專(zhuān)利名稱(chēng)：人巨細(xì)胞病毒中和抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有中和人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的高效力(potency)且特異性針對(duì) hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的組合的抗體，以及產(chǎn)生該單克隆抗體的永生化B細(xì)胞。 本發(fā)明還涉及通過(guò)hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的組合確定的、該抗體所結(jié)合的表面 抗原，以及該抗體和表位在篩選方法以及疾病的診斷、預(yù)防和治療中的用途。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(hCMV)是一種廣泛分布的病原體，其可在免疫抑制的成人中和胎 兒感染后導(dǎo)致嚴(yán)重的病理，并參與例如動(dòng)脈粥樣硬化的慢性疾病。hCMV感染多種細(xì)胞類(lèi)型， 包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和造血細(xì)胞[1]。正在被開(kāi)發(fā)作為候選疫苗的體外繁 殖的hCMV減毒菌株已經(jīng)喪失了內(nèi)皮細(xì)胞的向性(tropism)，但是仍然保留感染成纖維細(xì)胞 的能力[2]。hCMV的細(xì)胞向性被認(rèn)為是由兩種病毒糖蛋白復(fù)合物調(diào)控的。例如gH、gL和g0 的糖蛋白的復(fù)合物似乎是感染成纖維細(xì)胞所需要的，而gH、gL和由UL131-ULU8基因編碼 的蛋白質(zhì)的復(fù)合物參與內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的感染[2-8]。超免疫球蛋白已被商業(yè)化用于預(yù)防移植相關(guān)的hCMV疾病，并且最近的證據(jù)表明 它們對(duì)孕婦有治療效果[9]。該治療方法受限于可被遞送的中和抗體的量低，因而非常需要 獲得具有高中和能力的人抗體(如人單克隆抗體)。然而，hCMV中和抗體的靶點(diǎn)仍尚待確 定。盡管一些針對(duì)gH、gB以及ULU8和UL130基因產(chǎn)物的抗體在體外表明具有中和活性[7， 10，11]，且針對(duì)gH的抗體已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了評(píng)估(由于缺乏治療效果被終止了)，但 分離的單克隆抗體的中和效力至今仍一般，因?yàn)樵诳贵w濃度范圍是0. 5-20mg/ml時(shí)才可以 觀察到中和作用。此外，目前的方法通常使用成纖維細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞來(lái)測(cè)定抗-hCMV抗 體的中和效力。然而，已知hCMV通過(guò)感染其他細(xì)胞類(lèi)型(例如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及白 細(xì)胞)也能引起病理。已知的針對(duì)UL 1 和UL 130的抗體顯示在中和內(nèi)皮細(xì)胞感染中的 效力很低[7]，且看起來(lái)不存在可用的能夠以高效力中和目標(biāo)非成纖維細(xì)胞的感染的單克 隆抗體。因此，需要能夠以高價(jià)中和目標(biāo)非成纖維細(xì)胞的hCMV感染的抗體，以及闡明該抗 體結(jié)合的靶點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明部分是基于能夠以高效力中和hCMV感染的新抗體以及本發(fā)明的這些抗體 所結(jié)合的新表位的發(fā)現(xiàn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括具有中和hCMV的高效力 的中和抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段特異性針對(duì)hCMV蛋白UL128、UL130和 UL131A的組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼本發(fā)明抗體或抗體片段的核酸分子。在再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明抗體或抗體片段的核酸分子的載體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有包含本發(fā)明核酸分子的載體的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括表達(dá)具有中和hCMV的高效力的抗體的永生化B 細(xì)胞克隆，其中所述抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的組合。在再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括與本發(fā)明的抗體相結(jié)合的表位。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含與本發(fā)明的抗體相結(jié)合的表位的免疫原 性多肽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括與結(jié)合本發(fā)明的抗體的表位相結(jié)合的配體。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于制備具有中和hCMV的高效力的抗體的 方法，其中所述的抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的組合。該方法包括 (i)培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明抗體的永生化B細(xì)胞克隆和(ii)從B細(xì)胞分離抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種包含本發(fā)明抗體或抗體片段、本發(fā)明的核 酸、表達(dá)本發(fā)明抗體的永生化B細(xì)胞克隆，或包含與本發(fā)明的抗體或抗體片段相結(jié)合的表 位的免疫原性多肽的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括具有中和hCMV的高效力的抗體或抗體片段 (其中所述抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的組合)、編碼具有中和hCMV 的高效力的抗體或抗體片段的核酸(其中所述抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白質(zhì)UL128、UL130 和UL131A的組合)、表達(dá)具有中和hCMV的高效力的抗體的永生化B細(xì)胞克隆(其中所述抗 體特異性針對(duì)hCMV蛋白質(zhì)ULU8、UL130和UL131A的組合)，或包含結(jié)合具有中和hCMV的 高效力的抗體的表位的免疫原性多肽(其中所述抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白質(zhì)UL128、UL130 和UL131A的組合)在治療或診斷中的應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種用于診斷hCMV感染的試劑盒，其包含本發(fā) 明抗體或抗體片段、編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段的核酸，或結(jié)合本發(fā)明抗體的表位。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于制備重組細(xì)胞的方法。該方法包括(i)對(duì) 來(lái)自表達(dá)本發(fā)明抗體的永生化B細(xì)胞克隆的核酸進(jìn)行測(cè)序和(ii)利用獲自步驟(i)的序 列信息來(lái)制備用于插入至表達(dá)宿主以允許在該宿主中表達(dá)目的抗體的核酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于制備具有中和hCMV的高效力并且特異 性針對(duì)hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的組合的抗體的方法。該方法包括培養(yǎng)或傳代培 養(yǎng)通過(guò)上述方法獲得的表達(dá)宿主，且任選地純化目的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括篩選可誘導(dǎo)針對(duì)hCMV的免疫應(yīng)答的多肽的方 法，包括利用本發(fā)明的抗體或抗體片段篩選多肽庫(kù)。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了表明人單克隆抗體(mAb)6G4識(shí)別通過(guò)hCMV蛋白ULU8、UL130和 UL131A的組合所確定的表位的FACS分析。圖2顯示了抗體6G4的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。⑶R序列為粗體。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于中和hCMV感染和具有中和hCMV感染的特別高的效力的抗體和抗體 片段的制備的。這些抗體是令人想要的，因?yàn)閮H需低濃度就能中和一定量的病毒。施用較 低量的抗體就能有利于高水平的保護(hù)。人單克隆抗體和分泌這些抗體的永生化B細(xì)胞克隆也同樣包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了針對(duì)hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的組合的抗體在中和hCMV 中是特別有效的。不希望局限于任何理論，該組合可以是形成由抗體識(shí)別的獨(dú)特表位的 UL128.UL130和UL131A的精確復(fù)合物。本發(fā)明還涉及對(duì)抗體所結(jié)合的表位的表征以及表位在提高免疫應(yīng)答中的用途。本發(fā)明還涉及不同的涉及本發(fā)明抗體和它們結(jié)合的表位的方法和用途。本發(fā)明的抗體本發(fā)明提供了具有中和hCMV的特別高的效力的單克隆抗體或重組抗體。本發(fā)明 還提供了這些單克隆或重組抗體的片段，特別是保留了所述抗體的抗原結(jié)合活性的片段。 在本說(shuō)明書(shū)中，“中和hCMV的高效力”是指本發(fā)明的抗體分子在標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中以比本領(lǐng)域公知 的抗體(例如與MSL-109、8F9或3E3相比)低得多的濃度中和hCMV。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體分子能以0. 16μ g/ml或更低的濃度(即0. 15、 0.125,0.1,0.075,0.05,0.025,0.02,0.015,0.0125,0.01,0.0075,0.005,0.004,0.003、 0.002或更低)中和hCMV。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該抗體能以0.016 μ g/ml或更低(即以 比例如KT8 MUO-MUOiMUO-nMUO—MUOWM更低的抗體濃度)的濃度中和hCMV。這意 味著，與中和相同效價(jià)的hCMV所需的公知抗體(例如MSL-109、8F9或3E3)的濃度相比，體 外中和50%的hCMV臨床分離物只需要非常低的抗體濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中，體外中 和50%的hCMV臨床分離物中內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞感染所需的本發(fā)明抗體的濃 度比MSL-109、8F9或3E3所需的濃度低10倍或更高(即25、50、75、100、150、200或更高)。 可采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)中和檢測(cè)測(cè)定該效力。本發(fā)明的抗體能夠中和幾種細(xì)胞類(lèi)型的hCMV感染。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明抗 體防止樹(shù)突細(xì)胞的感染。本發(fā)明的抗體也可防止上皮細(xì)胞(例如視網(wǎng)膜細(xì)胞和骨髓細(xì)胞 (例如樹(shù)突細(xì)胞))的感染。這些抗體經(jīng)適當(dāng)配制后可用作預(yù)防或治療性制劑，或可用作診斷工具?！爸泻涂贵w”是能中和病原體在宿主中開(kāi)始和/或保持感染的能力的抗體。本發(fā)明 提供了中和性人單克隆抗體，其中，該抗體識(shí)別來(lái)自hCMV的抗原。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的抗體特異性針對(duì)hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的組
口 O在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體是在本文中被稱(chēng)為6G4的單克隆抗體。從 hCMV感染的供體分離的該抗體，通過(guò)被稱(chēng)為6G4的永生化B細(xì)胞克隆制備。該抗體中和內(nèi) 皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞(例如視網(wǎng)膜細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞))的hCMV感染。6G4的重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，且輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示?？贵w重鏈的⑶R分別被稱(chēng)為⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3。類(lèi)似的，抗體輕鏈的⑶R分別 被稱(chēng)為CDRLUCDRL2和CDRL3。根據(jù)IMGT編號(hào)系統(tǒng)[12，13，14]將CDR氨基酸的位置限定 為CDR1-IMGT 位置 27 至 38，CDR2-IMGT 位置 56 至 65 和 CDR3-IMGT 位置 105 至 117。該抗體⑶R的氨基酸序列如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種具有中和人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的高效力的中和抗體，其中所述抗體特異性針 對(duì) hCMV 蛋白 UL128、UL130 和 UL131A 的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其包括SEQID NO :1_6中的一個(gè)或多個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其包括包含SEQID NO :1-3中的一個(gè)或多個(gè)的重鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其含有包含SEQID NO :1的⑶RH1、SEQ ID NO :2的 CDRH2 及 SEQ ID NO 3 的 CDRH3 的重鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其包括包含SEQID NO :4_6中的一個(gè)或多個(gè)的輕鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其含有包含SEQID NO :4的⑶RL1、SEQ ID NO :5的 CDRL2 及 SEQ ID NO 6 的 CDRL3 的輕鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述重鏈具有SEQID NO :7所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述輕鏈具有SEQID NO :8所示的序列。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為人單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體6G4。
11.與能夠結(jié)合前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體的表位相結(jié)合的抗體。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體的片段，其中所述片段特異性針對(duì)hCMV蛋白 UL128、UL130 和 UL131A 的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體片段，其為Fab、Fab，、F(ab')2或Fv片段。
14.編碼前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體或抗體片段的核酸分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQID NO :9_16中的 任一個(gè)。
16.包含權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的核酸分子的載體。
17.包含權(quán)利要求16所述的載體的細(xì)胞。
18.表達(dá)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗體的永生化B細(xì)胞克隆。
19.結(jié)合權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗體的表位。
20.包含權(quán)利要求19所述的表位的免疫原性多肽。
21.結(jié)合權(quán)利要求19所述的表位的配體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的配體，其為抗體。
23.一種用于制備權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗體的方法，包括(i)培養(yǎng)權(quán)利要求 18所述的永生化B細(xì)胞克隆和(ii)從B細(xì)胞分離抗體。
24.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段、權(quán) 利要求14或權(quán)利要求15所述的核酸、權(quán)利要求18所述的永生化B細(xì)胞克隆或權(quán)利要求20 所述的免疫原性多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的藥物組合物，其包含特異性針對(duì)通過(guò)hCMV蛋白UL128、 UL130和UL131A的組合確定的表位的第一抗體或抗體片段，以及特異性針對(duì)第二表位的第 二抗體或片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的 稀釋劑或載體。
27.權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段、權(quán)利要求14或權(quán)利要求15 所述的核酸、權(quán)利要求18所述的永生化B細(xì)胞克隆或權(quán)利要求20所述的免疫原性多肽在治療或診斷中的用途。
28.權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段、權(quán)利要求14或權(quán)利要求15 所述的核酸、權(quán)利要求18所述的永生化B細(xì)胞克隆或權(quán)利要求20所述的免疫原性多肽在 ⑴制備用于治療hCMV感染的藥物或(ii)疫苗中的用途。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的第一抗體或抗體片段以及特異性針對(duì)第 二表位的第二抗體或抗體片段在制備用于治療hCMV感染的藥物中的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀或權(quán)利要求四所述的用途，其中所述患者對(duì)抗hCMV的常規(guī)治療 是不應(yīng)性的。
31.根據(jù)權(quán)利要求觀或權(quán)利要求四所述的用途，其中所述患者被預(yù)施用、后施用或同 時(shí)施用抗病毒劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的用途，其中所述抗病毒劑選自更昔洛韋、膦甲酸或西多福韋。
33.根據(jù)權(quán)利要求觀或權(quán)利要求四所述的用途，其中所述患者是免疫受損的。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的用途，其中所述患者患有HIV或是移植患者。
35.權(quán)利要求18或22所述的組合物或用途，其中所述第二抗體或抗體片段特異性針對(duì) hCMV蛋白質(zhì)。
36.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的組合物或用途，其中所述hCMV蛋白是糖蛋白。
37.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的組合物或用途，其中所述hCMV蛋白質(zhì)是gB、gH、gL、gM、gN、 g0、UL128、UL130、UL131A 或其組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物或用途，其中所述第二抗體或抗體片段特異性針對(duì) 由MSL-109、8F9或3E3識(shí)別的表位。
39.一種用于治療受試者的方法，包括施用權(quán)利要求M46或35-38中任一項(xiàng)所述的藥 物組合物的步驟。
40.一種用于診斷hCMV感染的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的抗 體或抗體片段、權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的核酸或權(quán)利要求19所述的表位。
41.一種制備重組細(xì)胞的方法，其包括步驟(i)對(duì)來(lái)自權(quán)利要求18所述的B細(xì)胞克隆 的核酸進(jìn)行測(cè)序；(ii)利用獲自步驟(i)的序列信息來(lái)制備用于插入至表達(dá)宿主以允許在 所述宿主中表達(dá)目的抗體的核酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述核酸在步驟(i)和(ii)之間被操作來(lái)導(dǎo)入 限制性位點(diǎn)、改變密碼子選擇、和/或優(yōu)化轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述表達(dá)宿主是真核細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述動(dòng)物細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述動(dòng)物細(xì)胞為CH0、NS0或人細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述人細(xì)胞為PER.C6細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞或 HKB-Il 細(xì)胞。
48.一種制備權(quán)利要求1-11或22中任一項(xiàng)所述抗體的方法，包括在目的抗體表達(dá)的條 件下培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)通過(guò)權(quán)利要求41所述的方法獲得的表達(dá)宿主；以及任選地，純化目的抗體。
49.一種篩選可誘導(dǎo)針對(duì)hCMV的免疫應(yīng)答的多肽的方法，包括利用權(quán)利要求1-13或 22中任一項(xiàng)所述的抗體或片段篩選多肽庫(kù)。
50.權(quán)利要求1-13或22中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段在通過(guò)檢查疫苗中抗原是否 含有正確構(gòu)象的正確表位來(lái)監(jiān)控抗hCMV疫苗的質(zhì)量中的用途。
51.根據(jù)權(quán)利要求觀-34中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞 和骨髓細(xì)胞的感染。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的用途，其中所述抗體預(yù)防視網(wǎng)膜細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的感染。
53.特異性結(jié)合權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段的表位在(i)治療、 ( )制備用于治療hCMV感染的藥物，或(iii)作為疫苗中的用途。
54.特異性結(jié)合權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段的表位在篩選能夠中 和hCMV感染的配體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性針對(duì)中和人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的中和抗體，特別是特異性針對(duì)于hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的組合的抗體。本發(fā)明的抗體以高效力中和感染。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生該抗體的永生化B細(xì)胞、該抗體所結(jié)合的表位，以及該抗體和表位在篩選方法以及疾病的診斷和治療中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102143974SQ200880130982
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者A·蘭扎維希雅, A·瑪卡格諾 申請(qǐng)人:胡馬斯有限公司