一種制備聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟瓣膜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù) 合人工心臟瓣膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心臟瓣膜疾病是危及人類健康的一種重要疾病，心臟瓣膜的鈣化及纖維化導(dǎo)致左 心室流出道梗塞和主動(dòng)脈瓣重度狹窄，至今未有任何外科手術(shù)及藥物可治愈鈣化瓣膜病變 等疾病，唯一可行的辦法是瓣膜置換，現(xiàn)在應(yīng)用于臨床的人工瓣膜包括機(jī)械瓣膜和生物瓣 膜。然而機(jī)械瓣膜置換術(shù)后需終生服用抗凝血藥物，否則會(huì)出現(xiàn)血栓等并發(fā)癥?？紤]到機(jī) 械瓣膜植入體內(nèi)會(huì)引起不良反應(yīng)，生物瓣膜于20世紀(jì)70年代產(chǎn)生并逐漸發(fā)展起來(lái)?，F(xiàn)在， 可行的生物心臟瓣膜有以下幾種類型：豬異種瓣膜、牛心包瓣膜、同種異體瓣膜（也叫同種 移植，來(lái)源于捐贈(zèng)人）和自身移植物（源于自體患者的組織）。同種異體移植和異種移植能 夠誘發(fā)纖維組織的生長(zhǎng)，可以將阻塞性血栓的發(fā)病率控制在〇. 2-1. 8%之間，將瓣膜功能性 障礙疾病發(fā)病率控制在2~4%之間。但隨著移植時(shí)間的增加，生物瓣膜極易發(fā)生衰敗和鈣 化，平均壽命僅為7-20年，特別是對(duì)于青少年移植受體人群而言，將面臨著多次手術(shù)的痛 苦。因此，需要研制具有更好的結(jié)構(gòu)和生物性能的人工瓣膜，以滿足置換受體對(duì)瓣膜耐久性 強(qiáng)、組織相容性良好及無(wú)需終生抗凝血的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對(duì)當(dāng)前臨床上常用的人工機(jī)械瓣膜需終生服用抗凝藥及生物 瓣膜的鈣化和免疫排斥等問(wèn)題，提供一種制備聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟瓣膜的 方法，利用力學(xué)性能優(yōu)良的雞蛋膜蛋白質(zhì)纖維和生物相容性良好的聚乙二醇為原材料制備 復(fù)合層狀人工心臟瓣膜，并可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋膜的層數(shù)、聚乙二醇溶液的體積和濃度來(lái)控制復(fù) 合層狀人工心臟瓣膜的厚度和強(qiáng)度，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0005] -種制備聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟瓣膜的方法，該方法是以雞蛋膜和 聚乙二醇為原材料，首先通過(guò)光交聯(lián)方法制備聚乙二醇水凝膠包敷蛋白質(zhì)纖維的層狀復(fù)合 材料，然后利用分子交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，獲得所述聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟 瓣膜。該方法具體包括如下步驟：
[0006] (I)PEGDA的制備：由聚乙二醇（poly (ethylene glycol)，簡(jiǎn)寫(xiě)PEG)與丙稀酰氯 經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成并純化制備可光交聯(lián)的聚乙二醇雙丙稀酸酯（poly(ethylene glycol) diacrylate，簡(jiǎn)寫(xiě) PEGDA);
[0007] (2)雞蛋膜的預(yù)處理：將清潔后的雞蛋膜浸泡在PBS溶液中并置于4°C冰箱中儲(chǔ) 存，光交聯(lián)前將雞蛋膜剪裁成所需形狀和尺寸的樣品，并置于PEGDA預(yù)成膠溶液中浸泡30 分鐘以上；
[0008] (3)制備所需尺寸與厚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS)模板，在PDMS模板中央挖 空一個(gè)與雞蛋膜樣品相同形狀和尺寸的空白區(qū)域，將該P(yáng)DMS模板放在一片有Sigraacot# 涂層的載玻片上，然后在PDMS模板上的空白區(qū)域放置預(yù)處理后的雞蛋膜樣品，樣品上再 補(bǔ)充PEGDA預(yù)成膠溶液將PDMS模板中央空白區(qū)域填滿，在PDMS模板上面蓋上另一片有 SigmacoteK涂層的載玻片密封；
[0009] (4)利用冷白光或紫外光交聯(lián)，雞蛋膜表面的PEGDA預(yù)成膠溶液交聯(lián)形成PEG水 凝膠，最終形成PEG水凝膠包敷雞蛋膜的復(fù)合層狀材料；若采用的冷白光交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間為 1-2分鐘；若米用紫外光交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間為10-30分鐘。
[0010] (5)將步驟（4)所得復(fù)合層狀材料浸泡在分子交聯(lián)劑（如戊二醛）溶液中，化學(xué)交 聯(lián)后即獲得聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟瓣膜。
[0011] 上述步驟（2)中，雞蛋膜的清潔過(guò)程為：去除生雞蛋中的蛋黃和蛋清，從雞蛋氣室 處將雞蛋膜與蛋殼剝離后，使用去離子水清洗；然后使用酸液浸泡方法去除雞蛋膜上殘留 的碳酸鈣（CaCO 3)顆粒，再用去離子清洗干凈。使用酸液浸泡方法去除雞蛋膜上的0&〇)3顆 粒時(shí)，所采用的酸為濃度l-Smol/L的醋酸溶液，處理時(shí)間為2-12小時(shí)，處理溫度為4°C ;采 用該工藝保證酸處理后雞蛋膜蛋白質(zhì)纖維能夠完好保存下來(lái)，并且力學(xué)性能不受影響。
[0012] 上述步驟⑵中，將步驟（1)得到的PEGDA先制備成PEGDA預(yù)成膠溶液，所制備 的PEGDA預(yù)成膠溶液中，用于冷白光交聯(lián)的PEGDA預(yù)成膠溶液是含質(zhì)量百分比10-30% PEGDA(分子量 1000-3400g/mol)、體積百分比 1-2 % 三乙醇胺（triethanolamine， 簡(jiǎn)寫(xiě)ΤΕ0Α)、10 μ mol/L曙紅（Eosin Y)和體積百分比0. 375 % N-乙烯基吡咯烷酮 (N-vinylpyrrolidone，簡(jiǎn)寫(xiě)NVP)的PBS溶液；用于紫外光交聯(lián)的PEGDA預(yù)成膠溶液是含 3g/L Irgacure2959(2_hydroxy-4〇-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophe-none)的PBS 溶液。
[0013] 上述步驟（3)中，制作PDMS模板的厚度由所采用雞蛋膜的層數(shù)決定（單層雞蛋膜 的厚度為60-100 μ m)，PDMS模板厚度0· 3-lmm〇
[0014] 上述步驟（5)中，所述分子交聯(lián)劑為戊二醛溶液，戊二醛質(zhì)量百分比濃度為 0. 25-2% ;化學(xué)交聯(lián)時(shí)間為2-12小時(shí)。
[0015] 本發(fā)明設(shè)計(jì)原理如下：
[0016] 本發(fā)明通過(guò)光交聯(lián)聚乙二醇水凝膠包敷雞蛋膜蛋白質(zhì)纖維制成復(fù)合材料，進(jìn)一步 利用分子交聯(lián)劑（如戊二醛）交聯(lián)而制備復(fù)合層狀人工心臟瓣膜。本發(fā)明以雞蛋膜和聚乙 二醇為原料，其中雞蛋膜來(lái)源豐富，由蛋白質(zhì)纖維組成；而聚乙二醇是較為常用的具有良好 生物相容性和生物惰性的高分子材料，另外通過(guò)光交聯(lián)法制得聚乙二醇水凝膠不僅保證了 人工瓣膜材料的一體性，而且保護(hù)了包敷的蛋白質(zhì)纖維阻止其體內(nèi)被酶解降解，且防止人 工瓣膜的鈣化。此外，可通過(guò)改變包覆的雞蛋膜數(shù)量以及聚乙二醇水凝膠的濃度和體積來(lái) 控制瓣膜材料的厚度和強(qiáng)度，以滿足不同患者的個(gè)體需求。該種方法所制備的人工心臟瓣 膜材料模仿了人體主動(dòng)脈瓣的層狀結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了與其相近的力學(xué)性能，同時(shí)保證了良好的 生物相容性，可滿足置換受體對(duì)瓣膜耐久性強(qiáng)、組織相容性良好及無(wú)需終生抗凝血的需求。
[0017] 與現(xiàn)有心臟瓣膜制備技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0018] 1、本發(fā)明以雞蛋膜作為內(nèi)層材料實(shí)現(xiàn)與人體瓣膜相似的機(jī)械性能；外層包敷 PEGDA水凝膠提供良好的生物相容性和生物惰性，且保護(hù)內(nèi)層的蛋白質(zhì)纖維不被酶降解。
[0019] 2、本發(fā)明提出的聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合人工心臟瓣膜，可以克服現(xiàn)有機(jī)械瓣 需要終生使用抗凝藥以及生物瓣膜體內(nèi)降解和鈣化等問(wèn)題。
[0020] 3、本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)依據(jù)所加蛋膜層數(shù)和聚乙二醇溶液體積來(lái)制備不同厚度和強(qiáng) 度的復(fù)合層狀人工心臟瓣膜。所制備瓣膜材料的厚度可以根據(jù)需求制成厚度為〇. 3-1_。 所制備瓣膜材料的力學(xué)強(qiáng)度由所加入的雞蛋膜的層數(shù)、PEGDA水凝膠的體積和濃度決定。所 制備瓣膜材料的彈性模量多3. 3MPa，延伸率大于35%。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為原始雞蛋膜的蛋白質(zhì)纖維的掃描電鏡照片；其中：(a)為雞蛋膜外層；(b) 為雞蛋膜內(nèi)層。
[0022] 圖2為PDMS模版法制備聚乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合層狀結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023] 圖3為采用4層雞蛋膜與質(zhì)量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的聚 乙二醇-蛋白質(zhì)纖維復(fù)合層狀材料（分子交聯(lián)劑處理前）。
[0024] 圖4為采用4層雞蛋膜與質(zhì)量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的人 工心臟瓣膜（分子交聯(lián)劑處理后）。
[0025] 圖5為4層雞蛋膜與質(zhì)量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的人工心 臟瓣膜經(jīng)戊二醛交聯(lián)后在小鼠皮下包埋2周后周圍組織切片的HE染色照片；其中：（a)為 4倍放大圖；(b)為10倍放大圖。
[0026] 圖6為4層雞蛋膜與質(zhì)量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備400 μm厚的人工心 臟瓣膜經(jīng)戊二醛交聯(lián)后及在I型膠原酶中浸泡2周之后的彈性模量。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0028] 本發(fā)明是以雞蛋膜和聚乙二醇為原材料，蛋膜是由富含膠原蛋白和角蛋白的纖維 組成的網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)將蛋膜的蛋白質(zhì)纖維與聚乙二醇水凝膠復(fù)合制備人工心臟瓣膜。 本發(fā)明主要工藝流程為：蛋膜原材料一去除CaCO 3顆粒一PDMS模版制作一雞蛋膜纖維與 PEGDA水凝膠光交聯(lián)一分子交聯(lián)劑化學(xué)交聯(lián)一人工心臟瓣膜。具體過(guò)程如下：由聚乙二醇 (PEG，平均分子量3350g/mol)與丙烯酰氯反應(yīng)制備聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEGDA) [Zhang Xj Xu B，Puperi DSj Yonezawa AL, Wu Yj Tseng H，Cuchiara ML，West JLj Grande-Alien KJ. Integrating Valve-Inspired Design Features Into Poly (ethylene glycol) Hydrogel Scaffolds for Heart Valve Tissue Engineering. Acta Biomaterialia 2015 ； 14:11-21.]。去除生雞蛋中的蛋黃和蛋清，從雞蛋氣室處將雞蛋膜小心剝離，去離子水清 洗3次，將蛋膜浸泡在醋酸溶液去除蛋膜上的CaCO 3顆粒（保存了雞蛋膜原始蛋白質(zhì)纖維 結(jié)構(gòu)，圖I)，4°C下儲(chǔ)存于PBS溶液中。光交聯(lián)前將上述雞蛋膜浸泡于PEGDA溶液中30分 鐘以上。采用常規(guī)方法制備不同厚度