活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法，所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：明膠1～10％，蔗糖2～10％，Trolox0.01～0.2％，精氨酸0.1～2％，聚乙烯吡咯烷酮0.5～8％，余量為注射用水。與常規(guī)的保護(hù)劑相比，本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑更能有效地保護(hù)豬乙型腦炎疫苗中病毒活力，37℃條件下耐熱超過20天，2～8℃能保存2年以上，降低了疫苗對溫度保存條件的要求，方便疫苗貯藏和冷鏈運(yùn)輸。而且，本發(fā)明提升了疫苗的免疫效果，免疫豬體的抗體產(chǎn)生更快，持續(xù)時間更長。本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法簡單，適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備 方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 病毒等生物活性物質(zhì)及其相關(guān)制品的熱敏感性一直是活疫苗長期保存的瓶頸。我 國幅員遼闊，經(jīng)濟(jì)水平差異較大，運(yùn)輸、使用過程中疫苗短期暴露高溫環(huán)境（甚至45°C以 上）的現(xiàn)象依然存在，所以對活疫苗的耐熱性能提出了更高的要求。
[0003] 耐熱凍干保護(hù)劑考慮了活疫苗在較高溫度和較長保存時間的情況下，凍干物質(zhì)可 能產(chǎn)生的物理和化學(xué)變化對活疫苗存活的影響。目前，國內(nèi)已有部分生物制品在2?8°C條 件保存，具有一定的耐熱能力，但還有相當(dāng)一部分生物制品仍處于低溫狀態(tài)保存，尚未開發(fā) 到2?8°C條件保存。
[0004] 早在20世紀(jì)80年代發(fā)達(dá)國家就已開始進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的研究，目前他們的凍干 活疫苗基本上使用耐熱保護(hù)劑，而且保護(hù)劑的研究和應(yīng)用屬于專利資料，各國都處于保密 狀態(tài)。國內(nèi)獸用生物制品耐熱保護(hù)劑的研究起步較晚，近年來關(guān)于這方面的研究報道主要 包括雞新城疫、雞傳染性法氏囊、雞馬立克氏病、雞傳染性支氣管炎、雞痘和豬瘟凍干活疫 苗的耐熱保護(hù)劑研究，但尚未見豬乙型腦炎活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的相關(guān)報道。
[0005] 另外，豬乙型腦炎活疫苗免疫機(jī)體后主要以細(xì)胞免疫為主，所以在進(jìn)行抗體監(jiān)測 時，抗體上升的晚并持續(xù)的時間短，經(jīng)常會有免疫豬乙型腦炎活疫苗不久后暴發(fā)乙型腦炎 病的情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和 應(yīng)用，以降低疫苗對溫度保存條件的要求，同時提高和延長免疫動物的抗體水平。
[0007] 基于上述目的，本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由明膠、蔗糖、Trolox、精 氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和注射用水組成。
[0008] 可選地，所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0009] 明膠1?10%，鹿糖2?10%, TroloxO. 01?0· 2%，精氨酸0· 1?2%，聚乙烯 吡咯烷酮〇. 5?8%，余量為注射用水。
[0010] 優(yōu)選地，所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0011] 明膠4?7%，鹿糖4?6%，TroloxO. 05?0· 15%，精氨酸0· 5?1. 5%，聚乙烯 吡咯烷酮1?2%，余量為注射用水。
[0012] 本發(fā)明還提供制備上述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的方法，所述制備方法是：
[0013] 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后將溶液滅菌；
[0014] 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后將溶液過濾除菌；
[0015] 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液混合，即得到所述活疫苗的耐熱凍 干保護(hù)劑。
[0016] 較佳地，所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法是：
[0017] 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后于110?130°c條件下 將溶液滅菌10?40分鐘；
[0018] 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后采用0· 2?0· 25μηι濾膜將溶液過濾 除囷；
[0019] 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液的溫度分別恢復(fù)到20?30°C后， 再混合均勻，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0020] 本發(fā)明還提供上述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，所述活疫苗 為豬乙型腦炎活疫苗。
[0021] 較佳地，所述應(yīng)用包括：
[0022] 將所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑與豬乙型腦炎活疫苗病毒液按照體積比0. 5? 2:1?2混合；
[0023] 將混合溶液的pH值調(diào)至7. 5?7. 8后進(jìn)行冷凍干燥，即得到豬乙型腦炎耐熱凍干 保護(hù)劑活疫苗。
[0024] 優(yōu)選地，所述冷凍干燥的步驟包括：
[0025] 1)將活疫苗在常壓、溫度為_30°C以下的條件下保持1?3小時；
[0026] 2)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-20?-15°C條件下保持20?40分鐘；
[0027] 3)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-10?_5°C條件下保持10?15小時；
[0028] 4)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-2?2°C條件下保持1?3小時；
[0029] 5)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為8?12°C條件下保溫1?3小時；
[0030] 6)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為25?30°C條件下保溫8?12小時；
[0031] 在步驟2)?步驟6)的凍干過程中，冷凝器溫度保持在-50?-70°C。
[0032] 較佳地，所述豬乙型腦炎病毒效價彡107 5TCID5Q/mL。
[0033] 較佳地，先將所述耐熱凍干保護(hù)劑和豬乙型腦炎病毒液的溫度分別恢復(fù)到15? 20°C，再混合均勻。
[0034] 從上面所述可以看出，與現(xiàn)有凍干技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：與常規(guī)的 保護(hù)劑相比，本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑更能有效地保護(hù)豬乙型腦炎疫苗中病 毒活力，37°C條件下耐熱超過20天，2?8°C能保存2年以上，降低了疫苗對溫度保存條件 的要求，方便疫苗貯藏和冷鏈運(yùn)輸。而且，本發(fā)明提升了疫苗的免疫效果，免疫豬體的抗體 產(chǎn)生更快，持續(xù)時間更長。本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法簡單，適應(yīng)規(guī) ?；a(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā) 明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0038] 明膠 4%，
[0039] 蔗糖 6%，
[0040] Trolox 0. 05%,
[0041] 精氨酸 1.5%，
[0042] 聚乙烯吡咯烷酮 1 %，
[0043] 余量為注射用水。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0046] 明膠 5%，
[0047] 蔗糖 5%，
[0048] Trolox 0. 1 %,
[0049] 精氨酸 1.0%,
[0050] 聚乙烯吡咯烷酮 2%，
[0051] 余量為注射用水。
[0052] 實(shí)施例3
[0053] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0054] 明膠 ?%,
[0055] 蔗糖 4%，
[0056] Trolox 0. 15%,
[0057] 精氨酸 0.5%,
[0058] 聚乙烯吡咯烷酮 1.5%,
[0059] 余量為注射用水。
[0060] 實(shí)施例4
[0061] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0062] 明膠 ?%,
[0063] 蔗糖 4%，
[0064] Trolox 0. 15%,
[0065] 精氨酸 0.5%,
[0066] 聚乙烯吡咯烷酮 2%，
[0067] 余量為注射用水。
[0068] 實(shí)施例5
[0069] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0070] 明膠 10%，
[0071] 蔗糖 8%，
[0072] Trolox 0. 1 %,
[0073] 精氨酸 0.8%,
[0074] 聚乙烯吡咯烷酮 2.2%,
[0075] 余量為注射用水。
[0076] 實(shí)施例6
[0077] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0078] 明膠 5.5%，
[0079] 蔗糖 8%，
[0080] Trolox 0. 09%,
[0081] 精氨酸 0.68%，
[0082] 聚乙烯吡咯烷酮 1.8%，
[0083] 余量為注射用水。
[0084] 實(shí)施例7
[0085] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成：
[0086] 明膠 4%，
[0087] 蔗糖 6%，
[0088] Trolox 0. 05%,
[0089] 精氨酸 1.5%,
[0090] 聚乙烯吡咯烷酮 1 %，
[0091] 余量為注射用水。
[0092] 實(shí)施例8
[0093] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法可以包括以下步驟：
[0094] 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后于115°C條件下將溶液 滅菌20分鐘；
[0095] 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后采用0. 22 μ m濾膜將溶液過濾除菌；
[0096] 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液的溫度分別恢復(fù)到20°C后，再將兩 者溶液混合均勻，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0097] 實(shí)施例9
[0098] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法可以包括以下步驟：
[0099] 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后于121°C條件下將溶液 滅菌20分鐘；
[0100] 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后采用0. 25 μ m濾膜將溶液過濾除菌；
[0101] 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液的溫度分別恢復(fù)到26°C后，再將兩 者溶液混合均勻，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0102] 實(shí)施例10
[0103] 本發(fā)明提供的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法可以包括以下步驟：
[0104] 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后于125°C條件下將溶液 滅菌18分鐘；
[0105] 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后采用0. 22 μ m濾膜將溶液過濾除菌；
[0106] 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液的溫度分別恢復(fù)到30°C后，再將兩 者溶液混合均勻，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0107] 本發(fā)明還提供所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，所述活疫苗 為豬乙型腦炎活疫苗。
[0108] 實(shí)施例11
[0109] 作為本發(fā)明的一個實(shí)施例，豬乙型腦炎活疫苗的制備步驟如下：
[0110] 本實(shí)施例所用毒種是豬乙型腦炎SA14_14_2株，由中國藥品生物制品檢定所鑒 定、保管和供給。
[0111] 選用10-14日齡SPF地鼠，首先無菌采取地鼠腎臟，剪成l-2mm小塊，加入0.25% 胰酶消化分散成單個細(xì)胞，除去胰酶，加入細(xì)胞生長液后種入轉(zhuǎn)瓶內(nèi)，置于37°C培養(yǎng)4? 5天形成致密單層，然后棄去生長液，更換細(xì)胞維持液，同時按一定比例接種豬乙型腦炎病 毒，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時收獲病毒液。經(jīng)檢測病毒效價彡10 7 5TCID5(l/mL時，方可用 于配制疫苗。
[0112] 實(shí)施例12豬乙型腦炎耐熱凍干保護(hù)劑活疫苗的制備及其耐熱試驗(yàn)和免疫效果試 驗(yàn)
[0113] 1、將試驗(yàn)疫苗分為A、B、C、D四個組別，制備方法如下：
[0114] A、B、C組試驗(yàn)疫苗：將本發(fā)明實(shí)施例1、2和3中的耐熱凍干保護(hù)劑與實(shí)施例11中 的豬乙型腦炎活疫苗病毒液（由湖南中岸生物藥業(yè)有限公司細(xì)胞疫苗車間按《豬乙型腦炎 活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》制備）按1:1的體積比混合，再將溶液的pH值調(diào)至7. 5?7. 8 后進(jìn)行冷凍干燥，即得到豬乙型腦炎耐熱凍干保護(hù)劑活疫苗。
[0115] D組試驗(yàn)疫苗：用常規(guī)凍干保護(hù)劑（脫脂奶10g，蔗糖5g，加注射用水至100ml)與 豬乙型腦炎活疫苗病毒液，按規(guī)程1:1的體積混合，再將溶液的pH值調(diào)至7. 5?7. 8后進(jìn) 行冷凍干燥，得到對照組凍干保護(hù)劑活疫苗。
[0116] 其中，冷凍干燥的具體步驟為：
[0117] 1)將活疫苗在常壓、溫度為-30°C以下的條件下保持1?3小時；
[0118] 2)將活疫苗在真空度為10?15Pa、溫度為-20?-15°C條件下保持20?40分 鐘；
[0119] 3)將活疫苗在真空度為10?15Pa、溫度為-10?_5°C條件下保持12?15小時；
[0120] 4)將活疫苗在真空度為10?15Pa、溫度為-2?2°C條件下保持1?3小時；
[0121] 5)將活疫苗在真空度為10?15Pa、溫度為8?12°C條件下保溫1?3小時；
[0122] 6)將活疫苗在真空度為10?15Pa、溫度為25?30°C條件下保持8?10小時；
[0123] 在步驟2)?步驟6)的凍干過程中，冷凝器溫度保持在-50?-70°C。
[0124] 2、耐熱試驗(yàn)及結(jié)果
[0125] 將以上4組試驗(yàn)疫苗分別置于2?8°C、37°C條件下保存，于不同時間檢測試驗(yàn)疫 苗效價變化情況。
[0126] 效力檢驗(yàn)：將疫苗用PBS液稀釋至每頭份1ml，再做10倍系列稀釋，取ΚΓ5?ΚΓ 7 三個稀釋度的病毒液，分別接種原代地鼠腎細(xì)胞，每個稀釋度接種6瓶，同時設(shè)立同批對照 6瓶，置于37°C培養(yǎng)7天，觀察細(xì)胞病變，計算TCID 5(i，每頭份病毒含量應(yīng)會105_7TCID5Q。
[0127] 試驗(yàn)疫苗在2?8°C、37°C條件下保存不同時間的效價檢驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。
[0128] 表1疫苗在2?8°〇條件下保存6、12、18、24個月效價測定結(jié)果〇'(：105(|/頭份）
[0129]

【權(quán)利要求】
1. 一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于，所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑由明膠、 蔗糖、Trolox、精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和注射用水組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于，所述活疫苗的耐熱 凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成： 明膠1?10%，蔗糖2?10%，TroloxO.Ol?0.2%，精氨酸0· 1?2%，聚乙烯吡咯 烷酮0. 5?8%，余量為注射用水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于，所述活疫苗的耐熱 凍干保護(hù)劑由以下原料按重量配比組成： 明膠4?7%，蔗糖4?6%，Trolox0.05?0· 15%，精氨酸0· 5?1. 5%，聚乙烯吡咯 烷酮1?2%，余量為注射用水。
4. 一種制備權(quán)利要求1?3中任意一項所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的方法，其特 征在于，所述制備方法是： 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后將溶液滅菌； 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后將溶液過濾除菌； 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液混合，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保 護(hù)劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法，其特征在于，所述制 備方法是： 將明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮依次溶于注射用水中，然后于110?130°C條件下將溶 液滅菌10?40分鐘； 將Trolox、精氨酸依次溶于注射用水中，然后采用0. 2?0. 25 μ m濾膜將溶液過濾除 菌； 將所述滅菌后的溶液和所述過濾除菌后的溶液的溫度恢復(fù)到20?30°C后，再混合均 勻，即得到所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?3中任意一項所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的 應(yīng)用，其特征在于，所述活疫苗為豬乙型腦炎活疫苗。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，其特征在 于，包括： 將所述活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑與豬乙型腦炎活疫苗病毒液按照體積比〇. 5?2:1? 2混合； 將混合溶液的pH值調(diào)至7. 5?7. 8后進(jìn)行冷凍干燥，即得到豬乙型腦炎耐熱凍干保護(hù) 劑活疫苗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，其特征在 于，所述冷凍干燥的步驟包括： 1) 將活疫苗在常壓、溫度為-3〇°C以下的條件下保持1?3小時； 2) 將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-20?-15°C條件下保持20?40分鐘； 3) 將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-10?-5°C條件下保持10?15小時； 4) 將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為-2?2°C條件下保持1?3小時； 5) 將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為8?12°C條件下保溫1?3小時； 6)將活疫苗在真空度為5?15Pa、溫度為25?30°C條件下保溫8?12小時； 在步驟2)?步驟6)的凍干過程中，冷凝器溫度保持在-50?-70°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，其特征在 于，所述豬乙型腦炎病毒效價彡107 5TCID5(l/mL。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑在活疫苗制備中的應(yīng)用，其特征 在于，先將所述耐熱凍干保護(hù)劑和豬乙型腦炎病毒液的溫度分別恢復(fù)到15?20°C，再混合 均勻。
【文檔編號】A61P31/14GK104083769SQ201410308639
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】巢偉, 張桂紅, 王和平, 徐雷, 黃嵐芬 申請人:湖南中岸生物藥業(yè)有限公司