一種凍干保護(hù)劑及乳膠偶聯(lián)抗體的凍干方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種凍干保護(hù)劑及乳膠偶聯(lián)抗體的凍干方 法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體(antibody, Ab)是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，是B細(xì)胞接受抗原刺激后增 殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白。除已廣泛應(yīng)用于體外診斷外，抗體越來(lái)越多地應(yīng)用于各 種疾病的體內(nèi)診斷和治療。目前，利用抗體對(duì)疾病進(jìn)行診斷主要是通過(guò)對(duì)標(biāo)志物的檢測(cè)來(lái) 完成。標(biāo)志物的檢測(cè)方法主要有免疫熒光法、免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫滲濾法 等。將抗體與乳膠微球或乳膠顆粒進(jìn)行偶聯(lián)后，微量的抗原便可以使抗體包被的微球產(chǎn)生 明顯的聚集，故而，乳膠標(biāo)記的抗體在免疫診斷學(xué)方面，特別是在疾病標(biāo)志物的免疫比濁檢 查中，有著非常廣泛的應(yīng)用。
[0003] 為了保證抗體在長(zhǎng)期的保存或者運(yùn)輸過(guò)程中活性的穩(wěn)定，通常將其進(jìn)行凍干處 理。但是，由于檢測(cè)所需的抗體為具有活性的物質(zhì)，其自身的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，與抗原反應(yīng)的 機(jī)制也十分復(fù)雜，環(huán)境的微小變化、溫濕度的變化等均可能引起抗體活性改變，進(jìn)而影響檢 測(cè)結(jié)果。并且，在將抗體與乳膠顆粒或乳膠微球進(jìn)行偶聯(lián)后，凍干過(guò)程更是需要額外額外考 慮乳膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，確保產(chǎn)品復(fù)溶后乳膠微球能夠分散均勻而非聚集在一起，避免試劑 檢測(cè)空白值偏高。
[0004] 目前，由于存在復(fù)溶后聚集狀態(tài)不佳等問(wèn)題，冷凍干燥技術(shù)極少應(yīng)用于修飾乳膠 的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種凍干保護(hù)劑及乳膠偶聯(lián)抗體的 凍干方法。本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑能夠保護(hù)乳膠偶聯(lián)的抗體在復(fù)溶后不會(huì)發(fā)生非特異聚 集、且抗體效價(jià)維持穩(wěn)定。
[0006] 本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑包括BSA、PEG和PVP;其中，BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為（2 ~4):(0.05~0.07):(2.6~5)。
[0007] 在一些實(shí)施例中，BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為2:0.07:3.4。
[0008] 在一些實(shí)施例中，BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為3.2:0.06:2.6。
[0009] 在一些實(shí)施例中，BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為4:0.05:5。
[0010] 在一些實(shí)施例中，其中還包括糖類;糖類、BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為（2.6~2.7): (2~4):(0.05~0.07):(2.6~5)。
[0011] 在一些實(shí)施例中，糖類、BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為2.7:2:0.07:3.4。
[0012] 在一些實(shí)施例中，糖類、BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為2.7:3.2:0.06:2.6。
[0013] 在一些實(shí)施例中，糖類、BSA、PEG和PVP的質(zhì)量比為2.6:3.2:0.06:2.6。
[0014] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，糖類為蔗糖或海藻糖。
[0015] 凍干保護(hù)劑能夠防止生物制品在冷凍干燥和貯藏的過(guò)程中活性組分發(fā)生變性。本 發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑中包括BSA、PEG和PVP。其中，BSA為牛血清白蛋白（bovine serum albumin)，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.430kDa，等電點(diǎn)為4.7 ASA能夠減輕不利的 環(huán)境因素或化學(xué)因素導(dǎo)致的活性組分的變性。PEG為聚乙二醇(polyethylene glycol)，對(duì) 生物活性物質(zhì)的活性具有保護(hù)作用。在本發(fā)明中，PEG的數(shù)均分子量為5500~?δΟΟ?νΡ為聚 乙稀吡略燒酮(Polyvinyl pyrrolidone)，在醫(yī)藥工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，能夠作為藥物的 低溫保存劑使用。本發(fā)明中，PVP為PVP40,其平均分子量為40000。
[0016] 本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑中還可以包括一些糖類。糖類物質(zhì)是生物制品冷凍干燥 過(guò)程中使用最頻繁的凍干保護(hù)劑，本發(fā)明的凍干保護(hù)劑中添加蔗糖或海藻糖能夠維持生物 活性物質(zhì)的生物活性。
[0017] 本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑針對(duì)乳膠偶聯(lián)抗體設(shè)計(jì)，能夠保護(hù)乳膠偶聯(lián)抗體在冷凍 干燥的過(guò)程中，抗體的活性不被破壞。且凍干后復(fù)溶的過(guò)程中不會(huì)發(fā)生非特異性聚集，抗體 的效價(jià)在復(fù)溶后也保持穩(wěn)定。重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，偏差皆不顯著(相對(duì)偏差小于±10%)，說(shuō)明本 發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑具有良好的凍干保護(hù)效果。
[0018] 本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑在制備乳膠偶聯(lián)抗體凍干制劑中的應(yīng)用。
[0019] 在本發(fā)明中，乳膠偶聯(lián)抗體中，乳膠為聚苯乙烯乳膠;抗體為C反應(yīng)蛋白抗體、類風(fēng) 濕因子抗體、抗鏈球菌溶血素〇抗體、胱抑素 C抗體、D-二聚體抗體、糖化血紅蛋白抗體或β2 微球蛋白抗體。
[0020] 乳膠偶聯(lián)抗體是將抗體與乳膠微球或乳膠顆粒進(jìn)行偶聯(lián)后的產(chǎn)物，本發(fā)明中，乳 膠偶聯(lián)抗體中的抗體可為單克隆抗體，也可為多克隆抗體。其獲得方式可為自制也可于市 場(chǎng)購(gòu)得?？贵w與乳膠偶聯(lián)的步驟可為自行制備，也可通過(guò)商業(yè)途徑獲得，本發(fā)明對(duì)此不作限 定，本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑皆可對(duì)其產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗 體為C-反應(yīng)蛋白乳膠偶聯(lián)抗體。C-反應(yīng)蛋白抗體為兔抗人C-反應(yīng)蛋白抗體。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種乳膠偶聯(lián)抗體的凍干方法，將乳膠偶聯(lián)抗體與本發(fā)明提供的 凍干保護(hù)劑混合后凍干;凍干的程序?yàn)椋?預(yù)凍段 -38°C~-42°C 2h40mm~3hl0min; 預(yù)凍段 -18'C~-22°C 3M.5h; 預(yù)凍段 -3 8 ''C ~-42 °C 3.5h ~4h:
[0022] 第一干燥階段 -38°C~-42°C 13h~I3.5h; 第二干燥階段 -21：~2 uC 1.5h~2h; 第二干燥階段 23°C~27°C 2.5h~3h。
[0023]在一些實(shí)施例中，凍干的程序?yàn)椋?預(yù)凍段 -3 8 °C 3hlOmin; 預(yù)凍段 ~22V 3h; 預(yù)凍段 .-38°C 4h;
[0024] 第一千燥階段 -42 € I3h; 第二千燥階段 -2°C 2h; 第二千燥階段 27 V 2.5h〇
[0025] 在一些實(shí)施例中，凍干的程序?yàn)椋?預(yù)凍段 -42 °C 2M0min; 預(yù)凍段 -18'C 3.5h; 預(yù)凍段 -42°C 3.5h;
[0026] 第一干燥階段 -3 8 °C 13.511； 第二干燥階段 21： 2h, 第二干燥階段 23 Γ 3h。
[0027] 在一些實(shí)施例中，凍干的程序?yàn)椋?br>[0028] 預(yù)凍段 -40C 2h40miii； 預(yù)凍段 -20°C _ 預(yù)凍段 -40°C 3.5h;
[0029] 第一千燥階段 -40 °C 13h; 第二千燥階段 （TC 1.5h; 第二千燥階段 25 °C 2.5h。
[0030] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑混合的質(zhì)量比為I: (45~65)。
[0031] 在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑混合的質(zhì)量比為1:61.3。
[0032] 在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑混合的質(zhì)量比為1:64.2。
[0033] 在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑混合的質(zhì)量比為1:63.5。
[0034]在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑混合的質(zhì)量比為1:45.3。
[0035] 本發(fā)明中，將乳膠偶聯(lián)抗體的溶液與凍干保護(hù)劑溶液混合后，形成待凍干溶液，再 進(jìn)行冷凍干燥。其中，乳膠偶聯(lián)抗體的溶液中乳膠偶聯(lián)抗體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2% ;凍干保護(hù) 劑溶液中凍干保護(hù)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.17 %~9.05%。乳膠偶聯(lián)抗體溶液與凍干保護(hù)劑溶液 混合的體積比為I: (1~1.5)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，待凍干溶液的體積為120yL。
[0036] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體與凍干保護(hù)劑溶解于水中；其中，乳膠偶聯(lián)抗 體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 1 %~〇. 08%，凍干保護(hù)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%~4.6%。
[0037] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體中，乳膠為聚苯乙烯乳膠;抗體為C反應(yīng)蛋白 抗體、類風(fēng)濕因子抗體、抗鏈球菌溶血素〇抗體、胱抑素 C抗體、D-二聚體抗體、糖化血紅蛋白 抗體或K微球蛋白抗體。
[0038] 在一些實(shí)施例中，乳膠偶聯(lián)抗體為C-反應(yīng)蛋白乳膠偶聯(lián)抗體。C-反應(yīng)蛋白抗體為 兔抗人C-反應(yīng)蛋白抗體。
[0039] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，凍干為真空冷凍干燥。
[0040] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，真空冷凍干燥的干燥倉(cāng)真空值為1~5Pa。物料最高溫度為8 ~10°C。起始板溫為18~25°C。
[0041] 以本發(fā)明提供凍干保護(hù)劑和方法，冷凍干燥得到的凍干制劑能夠用于樣品中目標(biāo) 物質(zhì)的檢測(cè)。所述樣品為全血、血清、血漿或尿液。所述目標(biāo)物質(zhì)為C反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子、 抗鏈球菌溶血素〇、胱抑素 C、D_二聚體、糖化血紅蛋白含量或β2微球蛋白。所述檢測(cè)的方法 為免疫比池法。
[0042]本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑中包括BSA、PEG和PVP。本發(fā)明提供的凍干保護(hù)劑針對(duì)乳 膠偶聯(lián)抗體設(shè)計(jì)，結(jié)合本發(fā)明提供的凍干方法，能夠保護(hù)乳膠偶聯(lián)抗體在冷凍干燥的過(guò)程 中，抗體的活性不被破壞。且凍干后復(fù)溶的過(guò)程中不會(huì)發(fā)生非特異性聚集，抗體的效價(jià)在復(fù) 溶后也保持穩(wěn)定。重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，偏差皆不顯著(相對(duì)偏差小于±10%)，說(shuō)明本發(fā)明提供的 凍干保護(hù)劑具有良好的凍干保護(hù)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明提供了一種凍干保護(hù)劑及乳膠偶聯(lián)抗體的凍干方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝