一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是一種廣泛傳播的機(jī)會(huì)性潛伏感染病原體，在發(fā)展中國(guó)家如中國(guó)，成人感染率在90%以上，潛伏感染的HCMV終身存在，人體內(nèi)難以被清除，在免疫低下的狀況下(如腫瘤、器官移植)容易再激活并引起嚴(yán)重的損傷。HCMV感染是新生兒致畸的首要病毒病因。目前對(duì)HCMV既無(wú)清空潛伏感染的措施，亦無(wú)有效的預(yù)防母嬰垂直傳播的手段。
[0003]完全人源化治療性抗體避免了鼠源單抗可能導(dǎo)致的人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，在臨床治療中可望發(fā)揮重要的作用。因?yàn)槠渚哂懈哂H和力和特異性，能夠在復(fù)雜的混合物中識(shí)別微量的抗原并中和抗原。恒定區(qū)Fe區(qū)還可以激發(fā)抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用(⑶C)，有效地清除靶細(xì)胞。
[0004]治療性抗體藥物已經(jīng)成為目前生物技術(shù)藥物中品種最多、銷(xiāo)售額最大的類(lèi)型，在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤和哮喘、銀肩病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的治療中已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用，但用于病毒治療的報(bào)道較少，主要有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗(Synagis)。發(fā)展完全人源化的、高效的、穩(wěn)定性好的、特異性或廣譜性的抗病毒治療性抗體是控制新發(fā)和重大病毒性傳染病、保障人類(lèi)健康的迫切需求，也是歷史交給我們的迫切任務(wù)。近年隨著抗體工程技術(shù)的進(jìn)步，完成這一任務(wù)正成為現(xiàn)實(shí)。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外的單抗藥物主要應(yīng)用于治療腫瘤、防治器官移植排斥等方面。美國(guó)Genentech公司研發(fā)的人源化單克隆抗體赫賽汀(herceptin)是第一個(gè)針對(duì)HER-2陽(yáng)性乳腺癌的、以癌基因?yàn)榘械闹委熕幬?，?duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌有明顯療效。中國(guó)第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心和華神集團(tuán)共同研發(fā)的利卡汀(碘美妥昔單抗注射液)是全球第一個(gè)批準(zhǔn)上市的用于治療中晚期原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的單克隆抗體。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心梁米芳等在利用scFv等抗體庫(kù)篩選抗病毒抗體方面開(kāi)展了卓有成效的工作。但總的來(lái)看，國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗病毒治療性抗體，尤其是關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用方面的報(bào)道相對(duì)較少。發(fā)展抗病毒治療性抗體研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)并對(duì)嚴(yán)重威脅國(guó)人健康的HCMV病毒開(kāi)展人源抗體篩選、研制，契合國(guó)家戰(zhàn)略規(guī)劃，既是保障人民健康的迫切需求，也是發(fā)展生物高新技術(shù)的重大機(jī)遇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物，它通過(guò)對(duì)人源化抗體Fe區(qū)的定點(diǎn)突變和分子重構(gòu)，增強(qiáng)其生物學(xué)功能，結(jié)合酵母表面展示技術(shù)，構(gòu)建新型人源化抗體庫(kù);建立并改進(jìn)EB病毒(EBV)感染IgG+記憶性B細(xì)胞使其永生化、從恢復(fù)期病人血細(xì)胞中篩選針對(duì)特定病毒的人源化單克隆抗體的技術(shù)平臺(tái)；構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的針對(duì)HCMV的高效治療性抗體，該抗體可以高效特異的在體外及細(xì)胞內(nèi)針對(duì)HCMV的抗體進(jìn)行篩選。
[0007]
本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物，其特征是它包括對(duì)Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增強(qiáng)ADCC、CDC;噬菌體和酵母表面展示抗體庫(kù)的構(gòu)建；通過(guò)CPG2006/IL-2提高EBV促I(mǎi)gG+記憶性B細(xì)胞永生化效率，所述的對(duì)Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增強(qiáng)ADCC、CDC為恒定區(qū)Fe區(qū)還可以激發(fā)抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用(CDC)，有效地清除靶細(xì)胞，所述的噬菌體和酵母表面展示抗體庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程為能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白S0C(9 ku)和H0C(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失，T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過(guò)分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制，所述的通過(guò)CPG2006/IL-2提高EBV促I(mǎi)gG+記憶性B細(xì)胞永生化效率為采用EBV中國(guó)株感染B細(xì)胞，提高EBV永生化B細(xì)胞的效率。
[0008]本發(fā)明具有以下有益效果:采用了以上技術(shù)方案后，本發(fā)明是通過(guò)對(duì)人源化抗體Fe區(qū)的定點(diǎn)突變和分子重構(gòu)，增強(qiáng)其生物學(xué)功能，結(jié)合酵母表面展示技術(shù)，構(gòu)建新型人源化抗體庫(kù);建立并改進(jìn)EB病毒(EBV)感染IgG+記憶性B細(xì)胞使其永生化、從恢復(fù)期病人血細(xì)胞中篩選針對(duì)特定病毒的人源化單克隆抗體的技術(shù)平臺(tái)；構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的針對(duì)HCMV的高效治療性抗體，本發(fā)明采用優(yōu)化程序，建立一套具有普適性的、適合國(guó)情并具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的從恢復(fù)期病人血細(xì)胞中篩選針對(duì)HCMV的人源化單克隆抗體的技術(shù)體系。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本發(fā)明抗體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0010]圖2為本發(fā)明抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物實(shí)驗(yàn)流程圖。
[0011 ]圖3為本發(fā)明單克隆抗體的生產(chǎn)的流程圖。
【附圖說(shuō)明】
[0012]在圖1中，本發(fā)明提供了一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物，它包括對(duì)Fe的改造，提高Tm、Tl/2，增強(qiáng)ADCC、CDC;噬菌體和酵母表面展示抗體庫(kù)的構(gòu)建;通過(guò)CPG2006/IL-2提高EBV促I(mǎi)gG+記憶性B細(xì)胞永生化效率，所述的對(duì)Fe的改造，提高Tm、T1/2，增強(qiáng)ADCCXDC為恒定區(qū)Fe區(qū)還可以激發(fā)抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用(CDC)，有效地清除靶細(xì)胞，所述的噬菌體和酵母表面展示抗體庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程為能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白S0C(9 ku)和H0CC40 ku)融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失，T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過(guò)分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制，所述的通過(guò)CPG2006/IL-2提高EBV促I(mǎi)gG+記憶性B細(xì)胞永生化效率為采用EBV中國(guó)株感染B細(xì)胞，提高EBV永生化B細(xì)胞的效率。
[0013]本發(fā)明提供了一種抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體藥物，并且詳細(xì)介紹了這種人源化抗體藥物的涉及制備方法及優(yōu)點(diǎn)。該抗體可以高效特異的在體外及細(xì)胞內(nèi)針對(duì)HCMV的抗體進(jìn)行篩選。
[0014](一)人源化抗體Fe區(qū)改造技術(shù)
通過(guò)對(duì)Fe晶體及其與受體的共結(jié)晶的三維結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)與其功能相關(guān)的重要氨基酸位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變的方法改變Fe的關(guān)鍵氨基酸，或者對(duì)整個(gè)Fe功能域進(jìn)行分子重構(gòu)，從而達(dá)到加強(qiáng)其生物學(xué)功能和增加其穩(wěn)定性的目的。增加其體內(nèi)半衰期，延長(zhǎng)抗體壽命。在基于改造優(yōu)化的Fe的基礎(chǔ)上，構(gòu)建噬菌體展示人源抗體庫(kù)和酵母表面展示人源抗體庫(kù)。
[0015]
1、單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng) (I)Pin展示系統(tǒng)。
[0016]絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，Pm是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)?5個(gè)拷貝Pm蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個(gè)功能區(qū)域，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽Gl和G2連接。其中，NI和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)Pm蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。Pm有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于Pm蛋白的信號(hào)肽(Sgm)和Ni之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的Pm蛋白，噬菌體仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接與Pm蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整Pm蛋白來(lái)提供。Pm蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。
[0017](2)ΡΥΠΙ及其他展示系統(tǒng)。
[0018]PVI是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2 700個(gè)左右PVI拷貝。PVI的N端附近可融合五肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PVI蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。此外，尚有絲狀噬菌體PVI展示