10射中(一抗)。，與試劑盒附帶的封閉緩沖液溫育10倂中。與試劑盒附帶的單染色小鼠MAX-PO(M)溫育10併中(二抗)。與二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)混合液(X夕夕一社帝U)溫育4分30秒使其顯色。*，各操作步驟之間分別用PBS洗滌3次。與蘇木精溶液(補(bǔ)一化學(xué)藥品社製)溫育20秒，與四硼M溶液溫育1分鐘，進(jìn)行核的對比染色后用MMQ過濾7K洗凈。用Leica社制DMIRB顯微鏡以200x倍率觀察，拍攝照片，同時(shí)，以n=8對各標(biāo)本的PCNA陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評價(jià)。14.肝組織TGF-pi量的測定按照OkunoM等的方法(OkunoM等,Gastroenterology2001;120:1784-1800)由11.2中為蛋白質(zhì)定量用制備的肝組織約100mg配制肝提取液，用PROMEGA社制的ELISA試劑誠提取液中存在的TGF-pi的量進(jìn)行定量。TGF-P的量以pg/mg蛋白質(zhì)量^^。(一般狀態(tài)的觀察結(jié)果)對于施與LPS的組，施與12小時(shí)后的觀察確認(rèn)自發(fā)運(yùn)動的M^、以放毛。其后隨時(shí)間的推移這些癥狀有所恢復(fù)，至PH處置前完全咴復(fù)。PH處置后，觀察到一部分個(gè)體出5鵬伏、自發(fā)運(yùn)動M^、、術(shù)顯斷氐和鴕背(円背位)的癥狀，也確認(rèn)了死亡例。認(rèn)為這些癥狀是PH處置的影響。(染色結(jié)果)染色結(jié)果如圖3所示。ffl31向小鼠施與QP肽、QPA肽，明顯改善了LPS前施與誘發(fā)的肝再生不全(已經(jīng)證明血漿激肽釋放酶依存性TGF-卩活化反應(yīng)是其原因)。與此相對，T200肽沒有顯示改善效果。(定量結(jié)果)將id^的染色結(jié)果用PCNA陽性肝細(xì)胞百分率進(jìn)行定量，結(jié)果如圖4所示。涯過向小鼠施與QP肽，LPS前施與誘發(fā)的肝再生不全(PCNA陽性細(xì)胞的比率從40%減少至25%，己經(jīng)證明血漿mH太釋放^f^存性TGF-P活化反應(yīng)是其原因，Akita等人，Gastroenterology123:352-364,2002)得到完全改善。進(jìn)一步地，施與QPA肽得到了PCNA陽性細(xì)胞的比率提高至47%的結(jié)果，顯示具有肝再生不全改善效果和肝再生，效果。與此相對，T200肽完全沒有顯示改善效果。(肝組織TGF-f31量定量結(jié)果)肝組織中的TGF-J31生成量的測定結(jié)果如表3所示。通過LPS前施與，肝組織TGF-pi量提高至對照組的值的約6.5倍;QPA肽將其^^至對照組的值的約1.4倍。與此相對，T200肽僅將TGF-pi量M^至對照組的值的約3倍。表3:來源于TGF-(3活化蛋白酶切斷序列的肽對與肝再生不全相伴隨的肝組織TGF-pi生成的抑制M樣品肝TGF41含量(pg/mg蛋白)船K+;PH鹽水LPS+州鹽7jCLPS+PHQPA肽46±4i10±11」*LPS+PHT200肽*P<0.05(總結(jié)考熟以上的結(jié)果顯示，作為TGF-(3活化蛋白酶弓l起的來自潛在型TGF-(31的LAP部分的切斷序列的肽的QP肽和QPA肽，在低濃度抑制作為肝病原因的蛋白酶依存性TGF-P活化反應(yīng)，抑制活性型TGF-P的生成，改善肝再生。就其效果而言，QPA肽比QP肽強(qiáng)。其原因是QPA肽不被蛋白酶戶;t刀斷，可以在更低濃度安全且有效地發(fā)揮阻礙活性。期待QPA肽切斷對照組的內(nèi)源性基礎(chǔ)TGF-P活化反應(yīng)。通逝OT本肽，使在現(xiàn)有技術(shù)中困難的穩(wěn)定地抑制TGF-p活化反應(yīng)成為可能，可期待本B太及其衍生物被開發(fā)為針對以各種硬化性疾病為fW的TGF-P相關(guān)疾病的預(yù)防藥、治療藥。實(shí)施例3QP肽、和QPQ肽對LAP切斷反應(yīng)的阻礙在將重組人LAP(R&D社)2pg(終濃度66pg/ml)與終濃度20pg/ml的血漿mi太釋放酶(SIGMA社制)溫育時(shí)，添加終濃度為2.5mg/ml的QP肽、QPA肽、T200肽、QPQ肽(SEQIDNO.4)，在37。C溫育40併中后，通過采用13.5%聚丙烯翻安IH交的電泳(室溫，27mA，50併中)，分離LAP(^量41kDa)和LAP分解產(chǎn)物(分子量38kDa)以及作為添加劑{頓的BSA(終濃度0.3mg/ml，好量80kDa)。將用半干轉(zhuǎn)印裝置分離的各蛋白質(zhì)、懶軍產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜，按照秋田等人的方法(Gastroenterology123;352-364,2002)，與終濃度為5pg/ml的抗LAP小鼠單克隆抗^(R&D社)或終濃度為20^ml的抗L59切斷面識別小鼠單克隆抗體(自帝U，國際公開WO2005/023870號公報(bào))在室溫溫育60併中后，與終濃度為lpg/ml的辣根過氧化物酶結(jié)合山羊抗小鼠二次抗體(JacksonImmunoResearchLaboratories社)在室溫反應(yīng)60併中，用ECLplus試劑(GEHealthcare社)使其顯色，對各肽對LAP帶的減弱以及LAP分解產(chǎn)物生成的影響進(jìn)行半定量(圖6)。結(jié)果顯示，QP肽明顯抑制LAP的切斷反應(yīng)(板A出現(xiàn)的LAP帶的減弱以及板B出現(xiàn)的LAP分解產(chǎn)物生成)(第3泳道)；與QP肽相比，QPQ肽更強(qiáng)地阻礙LAP的切斷反應(yīng)(第6泳道)；與此相對，QPA肽禾口T200肽顯示弱的阻礙效果(第4泳道；第5泳道)。實(shí)施例4按照實(shí)施例1記載的方法，觀察QP肽、QPA肽、QPQ肽禾口T200肽對通過在塑料培養(yǎng)皿上培養(yǎng)誘發(fā)的培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的影響。將各肽溶解于培養(yǎng)基，使終濃度為0.5mM(約500^ig/ml)。至分離第1日，在含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中處理，在第2日，將培養(yǎng)SI奐成含有終濃度為0.5mM的各肽的加入0.iy。BSA的DMEM，將進(jìn)一步培養(yǎng)2-7日的培養(yǎng)基作為斜牛培養(yǎng)基回收，用PROMEGA公司制造的ELISA試劑盒對^f牛培養(yǎng)基20中存在的活性型TGF-(31的量進(jìn)行定量，同時(shí)用顯微鏡(DMIRB;Leica公司)觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍攝照片。Mii顯微鏡得到的觀察結(jié)果示于圖7。如圖7所示，QP肽、QPA肽、QPQ肽顯著抑制肝星狀細(xì)胞的活化(伴有含有維生素A的油滴的消失的形^^變化)。特別是QPQ肽顯示出最強(qiáng)的抑制^媒。與此相沐T200肽沒有顯示抑制交媒。此時(shí)的條件培養(yǎng)基中的活性型TGF-P生成量的測定結(jié)果示于圖8。如圖8所示，QP肽、QPA肽、QPQ肽分別抑制對照組細(xì)胞斜牛培養(yǎng)基中的活性型TGF-卩生成的55%、25%和90%。由以上結(jié)果可知，QPQ肽比QPA肽更強(qiáng)地抑制纖溶,血漿激肽釋放酶引起的TGF-卩活化反應(yīng)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化。實(shí)施例5:QP肽、以及QPA肽、QPQ月M肝再生不全的改善以下，按照實(shí)施例2記載的方法，使用LPS前施與部分肝切除肝再生不全模型小鼠，進(jìn)行評價(jià)QP肽、以及QPA肽、QPQ肽、T200肽在體內(nèi)對肝再生不全模型的^媒的動物實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)引入26只出生后五周齡的雄性C3H/HeN系小鼠。在檢疫、環(huán)境馴化后按照分組當(dāng)天的體重如表4分組。即分成施與鹽水的鹽7jC施與組(Gl:n=8)、施與LPS的鹽7jC施與組(G2:n=8)、施與LPS的QP肽施與組(G3:n=8)、施與LPS的QPA肽施與組(G4:n=8)、施與LPS的QPQ肽施與組(G5:n=8)和施與LPS的T200肽施與組(G6:n=8)的6組。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>it驗(yàn)開始后，腹腔內(nèi)施與LPS7pg(Gl為鹽水)，48小時(shí)后對全部小鼠進(jìn)行肝臟部分切除。再過48小時(shí)后，將生存的供試動物全部音啦。剖檢時(shí)，在采血后，將各組4只在用4。/。PFA進(jìn)行全身灌流后摘出肝臟，全葉用包埋劑"TissueMount"冷凍包埋。另夕卜對于剩余的4只，不進(jìn)行全身灌流，一部分用福爾馬林固定，其余采取后作為冷凍試樣(mRNA用和蛋白定量用)。對于進(jìn)行了福爾馬林固定的臟器，制成塊，與冷凍i辦一起在-8(TC的低溫冰箱保存。受試物質(zhì)QPQ肽名稱TGF-(31肽氨基,列N-52QILSQQQQASP62-C保存方法7令藏LPS施與方法施與量7pg/頭施與路徑腹腔內(nèi)施與施與容量O.lmJ/頭施與次數(shù)1次(單次)施與時(shí)間肝部分切除的48小時(shí)前對象動物G2G6(G1施與鹽水)受試物質(zhì)的施與肽施與樣品的配制配制頻率l次配制方法用鹽ZK^I軍，j吏其為2mg/ml，用作施與樣品。保存方法4OT前在冰箱(保存于4。C)。肽的施與方法施與量200pg/頭施與路徑靜脈內(nèi)施與施與容量0Jml/頭施與時(shí)期肝部分切除的50、38、24、14、2小時(shí)前以及10、24、34小時(shí)后施與次數(shù)2欲日，4天(原則上9:00和19:00)，計(jì)8次。對象動物G2G6(G1、G2施與鹽7夂)肝部分切除(2/3partialhepatectomy;PH)處置方法將小鼠進(jìn)行乙醚吸入麻醉，自胸部至腹部剃毛，背位固定后將用聚烯吡酮碘消毒手術(shù)部皮膚。切開腹部，自切開口取出肝外側(cè)左葉、內(nèi)側(cè)右葉、內(nèi)側(cè)左葉至體外，用線系住這些肝葉的根部，切除放置至體外的肝臟。擦去血液，用年77—求、乂于年7封閉腹部，用聚烯吡酮碘消毒艦，手術(shù)完成。處置只數(shù)全部48只23處置時(shí)間LPS施與48小時(shí)后剖檢時(shí)間PH48小時(shí)后剖檢方法M;腹腔內(nèi)施與戊巴比妥鈉40mg/kg將小鼠麻醉后，用未注射器通過腹部大動脈盡可麟集血液，使其失血致死。采血后，將各組4例在用4%PFA進(jìn)行全身灌流后摘出肝臟，全葉用包埋齊J"TissueMount"冷凍包埋。對于其余的4例，不進(jìn)行全身灌流，一部分用10%福爾馬林液浸漬固定，其余作為凍結(jié)試樣(mRNA用和蛋白定量用)在液氮中冷凍。肝組織TGF-卩1量的測定按照Okuno等人的方法(OkunoM等,Gastroenterology2001;120:1784-1800)將11.2中為蛋白質(zhì)定量用制備的肝組織約30mg配制成肝提取液，用PROMEGA社制的ELISA試齊U盒對提取液中存在的TGF-卩1的量進(jìn)行定量。TGF-卩量以pg/mg蛋白質(zhì)量表示。其它同實(shí)施例2。(一般狀態(tài)的觀察結(jié)果)對于施與LPS的組，施與12小時(shí)后的觀察確認(rèn)自發(fā)運(yùn)動的M^、和立毛。(染色結(jié)果)染色結(jié)果如圖9所示。M31向小鼠施與QP肽、QPA肽、QPQ肽，明顯改善LPS前施與誘發(fā)的(已經(jīng)證明血漿mi太釋放^^存性TGF-(3活化反應(yīng)是其原因；Akita等.，Gastroenterology;123:352-364，2002)肝再生不全。QPQ肽、QPA肽、QP肽的改善交媒大體相同。與此相對，T200肽沒有改善^媒。(定量結(jié)果)將戰(zhàn)染色結(jié)果用PCNA陽性肝細(xì)胞百分率進(jìn)行定量，結(jié)果如圖10所示。ffi5i向小鼠施與QP肽、QPA肽、QPQ肽，改善了LPS前施與誘發(fā)的肝再生不全(PCNA的比率從55%減少至47%;已經(jīng)證明血漿ll^太釋放酶依存性TGF-(3活化反應(yīng)是其原因；Akita等人，Gastroenterology123:352-364,2002)。進(jìn)一步地，ffiil施與QP肽、QPA肽、QPQ肽，PCNA陽性的比率分別提高至66%、70%、64%，顯示具有肝再生不全效果和肝再生鵬$娥。與此相沐T200肽完全沒有改善效果(45%)。(肝組織TGF-(31量定量結(jié)果)肝組織中的TGF-(31生成量的觀啶結(jié)果如圖11所示。LPSIW與導(dǎo)致的肝組織TGF-(31量提高至約2.3倍；QP肽、QPA肽、QPQ肽分別將這種上升抑制至1.6倍、0.7倍、1.6倍。與此相沐T200肽沒有抑制^T媒，甚至使其上升(3.1倍)。(總結(jié)考熟以上的結(jié)果顯示，作為TGF-p活化蛋白酶引起的潛在型TGF-pi的LAP部分的切斷序列來源的QP肽、QPA肽和QPQ肽，在低濃度抑制作為肝病原因的蛋白斷衣存性TGF-(3活化反應(yīng)，抑制活化TGF-P的生成，改善肝再生。在體外，QP肽形成酶基質(zhì)復(fù)合物的育g力強(qiáng)，，軍后消失，因此在細(xì)胞培養(yǎng)系、動物禾難顯示輕微的阻礙活性。與此相對，由于QPA肽形成麟質(zhì)復(fù)合物的能力比QP肽弱，且生成的^^質(zhì)復(fù)合物不會被切斷，穩(wěn)定存在，因此在細(xì)胞培養(yǎng)系、動物模型中與QP肽相比，顯示顯著的阻礙作用。在體外，蛋白酶序列非特異性地被T200肽捕獲，因此顯示弱結(jié)合活性。另外由于在細(xì)胞培養(yǎng)系、動物模型中與T200肽相比，QPA肽形成^^質(zhì)復(fù)合物的能力高，所以與T200肽相比，QPA肽更加具有阻礙玄媒。QPQ肽由于維持高的KS質(zhì)復(fù)合物形成能力，同時(shí)不會被切斷，在體外、細(xì)胞培養(yǎng)系、動物模型等任意的評價(jià)體系中顯示最強(qiáng)的阻礙活性。即QPQ肽比QP肽、QPA肽更能穩(wěn)定地抑制與病態(tài)形成相伴的TGF-(3活化反應(yīng)，可期待本肽及其衍生物被開發(fā)為針對以各種硬化性疾病為代表的TGF-(3相關(guān)疾病的預(yù)防藥、治療法。序列表〈110〉Riken<120〉TGF-/3活化反應(yīng)阻礙物質(zhì)〈130〉FA8105A〈160〉11<210>1〈211〉11〈212〉PRT〈213〉人工的(Artificial)〈220〉<223>合成肽(Syntheticp印tide)<220〉<221〉misc—feature〈222〉(5)..(8)〈223〉Xaa可以是任意氨基酸<400〉1GinlieLeuSerXaaXaaXaaXaaAlaSerPro1510〈210〉2<211〉11<212〉PRT〈213〉人工的〈220〉<223〉合成肽〈400〉2GinlieLeuSerAlaAlaAlaAlaAlaSerPro1510〈210〉3〈211〉11〈212〉PRT<213〉人工的〈220〉<223〉合成肽〈400〉3GinlieLeuSerAlaLeuAlaLeuAlaSerPro151026〈210〉4<211〉11<212>PRT<213〉人工的<220〉<223〉合成肽〈400〉4GinlieLeuSerGinGinGinGinAlaSerPro1510<210〉5〈211〉11<212〉PRT<213〉人工的〈220〉〈223〉合成肽〈400〉5GinlieLeuSerGinLeuGinLeuAlaSerPro1510<210>6〈211〉51〈212〉PRT〈213〉人(H麗n)<400〉6ThrCysLysThrlieAspMetGluLeuValLysArgLysArglieGlu151015AlalieArgGlyGinlieLeuSerLysLeuArgLeuAlaSerProPro202530SerGinGlyGluValProProGlyProLeuProGluAlaValLeuAla354045LeuTyrAsn50<210〉7〈211〉51<212〉PRT<213〉人<400〉7ThrCysSerThr1AlalieArgGly20GluAspTyrPro35TyrAsnSer50〈210〉8〈211〉51<212〉PRT〈213〉人<400>8ThrCysThrThr1AlalieArgGly20GluProThrVal35AsnSerThr50〈210〉9<211〉11〈212〉PRT〈213〉人工的〈220〉<223>合成肽〈400〉9GinlieLeuSer1〈210〉10<211〉11〈212〉PRT〈213〉人工的<220〉〈223〉合成肽LeuAspMetAspGin5GinlieLeuSerLys25GluProGluGluVal40PheMetArgLys10LeuLysLeuThrProProGluVal45ArgSer30lielieGlu15ProProSerlieLeuAspPheGlyHis5GinlieLeuSerLys25MetThrHisValPro40lieLysLysLys10LeuArgLeuThrTyrGinValLeu45ArgSer30AlaValGlu15ProProLeuTyrLysLeuArgLeuAlaSerPro510<400〉10GinlieLeuSerAlaAlaAlaLeuAlaSerPro1510〈210〉11〈211〉11〈212〉PRT<213>人工的〈220>〈223〉合成肽〈400〉11ThrGlyValValArgGinTrpLeuSerArgGly1510權(quán)利要求1.包含11～50個(gè)氨基酸殘基的肽，該肽含有Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分別獨(dú)立地表示任意的氨基酸殘基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列)表示的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1所述的肽，其中XI和X3為堿性氨基酸以外的氨基酸殘基。3.包含ll50個(gè)氨基^gl基的肽，其含有下記(1)(4)中的任意的氨基,列，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽，其長度為1120個(gè)氨基酸殘基。5.肽，其包含Gln-Ile-Leu-Ser-Xl-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分別獨(dú)立地表示任意的氨基li^基，Xl-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列)表示的氨基酸序列。6.活鵬TGF-卩生成抑制劑，其含有權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的肽。7.用于治療和/或預(yù)防與TGF-P相關(guān)的病態(tài)的藥物，其含有禾又利要求15中任一項(xiàng)所述的肽。8.肝再生teia劑劍干纖維化抑制劑，其含有權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的全文摘要本發(fā)明的目的在于提供可阻礙TGF-β活化反應(yīng)的物質(zhì)，特別是提供可阻礙TGF-β活化反應(yīng)的肽。通過本發(fā)明，提供包含11～50個(gè)氨基酸殘基的肽，該肽含有Gln-Ile-Leu-Ser-X1-X2-X3-X4-Ala-Ser-Pro(式中X1至X4分別獨(dú)立地表示任意的氨基酸殘基，X1-X2-X3-X4表示Lys-Leu-Arg-Leu以外的、且不被蛋白酶切斷的序列)表示的氨基酸序列。文檔編號C07K14/00GK101525373SQ20081010039公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日發(fā)明者寺岡龍?zhí)?小島聰一申請人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所