用于在脊椎動(dòng)物個(gè)體中促進(jìn)支架生物功能和傷口愈合的治療性病毒微粒的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于在脊椎動(dòng)物個(gè)體中促進(jìn)支架生物功能和傷口愈合的治 療性病毒微粒
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)和f獻(xiàn)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年4月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/811，203的優(yōu)先權(quán)。將這 個(gè)優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的內(nèi)容在此整體并入。
[0003] 本申請(qǐng)還含有呈電子形式的序列表。這個(gè)序列表的內(nèi)容整體并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開(kāi)涉及將治療性核酸分子特異性和局部性遞送到脊椎動(dòng)物宿主的細(xì)胞中以 促進(jìn)受損血管的修復(fù)以及用于傷口愈合應(yīng)用。由聚合病毒微粒提供治療性核酸分子，從而 允許基因工程化桿狀病毒的受控釋放。可以任選地將病毒微粒配制于藥物組合物中和/或 包含于用于定位在傷口部位的載體中。
【背景技術(shù)】
[0005] 經(jīng)皮經(jīng)血管冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)和安裝支架是治療冠狀動(dòng)脈疾病的最常用的介 入程序之一。這種治療形式的常見(jiàn)的長(zhǎng)期并發(fā)癥是支架再狹窄（ISR)現(xiàn)象，其發(fā)生在動(dòng)脈 粥樣硬化病變部位，導(dǎo)致在20-30%的患者中在安裝支架6個(gè)月內(nèi)擴(kuò)張的動(dòng)脈發(fā)生阻塞。這 個(gè)多因素性病理學(xué)事件的主要成因是動(dòng)脈內(nèi)襯中內(nèi)皮痊愈不完全和血管SMC增殖。已經(jīng)使 用幾種方法來(lái)改善支架設(shè)計(jì)和耐久性，如使用經(jīng)過(guò)涂覆的支架來(lái)提高支架材料的生物相容 性，以及使用冠狀動(dòng)脈內(nèi)輻射來(lái)抑制炎癥和平滑肌細(xì)胞增殖。輻射療法雖然有效，但是伴有 愈合延期和內(nèi)皮痊愈不完全；而經(jīng)過(guò)涂布的支架在消除所述問(wèn)題方面還沒(méi)有完全成功。
[0006] 已經(jīng)將引入藥物洗脫支架（DES)視為對(duì)現(xiàn)有支架設(shè)計(jì)的明顯改善。所用藥物大 部分具有抗增殖性，其靶向平滑肌細(xì)胞增殖和相關(guān)炎癥系統(tǒng)。但是直接使用這些化學(xué)因素 受限于與以下相關(guān)的問(wèn)題：藥物洗脫、其對(duì)非標(biāo)靶細(xì)胞的無(wú)意作用，以及藥物對(duì)血管細(xì)胞分 裂的未經(jīng)過(guò)選擇的抑制從而導(dǎo)致安裝支架的血管內(nèi)皮痊愈不完全。此外，證明晚期支架血 栓形成的提高的風(fēng)險(xiǎn)的DES研究的最近長(zhǎng)期元分析已經(jīng)提出DES的長(zhǎng)期安全性的問(wèn)題。因 為狹窄癥的病理學(xué)復(fù)發(fā)主要起源于由支架植入引起的內(nèi)皮細(xì)胞襯里傷害和功能障礙，所以 有助于再內(nèi)皮化加速的方法可具有明顯的重要性，以降低ISR和晚期支架內(nèi)血栓形成的風(fēng) 險(xiǎn)。此外，這種策略將規(guī)避停止另外為DES植入后所需的抗血小板藥物療法所造成的有害 后果。已經(jīng)提出通過(guò)轉(zhuǎn)移促血管新生性血管基因如Vegf來(lái)治療性誘導(dǎo)血管細(xì)胞以促進(jìn)再 內(nèi)皮化為減弱新生內(nèi)膜形成和減少再狹窄的有效方式。Vegf細(xì)胞因子是與酪氨酸激酶受 體1和2結(jié)合、幾乎僅在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)并且廣泛用于受損血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的選擇性增生和 修復(fù)的內(nèi)皮特異性有絲分裂因子家族。雖然哺乳動(dòng)物病毒載體已經(jīng)有效地用于血管基因療 法，但是由于與包括復(fù)制勝任病毒和適當(dāng)最優(yōu)化人對(duì)這些病原體的耐受水平的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的 安全問(wèn)題，因此臨床應(yīng)用受限。此外，由于高病毒效價(jià)、天生毒性和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)，以及病 毒整合到宿主基因組中的固有風(fēng)險(xiǎn)，因此存在與免疫原性相關(guān)的問(wèn)題。另一方面，非病毒基 因遞送系統(tǒng)主要受限于低的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移效率。
[0007] 傷口愈合是復(fù)雜的生理事件，其使得損傷組織由新的組織替代。傷口的充分愈合 需要傷口附近的細(xì)胞的增殖和/或反分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和/或重構(gòu)，而且一旦疤 痕已經(jīng)形成便返回靜止?fàn)顟B(tài)（細(xì)胞分化、停止增殖并停止基質(zhì)重構(gòu)）。在一些病理學(xué)情況 下，愈合過(guò)程返回靜止?fàn)顟B(tài)失敗或延遲并因此促進(jìn)了細(xì)胞增殖、異常量的細(xì)胞外基質(zhì)（例 如過(guò)多或過(guò)少）的產(chǎn)生，并且甚至可以導(dǎo)致形成病理學(xué)瘢痕（例如皮膚的營(yíng)養(yǎng)不良性/肥 厚性瘢痕、大血管的再狹窄）。
[0008] 在傷口愈合過(guò)程易于誘導(dǎo)病理學(xué)副作用的情況下（例如在支架再狹窄中），將期 望具備可通過(guò)在傷口附近局部提供治療核酸分子以由宿主的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)而有利于體內(nèi)平衡 性傷口愈合過(guò)程的基因遞送系統(tǒng)。因?yàn)閭谟系倪^(guò)程是在特定的時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行的，所以 在一些實(shí)施方案中，將非常期望具備允許治療性核酸分子在傷口愈合過(guò)程期間暫時(shí)性轉(zhuǎn)導(dǎo) 的基因遞送系統(tǒng)。另外，因?yàn)閭谕ǔＯ抻谒拗魃砩系奶囟ㄎ恢茫栽谝恍?shí)施方案中， 將非常期望具備特異性允許治療性核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)到傷口附近的基因遞送系統(tǒng)。優(yōu)選地，所述基 因遞送系統(tǒng)限制并且在一些實(shí)施方案中阻止了與所述治療核酸分子轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本公開(kāi)提供病毒微粒，其中使用嵌埋的基因工程化桿狀病毒以將治療性核酸分子 遞送到脊椎動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞中?？蓪⒉《疚⒘Ｅ渲圃谒幬锝M合物中并且任選地包含于載體 中。所述病毒微粒有利于血管的充分修復(fù)以及傷口愈合。
[0010] 根據(jù)第一方面，本公開(kāi)提供一種用于將重組型治療性核酸分子遞送到脊椎動(dòng)物個(gè) 體的細(xì)胞中的病毒微粒。所述病毒微粒包含可生物降解的生物相容性聚合物的基質(zhì)作為第 一組分。病毒微粒進(jìn)一步包含至少一個(gè)（或在一個(gè)實(shí)施方案中是多個(gè)）基因工程化桿狀病 毒作為第二組分，所述基因工程化桿狀病毒具有包含/編碼重組型治療性核酸分子的病毒 基因組并且沒(méi)有在脊椎動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞中復(fù)制的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，可生物降解的 生物相容性聚合物是/包含聚酯。在另一實(shí)施方案中，所述聚酯是/包含乳酸-羥基乙酸 共聚物（P〇ly(lactic-co_glycolicacid))。在又一個(gè)實(shí)施方案中，基因工程化桿狀病毒來(lái) 自核型多角體病毒屬，并且在又一個(gè)實(shí)施方案中，基因工程化桿狀病毒是多粒包埋型病毒 (multicapsidvirus)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，基因工程化桿狀病毒來(lái)自亞型苜蓿丫紋夜蛾 多粒包埋型核型多角體病毒屬（AcMNPV)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因工程化桿狀病毒至少部 分嵌埋在基質(zhì)中。在另一實(shí)施方案中，重組型核酸分子編碼生長(zhǎng)因子，如血管生成性生長(zhǎng)因 子（例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF))。在另一實(shí)施方案中，基因工程化桿狀病毒進(jìn)一步包 含覆蓋桿狀病毒表面的至少一部分的陽(yáng)離子聚合物涂層。在另一實(shí)施方案中，陽(yáng)離子聚合 物是/包含樹(shù)枝狀聚合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，樹(shù)枝狀聚合物是/包含聚（酰胺基胺） (PAMAM)，如G0PAMAM。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒微粒的相對(duì)直徑為約5μm和約10μm。
[0011] 第二方面，本公開(kāi)提供一種用于制備將重組型治療性核酸分子遞送到脊椎動(dòng)物個(gè) 體的細(xì)胞中的病毒微粒的方法。大體上，所述方法包括（a)將具有包含重組型治療性核酸 分子的病毒基因組的經(jīng)基因修飾的桿狀病毒再懸浮在水溶液中以獲得水性制劑；(b)合并 并均質(zhì)化步驟（a)的水性制劑與可生物降解的生物相容性聚合物和與水不混溶的揮發(fā)性 有機(jī)溶劑的溶液以形成油包水（w/o)乳劑；（c)合并并攪拌（并任選地均質(zhì)化）步驟（b)的 油包水乳劑與油以形成油包油包水（w/o/o)乳劑；以及（d)從步驟（c)的油包油包水乳劑 蒸發(fā)所述與水不混溶的揮發(fā)性有機(jī)溶劑以形成病毒微粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn) 一步包括（e)復(fù)原并洗滌在步驟（d)中獲得的病毒微粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，油進(jìn)一步包 含表面活性劑，如非離子表面活性劑。在另一實(shí)施方案中，油是植物油。在又一個(gè)實(shí)施方案 中，方法進(jìn)一步包括在步驟（a)之前用陽(yáng)離子聚合物涂布，至少部分地涂布，經(jīng)基因修飾的 桿狀病毒。
[0012] 第三方面，本公開(kāi)提供一種通過(guò)本文所述的方法獲得的用于將重組型治療性核酸 分子遞送到脊椎動(dòng)物個(gè)體中的病毒微粒。
[0013] 第四方面，本公開(kāi)提供一種藥物組合物，其具有（i)膠凝劑和（ii)本文所述的或 通過(guò)本文所述的方法獲得的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，膠凝劑包含蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)片 段，如纖維蛋白原和/或纖維蛋白。
[0014] 第五方面，本公開(kāi)提供一種配制本文所述的藥物組合物的方法。大體上，所述方法 包括合并膠凝劑與病毒微粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括交聯(lián)膠凝劑。
[0015] 第六方面，本公開(kāi)提供一種用于制備本文所述的藥物組合物的試劑盒。所述試劑 盒包含本文所述的膠凝劑和本文所述的病毒微粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可進(jìn)一步包 含交聯(lián)劑。
[0016] 第七方面，本公開(kāi)提供一種載體，其包含本文所述的或通過(guò)本文所述的方法獲得 的病毒微粒?；蛘撸d體包含本文所述的或通過(guò)本文所述的方法制備的藥物組合物。在一 個(gè)實(shí)施方案中，載體是固體。在另一實(shí)施方案中，載體是金屬性的。在又一個(gè)實(shí)施方案中， 載體是醫(yī)學(xué)植入物，如支架。
[0017] 第八方面，本公開(kāi)提供一種促進(jìn)有需要的脊椎動(dòng)物個(gè)體傷口愈合的方法。所述方 法包括將治療有效量的至少一種以下物質(zhì)放在傷口附近以有利于脊椎動(dòng)物個(gè)體的傷口愈 合：本文所述的病毒微粒、通過(guò)本文所述的方法獲得的病毒微粒、本文所述的藥物組合物、 通過(guò)本文所述的方法獲得的藥物組合物或所述載體。本文還涵蓋用于促進(jìn)有需要的脊椎動(dòng) 物個(gè)體的傷口愈合的本文所述的病毒微粒、通過(guò)本文所述的方法獲得的病毒微粒、本文所 述的藥物組合物、通過(guò)本文所述的方法獲得的藥物組合物或本文所述的載體，以及本文所 述的病毒微粒、通過(guò)本文所述的方法獲得的病毒微粒、本文所述的藥物組合物、通過(guò)本文所 述的方法獲得的藥物組合物或本文所述的載體用于促進(jìn)有需要的脊椎動(dòng)物個(gè)體的傷口愈 合的用途。
[0018] 附圖簡(jiǎn)沐
[0019] 因此已經(jīng)大體描述了本公開(kāi)的性質(zhì)，現(xiàn)將參考以說(shuō)明方式顯示其優(yōu)選實(shí)施方案的 附圖，并且其中：
[0020] 圖1提供了減弱ISR的病毒負(fù)載生物活性支架的設(shè)計(jì)、配制和作用方式的示意圖。 (A)帶有編碼血管生成轉(zhuǎn)基因（Vegf)的示例性治療性核酸分子的嵌埋病毒釋放到粘附血 管壁。（B)轉(zhuǎn)基因局部過(guò)表達(dá)以增強(qiáng)內(nèi)皮再生。（C)用再生的內(nèi)皮單層適當(dāng)緩沖內(nèi)膜層以 通過(guò)避免進(jìn)一步暴露于血液來(lái)降低平滑肌增生和血栓形成所致的再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)。隨時(shí)間流 逝，由于聚合物的可生物降解性質(zhì)，支架失去其涂層，使得裸支架支柱留在在已經(jīng)修復(fù)的血 管片段中。（D)Bac-PAMAM復(fù)合物的產(chǎn)生和其隨后通過(guò)w/o/o雙重乳化溶劑蒸發(fā)法在PLGA 微球中微囊封的示意圖。
[0021] 圖2說(shuō)明了病毒負(fù)載PLGA微球的SEM(A和A'）和AFM(B和B'）顯微照片，其顯示 了通過(guò)本文所述的方法的一個(gè)實(shí)施方案（并且在圖ID中有說(shuō)明）所制備的表面形態(tài)?？?微球（C)和病毒負(fù)載微球（D)的TEM照片。（E)呈現(xiàn)了負(fù)載有病毒的微球在TEM下的超薄 內(nèi)部橫截面。注意：嵌埋病毒在TEM照片中具有圓形，因?yàn)轱@微照片是在病毒負(fù)載微球的切 割橫截面上的單一平面上所照。
[0022] 圖3說(shuō)明PLGAMS涂布的纖維蛋白支架的表征。⑷未涂布的裸金屬支架、（B)在 涂布之后含尼羅紅的MS負(fù)載的支架以及（C)在卷在氣囊導(dǎo)管上之后的膨脹支架。（D)顯 示嵌埋在纖維蛋白支架表面上的熒光PLGAMS的支架熒光圖像。（E)裸金屬支架、（F)纖維 蛋白涂布的支架以及（Gi和ii)PLGAMS負(fù)載的纖維蛋白涂布的支架的SEM顯微照片。（G ii)中的圖像是（Gi)中插圖的放大圖像。（H)自用不同濃度（50mg/mL和100mg/mLDCM) 的通過(guò)w/o/w和w/o/o方法制備的PLGAMS涂布的支架的累積桿狀病毒釋放（按照初始負(fù) 載病毒％ )顯示病毒負(fù)載在24小時(shí)的受控釋放隨PLGA濃度和MS制備方法而變。將結(jié)果示 為隨孵育后小時(shí)數(shù)而變的活性病毒累積釋放的百分比。示出了通過(guò)油包油包水方法（?) 或水包油包水方法（)獲得的MS桿狀病毒（50)以及通過(guò)油包油包水方法（▲)或水包 油包水方法（X)獲得的MS桿狀病毒（100)的結(jié)果。
[0023] 圖4說(shuō)明用PAMAM樹(shù)枝狀聚合物（G0)對(duì)桿狀病毒進(jìn)行表面修飾。Bac-PAMAM(O) (游離Bac)、Bac_PAMAM(0. 01)、Bac-PAMAM(0· 1)、Bac_PAMAM(0. 5)和Bac-PAMAM(1. 0)的ζ 電位(mV) (Α)和粒度（ηΜ) (Β)，其中括號(hào)內(nèi)的值表示PAMAM分子（ymol)/10s個(gè)病毒的比率。 由平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。懸浮于PBS中的游離Bac(C)和Bac_PAMAM(0. 5) (D) 的TEM圖像。箭頭表示帶正電的PAMAM樹(shù)枝狀聚合物涂層在帶負(fù)電的桿狀病毒表面上形成 雜合納米結(jié)構(gòu)。標(biāo)度表示長(zhǎng)l〇〇nm。
[0024] 圖5說(shuō)明PLGA囊封的Bac的表征。（A)有或無(wú)PAMAM涂層的情況下，PLGA囊封 的BacMGFP的動(dòng)力學(xué)。在PBS中孵育具有含有 0μπιο1、0· 01μπιο1、0· 1μπιο1、0· 5μπιο?和 l.OymolPAMAM分子/10s個(gè)桿狀病毒的囊封病毒制劑的所制備的支架。在指定時(shí)間，收集 PBS并且將其用于使用實(shí)施例部分中所提及的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)HASMC。將結(jié)果示為在轉(zhuǎn)導(dǎo) 之后12小時(shí)、18小時(shí)或24小時(shí)每一類(lèi)型的囊封桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)表示 為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（η= 3)。（B-E)呈現(xiàn)在熒光視場(chǎng)下的轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，而 (Β' -Ε'）呈現(xiàn)相應(yīng)的明視場(chǎng)。（F)分析在孵育12小時(shí)之后上述囊封對(duì)HASMC的細(xì)胞毒性 作用。根據(jù)隨囊封桿狀病毒的類(lèi)型而變的活細(xì)胞百分比來(lái)表示不同組的數(shù)據(jù)。**=與對(duì)照 Bac組（η= 3)相比Ρ〈0. 01。
[0025] 圖6說(shuō)明了血清和存放溫度對(duì)BacMGFP負(fù)載支架的生物活性的影響。 8&〇]\0^^^嫩113、83〇]\0^]^和83〇]\0^支架在50%血清或？83溶液中孵育1小時(shí)之 后用于使用如實(shí)施例I中提及的標(biāo)準(zhǔn)方法在96孔板中轉(zhuǎn)導(dǎo)每孔2X104個(gè)HASMC。類(lèi)似地， BacMGFP-PAMAMMS支架在不同溫度（4°C、-20°C、-80°C和新鮮制備的對(duì)照）下存放3個(gè) 月之后用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)HASMC。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的MGFP表達(dá)來(lái)表示數(shù)據(jù)，將BacMGFP-PAMAMMS 表達(dá)視為100% (A)，并且將新鮮制備的支架表達(dá)視為100% (B)。數(shù)據(jù)表示為平均值土 標(biāo)準(zhǔn)偏差（η= 3)。由*** =p〈0. 001和** =P〈0. 01表示組內(nèi)統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，而由 Ψ〈0. 001 (PBS)和#〈0. 001 (血清）表示組間條件匹配的差異。
[0026] 圖7說(shuō)明了來(lái)自囊封桿狀病毒的治療性核酸分子的釋放和表達(dá)。（Α)如通過(guò)ELISA 檢測(cè)的由轉(zhuǎn)導(dǎo)HASMC隨時(shí)間釋放的VEGF的定量。對(duì)各種類(lèi)型的桿狀病毒，將結(jié)果示為隨轉(zhuǎn) 導(dǎo)后天數(shù)而變的釋放的VEGF(ng/mL) (Bac-PAMAM=?，僅Bac=，并且對(duì)照=▲ )。（B) 在來(lái)自BacVegf-PAMAM(有或無(wú)抗VEGFAb)和BacVegf轉(zhuǎn)導(dǎo)的HASMC的條件化培養(yǎng)基的 存在下生長(zhǎng)的HUVEC的增殖情況。作為對(duì)照，取來(lái)自非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞（對(duì)照）的CM。初始種子 密度為在96孔板中每孔2X104個(gè)細(xì)胞并且在第3天通過(guò)比色分析檢測(cè)細(xì)胞增殖。示出了 從不同類(lèi)型的桿狀病毒（對(duì)照、僅BacVegf、BacVegf-PAMAM(0· 5)、以及BacVegf-PAMAM 和抗VEGF抗體）獲得的第4天條件化培養(yǎng)基的結(jié)果。ANOVA:由*林=Ρ〈0· 001和** = P〈0. 01表示組中與對(duì)照相比明顯更大的值。（C)體外傷口愈合分析中的HUVEC迀移的誘導(dǎo)。 將結(jié)果示為隨不同類(lèi)型的囊封桿狀病毒或?qū)φ眨▽?duì)照、僅BacVegf、BacVegf-PAMAM、或者 Vegf-PAMAM與抗VEGF抗體）而變的傷口愈合的百分比。用細(xì)胞刮刀使HUVEC細(xì)胞單層受 傷并且用來(lái)自上述組的CM進(jìn)行處理。在處理24小時(shí)之后對(duì)HUVEC拍照（200倍），并且使 用ImageJ軟件來(lái)分析由迀移細(xì)胞覆蓋的刮損區(qū)域（由白色邊界虛線標(biāo)記）的百分比（C i=對(duì)照的代表性圖像、ii=僅BacVegf的代表性圖像、iii=BacVegf-PAMAM的代表性 圖像，并且iv=BacVegf-PAMAM和抗VEGF抗體的代表性圖像）。（D)來(lái)自上述組的CM對(duì) 體外管形成的影響。在與HUVEC共培養(yǎng)18小時(shí)之后，評(píng)價(jià)管形成。圖示出相對(duì)管長(zhǎng)（μπι) (將BacVegf視為100% )(Di)和對(duì)毛細(xì)管小管數(shù)目的計(jì)數(shù)（Dii)。數(shù)據(jù)表示三個(gè)獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。（Diii-vi)如使用熒光顯微鏡在100倍放大率下考查，與未受刺 激的對(duì)照（iii)和Ab處理（vi)組相比，在BacVegf-PAMAM(v)和BacVegf(iv)組中觀測(cè)到 適當(dāng)形成的管狀結(jié)構(gòu)。
[0027] 圖8說(shuō)明了在犬類(lèi)模型中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)程序和結(jié)果。首先使用夾子從正常血 流分離股動(dòng)脈（Ai)。然后用PBS沖洗所選部分，接著使用氣囊導(dǎo)管進(jìn)行重度氣囊損傷（A ii)。這之后將卷曲的聚合物涂布支架插入受損動(dòng)脈中。使帶有支架的氣囊導(dǎo)管膨脹以將 支架植入所述部位。這之后放氣并且取出氣囊導(dǎo)管（Aiii)。（B)動(dòng)脈中的hVegf轉(zhuǎn)基因 遞送和表達(dá)。對(duì)從安裝支架的血管段取回的組織進(jìn)行RT-PCR以鑒別hVegf基因、檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。在支架植入后2周，在涂布（+)組中，VEGF轉(zhuǎn)錄物仍存在于安裝支架的動(dòng)脈的近端 (P)、中間（M)和遠(yuǎn)端（D)部分中。但是在第2周和第16周，在距離安裝支架部分的近端 (P'）和遠(yuǎn)端（D'）lcm的動(dòng)脈段中，以及在涂布（-)對(duì)照組中，都檢測(cè)不到轉(zhuǎn)錄物。重要地， 到第16周，在涂布（+)組中轉(zhuǎn)錄物也消失，證實(shí)病毒系統(tǒng)的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)。（C)在布 署支架后第2周，在安裝支架的動(dòng)脈的近端（i)、中間（ii)和遠(yuǎn)端（iii)部分中，以及在對(duì) 照動(dòng)脈（iv)中，VEGF在安裝支架的股動(dòng)脈內(nèi)的免疫組織化學(xué)定位。將涂布（-)視為對(duì)照。 主要在內(nèi)膜層和外中間層中注意到VEGF表達(dá)。請(qǐng)注意，表達(dá)主要發(fā)生在支柱區(qū)域（白色虛 線），在此支架表面接觸動(dòng)脈內(nèi)襯，在新生內(nèi)膜區(qū)域中的表達(dá)不明顯，表明從支架表面的基 因轉(zhuǎn)移僅發(fā)生在布署的極早階段。
[0028] 圖9說(shuō)明了在支架植入之后的血管再內(nèi)皮化。（A)伊文思藍(lán)染色證實(shí)涂布（+)組 (i)能夠通過(guò)內(nèi)皮化使損傷修復(fù)，而在涂布（_)組（ii)中，傷口仍暴露于高的伊文思藍(lán)攝取 量。沒(méi)損傷的對(duì)照動(dòng)脈段沒(méi)有顯示染料攝取的跡象（iii)。（B)在涂布（+)組和涂布（_) 組中在染色之后第2周使用成像軟件對(duì)再內(nèi)皮化百分比進(jìn)