一種人工角膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體為一種人工角膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 光化學(xué)膠原交聯(lián)的基本原理即光氧化反應(yīng)。根據(jù)光敏劑所特有的吸收光譜，在其 最大吸收波長范圍內(nèi)，經(jīng)一定波長福照后，光敏劑吸收光子能量，激發(fā)形成=線態(tài)，具備極 強(qiáng)的氧化能力，產(chǎn)生超氧自由基或單態(tài)氧，氧自由基具備直接修飾膠原蛋白分子的活性，弓I 起膠原中氨基酸殘基分子內(nèi)或之間形成共價(jià)鍵，增加膠原纖維間共價(jià)鍵的密度，從而提高 膠原生物力學(xué)特性（II型光化學(xué)反應(yīng)）。隨著近年來對光氧化反應(yīng)的不斷研究，使其作為一 種處理生物材料的全新方法用于臨床成為可能。而采用該方法處理后的生物材料，具備組 織的活性、完整性W及低抗原性，已成功實(shí)踐于臨床中，如采用0. 1%的亞甲基藍(lán)作為光敏 劑，在白識燈照射下發(fā)生的光敏反應(yīng)來處理的替代材料：豬主動(dòng)脈瓣作為主動(dòng)脈瓣膜的替 代材料，牛屯、包作為組織補(bǔ)片的替代材料和牛頸靜脈作為血管的替代材料。
[0003] 應(yīng)用此方法較多的是應(yīng)用于臨床疾病的治療，如紫外光/核黃素角膜交聯(lián)術(shù)，其 最早是由德國德累斯頓大學(xué)研究小組提出的療法，用來阻止圓錐角膜的發(fā)展，解決臨床上 角膜材料供源緊張的問題，從21世紀(jì)初期應(yīng)用W來，取得了比較理想的療效，已被推廣到 角膜潰瘍、角膜炎等多種角膜疾病治療中。白瓊珍等應(yīng)用紫外線/核黃素角膜交聯(lián)術(shù)治療 真菌性角膜潰瘍，相比于傳統(tǒng)的治療，該療法顯著提高了其療效，避免了傳統(tǒng)治療術(shù)后（如 結(jié)膜瓣遮蓋、急性期角膜移植等）的并發(fā)癥。巧捷等采用紫外光核黃素膠原交聯(lián)探討了對 兔角膜堿燒傷的治療作用，結(jié)果顯示該療法可W減輕兔角膜堿燒傷后的基質(zhì)損傷及炎性 細(xì)胞的浸潤，縮短愈合時(shí)間。呂雅平等探索了紫外光/核黃素交聯(lián)法對豚鼠鞏膜組織張力 和強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)該交聯(lián)法可W有效提高鞏膜的生物力學(xué)特性，增強(qiáng)組織張力、強(qiáng)度，為 臨床上治療高度病理性近視提供新的方法。國內(nèi)專利中，北京億仁賽博醫(yī)療科技研發(fā)中屯、 有限公司應(yīng)用光敏劑治療滅活血管斑塊、白血病、艾滋病和肝炎等病毒。劉天軍等公開了一 種含血化嘟或血化嘟鐵的口服光敏藥物制劑及其在治療惡性腫瘤中的應(yīng)用。北京普惠生物 醫(yī)學(xué)工程公司采用光氧化劑濃度為0.01-0.iwt%的光氧化法處理異種屯、臟植入物膠原組 織。
[0004] 自20世紀(jì)90年代開始，研究人員就試圖采用紫外線處理角膜，通過W氧自由基介 導(dǎo)的氧化反應(yīng)來增加膠原纖維的強(qiáng)度。Wollensak等第一個(gè)證明了角膜交聯(lián)術(shù)療法對于進(jìn) 展行圓錐角膜有療效，他們采用紫外線/核黃素角膜交聯(lián)術(shù)對22例（23只眼）進(jìn)展行圓錐 角膜患者進(jìn)行治療，臨床跟蹤結(jié)果顯示，所有患者的圓錐角膜進(jìn)展都被阻止或延緩。2008年 Witting-Silvad等發(fā)表了前瞻性研究的早期結(jié)果，將接受了角膜膠原交聯(lián)術(shù)的實(shí)驗(yàn)組巧 只眼）及未接受治療的對照組（11只眼）比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的視力、擴(kuò)張強(qiáng)度都有所改善， 而對照組繼續(xù)惡化。Janko等對20例進(jìn)展行圓錐形角膜患者（25只眼）進(jìn)行紫外線/核 黃素角膜交聯(lián)術(shù)后，所有患者在術(shù)后1個(gè)月時(shí)圓錐角膜都停止了發(fā)展，視力也有所提高。隨 著該技術(shù)的興起，更多臨床研究報(bào)道了紫外線/核黃素角膜交聯(lián)術(shù)的臨床效果。Iseli等 對常規(guī)抗生素治療無效的角膜炎患者采用角膜交聯(lián)術(shù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者的病變均無 發(fā)展，驗(yàn)證了角膜交聯(lián)術(shù)對于治療角膜炎的療效。Spoerl等將紫外線/核黃素角膜交聯(lián)術(shù) 用于豬眼，發(fā)現(xiàn)豬角膜對于膠原酶等的耐受性顯著增強(qiáng)，降解時(shí)間明顯延長。對于膠原酶降 解，交聯(lián)后的角膜的抵抗能力明顯提高。除此W外，國外也有學(xué)者將角膜交聯(lián)術(shù)用于準(zhǔn)分 子激光原位角膜磨鑲術(shù)（LASIK)術(shù)后引發(fā)的角膜擴(kuò)張。例如化fezi等治療了 10例LASIK 術(shù)后引發(fā)的角膜擴(kuò)張患者，隨訪25個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，全部患者角膜擴(kuò)張進(jìn)展均得到了控制，且 視力均有提高，角膜交聯(lián)術(shù)對于運(yùn)類術(shù)后引起的角膜擴(kuò)張亦有一定的療效。國外歐幾里得 系統(tǒng)公司在其專利中也闡述了紫外照射用于治療進(jìn)展行圓錐角膜、外科手術(shù)后的膨隆W及 外科手術(shù)前強(qiáng)化角膜。
[0005] 綜合W上，光氧化膠原交聯(lián)法主要是作為治療疾病的療法用于臨床，作為療法是 相對安全，但由于有部分患者病情進(jìn)展至晚期或術(shù)后并發(fā)癥的影響，病情并未得到阻止，或 者由于治療深度的限制存在一定的缺陷。例如，Pol化ammer和化rsiefen報(bào)告了 1例患者 經(jīng)紫外光/核黃素角膜交聯(lián)術(shù)治療后引發(fā)了細(xì)菌性角膜炎。另外Kymionisd等也報(bào)告了紫 外線A/核黃素交聯(lián)后引起的瘤疹性虹膜炎、角膜炎的一例患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，最終需進(jìn)行角膜 移植手術(shù)的患者仍占很大比例，約占所有角膜移植患者的16%。在亞洲一些國家，因宗教信 仰、社會文化等因素，角膜供源相對短缺，很多患者因此致盲。
[0006] 所W，尋找制備出具備優(yōu)良性能且能應(yīng)用于臨床的醫(yī)用替代材料是目前亟待解決 的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一目的針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的，提供一種人工角膜。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種人工角膜的制備方法。
[0009] 為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：一種人工角膜，W動(dòng)物脫細(xì) 胞角膜基質(zhì)先浸泡于光敏劑中，然后在紫外光照射下交聯(lián)均勻，其厚度為50-1000ym。
[0010] 優(yōu)選的，所述人工角膜厚度為300-600ym。
[0011] 一種光氧化膠原交聯(lián)的方法，其包括的步驟如下： 陽01引 （1)將動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)在0. 01-5mg/ml光敏劑溶液中浸泡l-eomin;
[001引 似將浸泡后的動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)取出放于培養(yǎng)皿中，用100-400皿波長紫外 光照射I-GOmin;
[0014] (3)用憐酸鹽緩沖溶液（PBS溶液）浸泡0. 5-地，然后振蕩0. 5-化；
[0015] (4)更換憐酸鹽緩沖溶液（PBS溶液），浸泡0. 5-地，然后振蕩0. 5-化。
[0016] 所述（2)步驟中，在紫外光照射l-30min時(shí)換面，然后繼續(xù)進(jìn)行照射。
[0017] 所述似步驟中，紫外光照射的功率密度在lmw/cm2-6000mw/cm2。 陽01引優(yōu)選的，所述似步驟中，紫外光照射的功率密度在800mw/cm2-3500mw/cm2。
[0019] 最優(yōu)選的，所述似步驟中，紫外光照射的功率密度在1200mw/cm2-2800mw/cm2。
[0020] 所述動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)可W是豬、牛、羊、馬、兔、猴等動(dòng)物角膜基質(zhì)脫細(xì)胞后的 廣品。
[0021] 所述光敏劑可W是N-甲酯犬脈酸（NFK)，3-經(jīng)基犬尿酸（3-0H-FK)，君巧琳，核黃 素，F(xiàn)MN，F(xiàn)AD，視黃醒等色素光敏劑。
[0022] 所述光敏劑可W是稠環(huán)釀?lì)惖忍烊还饷魟⒒筋惣捌溲苌锏裙饷魟?br>[0023] 動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)低免疫原性，保留替代物本身的形狀，且良好的生物相容性 使其與宿主周圍組織能融合成長為正常組織的部分，利于宿主機(jī)體重塑。本發(fā)明將脫細(xì)胞 后的動(dòng)物角膜基質(zhì)通過光氧化交聯(lián)后可W有效提高該動(dòng)物角膜基質(zhì)的生物機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn) 定性，W便于W后用于臨床。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：可W有效的改善脫動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì) 的機(jī)械強(qiáng)度等生物力學(xué)特性；因?yàn)樯锪W(xué)特性主要取決于膠原纖維、膠原纖維束W及它 們空間結(jié)構(gòu)的組成，因此，通過光福照/光敏劑交聯(lián)術(shù)可W改善動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生 物機(jī)械性能及其穩(wěn)定性。
【附圖說明】 W25] 圖1為透過率曲線圖； 陽0%] 圖2為縫合力曲線圖；
[0027] 圖3為掃描電鏡圖；
[0028] 圖4為H&E染色圖；
[0029] 圖5為人角膜上皮細(xì)胞解育48小時(shí)的掃描電鏡圖；
[0030] 圖6為人角膜上皮細(xì)胞解育72小時(shí)的掃描電鏡圖；
[0031] 圖7為顯微鏡下觀察化、她細(xì)胞貼附情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]W下通過具體實(shí)施例來對發(fā)明作進(jìn)一步的說明，結(jié)合防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)和皮膚刺激試 驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。但運(yùn)些實(shí)施例只是為了說明，不是對本發(fā)明的限制。 陽〇3引原理說明
[0034] 本發(fā)明一種人工角膜的制備方法主要是W動(dòng)物脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為脫細(xì)胞支架，其 中利用能吸收光線并能把吸收的光能傳遞給反應(yīng)物且對人體或動(dòng)物無毒性或毒性低的光 敏劑進(jìn)行光氧化交聯(lián)。光敏劑在光福照（可見光或紫外光福照）的條件下，被激發(fā)到=線 態(tài)，釋放W單線態(tài)氧為主的活性氧族，而活性氧化學(xué)性質(zhì)活潑，極不穩(wěn)定，可W與各種分子 反應(yīng)，誘導(dǎo)膠原纖維分子基團(tuán)（如氨基）之間發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)（II型光化學(xué)反應(yīng)），在膠 原纖維內(nèi)部或之間形成了新的分子鏈，改善了膠原纖維的機(jī)械強(qiáng)度。光敏劑選用NFK、3-經(jīng) 基犬尿酸（3-0H-FK)、君巧琳、核黃素、FMN、FAD、或者視黃醒等運(yùn)些色素光敏劑；稠環(huán)釀?lì)?等天然光敏劑、化嘟類及其衍生物等光敏劑。該類光敏劑在其中起到雙重作用：一是能夠吸 收光能并抽取電子；