察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1%中性紅染色，用酶標儀在波長 540皿波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲 得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。相比獲得 抑毒指數(shù)（TI)。 陽0創(chuàng) 妨結果：
[0044] ①樣品TDs。的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物III和化合物IV的TDs廟肥K293分別為2 2'12、2 2'm、2 2'"。
[0045] ②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，服V-I、服V-2病毒 對照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%W上的CPE，服V1和服V2在肥K293C陽則W腫脹、多細 胞融合化SV1致多個細胞融和成大泡，而服V2致融合為小泡）、變圓、脫落為主要特征。
[0046] 而組合物抑毒試驗各組細胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPEWSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV2-HEK293組在第9稀釋度之前細胞完全被保護，之后出 現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0047] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。 W48] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得ICs。，ICs。與TD5。相比獲得組合物的TI:抑制服V-1、服V-2在肥K293細胞發(fā)生CPE，ICsd分別為2 11'44、2 12'°9,TI分別為639. 1、 1002. 9?；衔颕II的TI:對應的ICso分別為2 3'77、2 4'"，TI分別為3. 1、4. 0?；衔颕V 的TI對應的ICw分別為2 4'6\2 4'27,TI分別為5. 4、4. 3。
[0049] 結論：組合物具有顯著的抗瘤疹科病毒（包括服V-1、肥V-2)的作用，而且安全性 高，因此組合物在治療瘤疹病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?；衔颕II和化合物IV 不具有顯著的抗瘤疹科病毒（包括服V-1、肥V-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III 和化合物IV在治療瘤疹病毒感染疾病中沒有應用背景。
[0050] (二）實驗例：組合物對呼吸道合胞病毒巧SV)的作用研究
[0051] (1)組合物、化合物HI和化合物IV的配置：將藥物溶于細胞維持液（含2%新生 牛血清的MEM，GIBICO公司產(chǎn)品）中備用。
[0052] (2)細胞株與病毒株：
[0053] 人胚腎細胞（肥K293，RSV病毒敏感細胞）購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病 毒巧SV)Long株引自中國CDC病毒病研究所。
[0054] (3)細胞毒性測定：
[00對參照文獻（汪受傳，王霖，陳超等，清肺日服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品W2倍比做系 列稀釋（2°一 6)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的肥K293上，每孔100祉，每稀釋度 縱向重復3孔（A、B、C行），平行設微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞 為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7山中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將 實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中 毒濃度燈DJ。
[0056] (4)抑毒試驗：
[0057] 參照文獻（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序 (2 2^ 橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復4孔，微孔板 的A、B、C行加含100個TCIDw的病毒IOOuL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不 同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的I~12作為細胞對照。37°C、5%C〇2培 養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1%中性紅染色，用酶標 儀在波長540皿波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A 值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。 相比獲得抑毒指數(shù)（TI)。 陽05引 妨結果：
[0059] ①樣品TDs。的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物III和化合物IV對肥K293的TDs。分別為2 2'35、2 2'27、2 2'"。
[0060] ②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在 第2d出現(xiàn)90%W上的CPE，RSV在肥K293CPEW折光性增強、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0061] 而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0062] RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前，細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0063] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。
[0064] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組 A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得TI:組合物抑 審IjRSV在肥K293 細胞發(fā)生CPE，ICso為 2 12'19,TI為 916. 5 ;化合物III的ICso為 2 4'27,TI 為 4. 0 ;化合物IV的IC5。為 2 4'36,TI為 3. 9 ;。
[00化]結論：組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可W用來制 備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病 毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可W用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
[0066] (S)實驗例：組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0067] (1)細胞株與病毒株：狗腎細胞（MDCK，流感病毒敏感細胞）引自中國CDC病毒病 研究所；流感病毒甲型（FluA) 1995.AII:32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。 W側 似細胞毒性測定： W例參照文獻（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將各樣品W2倍比做系列稀釋 (2 1 一 5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100祉，每稀釋度縱向重復 3孔（A、B、C行），平行設微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對 照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7山中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組 與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度 (TDso)O
[0070] 做抑毒試驗：
[0071] 參照文獻（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96 板孔中的單層細胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個 TCIDw的病毒IOOuL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設 F行作為病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37°C、5%C〇2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀 察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540皿波長讀取 A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率， 用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。相比獲得抑毒指數(shù)燈I)。 陽072] (4)結果：
[0073] ①樣品TDs。的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物nI和化合物IV對的TDs廟MDCK分別為2 2'U、2 2'46、2 2'83。
[0074] ②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)luA在MDCKCPE W折光性增強、壞死、破碎為主要特征。
[00巧]而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE=FIuA-MDCK組細胞在第8稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。 陽076] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應。
[0077] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對 照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得ICs。，ICs。與TD5。相比獲得TI:組合 物抑制FluA在MDCK細胞發(fā)生CPE，ICs。為2II'48,TI為617. 4;化合物III的ICw為2 4'si， TI為 4. 1 ;化合物IV的ICso為 2 "3,TI為 3. 7。
[0078] 結論：組合物對甲型流感病毒具有很強的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒 沒有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒 感染疾病中沒有應用背景。
[0079] 實施例6本發(fā)明所設及組合物片劑的制備
[0080] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0081] 實施例7本發(fā)明所設及組合物膠囊的制備
[0082] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100 粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為15%和85%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為：將化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照質(zhì)量百分數(shù)分別為15%和85%充分混合。3. -種如權利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述病毒為甲型 流感病毒。5. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述病毒為單純 皰疹病毒。6. 如權利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述病毒為呼吸 道合胞病毒。7. 如權利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒為單純皰疹病毒1型或者單純皰癥病毒2型。8. 如權利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒1型為單純痕疼病毒1型的Sm44株。9. 如權利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒2型為單純皰癥病毒2型333株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【IPC分類】A61P31/22, A61K31/4192, C07D249/04, A61P31/16, C07D233/60, A61K31/4164
【公開號】CN105343065
【申請?zhí)枴緾N201510761006
【發(fā)明人】王卓婷
【申請人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月10日