包含免疫刺激性寡核苷酸的新穎疫苗組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于增強利什曼蟲和馬病毒疫苗的免疫反應的新穎佐劑。
【背景技術】
[0002] 馬皰疹病毒是造成病毒誘發(fā)的流產、神經疾?。ㄖT如輕癱）、上呼吸道感染以及新 生馬駒疾病（NFD)的主要的馬病原體。NFD由接近產期的胎兒經胎盤感染引起，這些胎兒出 生時很虛弱，患有嚴重呼吸疾病并且一些因EHV-1所致的肝感染而帶有黃疸。這些動物通 常在出生后幾天內死亡。馬鼻肺炎病毒（EHV-4)是急性呼吸道疾?。?鼻肺炎"）的主要原 因并且使大多數(shù)馬在其生命的最初兩年期間受感染。鼻肺炎的特征為發(fā)燒、厭食以及大量 漿液性鼻涕，其稍后變成粘液膿性的。在很少情況下，EHV4感染導致懷孕的母馬流產。此 外，EHV1和EHV4建立持久的終身潛伏性感染。在重新活化后，病毒引起復發(fā)性疾病，伴隨 有病毒脫落并且傳播至其它動物。
[0003]馬皰疹病毒感染和其疾病的控制仍然是不足的，特別是針對EHV1介導的流產、輕 癱以及由接近產期的胎兒經胎盤感染引起的新生馬駒疾病。盡管滅活的以及修飾活的疫苗 是可用的，但沒有一種疫苗似乎能充分地阻斷感染，也不能阻止由野生型病毒建立潛伏期。 因此，非常需要對這些病毒的田間感染、特別是對EHV1引起的感染具有改善的防護的安全 疫苗。
[0004] 利什曼蟲病是人類、犬科動物（狗、狼、狐貍、郊狼、豺）以及貓科動物（獅、虎、 家貓、野貓、其它大型貓，以及其它貓科動物，包括獵豹和猞猁）的主要和嚴重的寄生蟲疾 病。利什曼蟲病的作用物是原生動物寄生蟲并且屬于杜氏利什曼蟲復合體（leishmania donovanicomplex)。這種寄生蟲廣泛分布于南歐、非洲、亞洲、南美洲以及中美洲的溫帶 和亞熱帶國家（DesjeuxP.，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.，2001，95:239-43)。杜氏利什曼 蟲嬰兒亞種（Leishmaniadonovaniinfantum，L.infantum)在南歐、非洲以及亞洲造成貓 和犬疾病。在南美洲和中美洲，作用物是杜氏利什曼蟲恰加斯亞種（Leishmaniadonovani chagasi，L.chagasi)，其與杜氏利什曼蟲嬰兒亞種密切相關。在人類中，作用物是杜氏利什 曼蟲杜氏亞種（Leishmaniadonovanidonovani，L.donovani)，其與杜氏利什曼蟲嬰兒亞 種和杜氏利什曼蟲恰加斯亞種密切相關。
[0005] 這些寄生蟲引起內臟利什曼蟲病和/或皮膚利什曼蟲病。內臟利什曼蟲病導致如 發(fā)燒、惡病質、肝脾腫大（肝和脾的擴大）以及血細胞減少的臨床癥狀。皮膚利什曼蟲病以 變化的呈現(xiàn)形式出現(xiàn)，從自限并且甚至自愈的皮膚形式至致命的全身性疾病。皮膚利什曼 蟲病的病灶可以在身體上的任何地方出現(xiàn)，但最常見的部位是暴露于環(huán)境并且因此更易于 被沙蠅叮咬的那些。最初的丘疹快速地產生潰瘍。全身性利什曼蟲病是罕見的，但如果不 即時治療的話必定是致命的。全身性利什曼蟲病影響內部身體器官，特別是脾和肝。
[0006] 在犬中，疾病與皮膚癥狀或內臟癥狀相關聯(lián)或與皮膚和內臟癥狀兩者相關聯(lián)，并 且在缺乏療法的情況下是致命的。
[0007] 已經描述了眾多治療，但沒有一者是完全令人滿意的，這歸因于治療本身的毒性 或動物復發(fā)的趨勢。
[0008] 因此，需要新疫苗配方來保護家養(yǎng)動物免受EHV和利什曼蟲感染。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明解決了本領域的缺陷，這是通過在一個方面提供一種疫苗組合物，其包含 選自由EHV抗原或利什曼蟲抗原組成的群組的抗原組分和佐劑組分，其中這種佐劑組分包 含P類免疫刺激性寡核苷酸以及皂苷與留醇的組合；或包含油和任選的一種或多種乳化劑 的油相，所述油相占疫苗組合物的2-20%v/v。
[0010] 在一組實施方案中，可以經過修飾和/或穩(wěn)定的P類免疫刺激性寡核苷酸以每劑 20-500μg，例如每劑100-250μg的量存在。
[0011] 在一組實施方案中，佐劑組分包含皂苷，諸如QuilA或其純化的級分，和留醇，諸 如膽甾醇，各自以介于約5-100yg/ml之間的量存在。在一個特定實施方案中，QuilA和 膽甾醇中的每一者以50μg/ml的量存在。
[0012] 在另一個實施方案中，油和任選的至少一種乳化劑（例如，兩種乳化劑）存在，并 且油相占疫苗組合物的2-20%v/v(例如，約5%至約10% )。在一個特定實施方案中，油 是SP油。
[0013] 在本發(fā)明的某些實施方案中，疫苗配方是非脂質體。
【具體實施方式】
[0014] 提供以下非限制性定義用于更好地理解本發(fā)明：
[0015] "約"或"近似"當結合可測量的數(shù)值變量使用時，指的是變量的指示值和在指示值 的實驗誤差內（例如，在平均值的95%置信區(qū)間內）或在指示值的10%內（取較大者）的 變量的所有值，除非約是關于以周為單位的時間間隔使用，其中"約3周"是17至25天，并 且約2至約4周是10至40天。
[0016] "佐劑"意指增加對抗原的體液或細胞免疫反應的任何物質。佐劑一般用于實現(xiàn)兩 個目的：減緩抗原從注射部位的釋放，和刺激免疫系統(tǒng)。
[0017] "抗體"指的是作為對特異性抗原的免疫反應的結果可以結合至那種抗原的免疫 球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有"恒定"和"可變"區(qū)的"輕"和"重"多肽鏈組成的血清 蛋白并且基于恒定區(qū)的組成而分成幾類（例如，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM)。
[0018] "抗原"或"免疫原"指的是刺激免疫反應的任何物質。這個術語包括殺死的、滅活 的、減弱的或修飾活的細菌、病毒或寄生蟲。術語抗原還包括多核苷酸、多肽、重組蛋白、合 成肽、蛋白提取物、細胞（包括腫瘤細胞）、組織、多糖或脂質、或其片段，個別地或以其任何 組合形式。術語抗原還包括抗體，諸如抗獨特型抗體或其片段，以及可以模擬抗原或抗原決 定簇（表位）的合成肽模擬表位。
[0019] "菌苗"意指可以用作疫苗或免疫原性組合物的組分的一種或多種殺死的細菌的 懸浮液。
[0020] "緩沖液"意指防止另一種化學物質的濃度改變的化學系統(tǒng)，例如，質子供體和受 體系統(tǒng)充當防止氫離子濃度（pH)顯著改變的緩沖液。緩沖液的另一個實例是含有弱酸和 其鹽（共輒堿）或弱堿和其鹽（共輒酸）的混合物的溶液。
[0021] "細胞免疫反應"或"細胞介導的免疫反應"是由T淋巴細胞或其它白血球或兩者 介導的免疫反應，并且包括由活化的Τ細胞、白血球或兩者產生的細胞因子、趨化因子以及 類似分子的產生。
[0022] 如應用于佐劑配方的"基本上由……組成"指的是配方不含一定量的未列舉的額 外輔助或免疫調節(jié)劑，在這些量下所述試劑發(fā)揮可測量的輔助或免疫調節(jié)作用。
[0023] "劑量"指的是給予受試者的疫苗或免疫原性組合物。"第一劑量"或"引發(fā)疫苗" 指的是第〇天給予的這類組合物的劑量。"第二劑量"或"第三劑量"或"年劑量"指的是繼 第一劑量之后給予的這類組合物的量，其可能是或可能不是與第一劑量相同的疫苗或免疫 原性組合物。
[0024] "體液免疫反應"指的是由抗體介導的免疫反應。
[0025]受試者中的"免疫反應"指的是對抗原的體液免疫反應、細胞免疫反應、或體液和 細胞免疫反應的發(fā)展。免疫反應通?？梢允褂帽绢I域中已知的標準免疫試驗和中和試驗來 測定。
[0026] 抗原的"免疫保護量"或"免疫有效量"或"產生免疫反應的有效量"是有效誘導 接受者中的免疫原性反應的量。免疫原性反應可以充分用于診斷目的或其它測試，或可以 足以預防由疾病作用物的感染引起的疾病的征象或癥狀，包括對健康不利的影響或其并發(fā) 癥?？梢哉T導體液免疫或細胞介導的免疫或兩者。動物對免疫原性組合物的免疫原性反應 可以例如間接地經由測量抗體效價、淋巴細胞增殖試驗，或直接地經由在用野生型病毒株 攻擊后監(jiān)測征象和癥狀來評價，而由疫苗賦予的保護性免疫可以通過測量例如受試者的臨 床征象的減少來評價，這些臨床征象諸如死亡率、發(fā)病率、溫度準數(shù)、總體身體狀況以及總 體健康和表現(xiàn)。免疫反應可以包含（但不限于）細胞和/或體液免疫的誘導。
[0027] "免疫原性"意指引出免疫或抗原性反應。因此，免疫原性組合物將為誘導免疫反 應的任何組合物。
[0028] "免疫刺激性分子"指的是產生免疫反應的分子。
[0029] "脂質"指的是不可溶于水，但可溶于非極性有機溶劑，觸摸呈油性，并且與碳水化 合物和蛋白質一起構成活細胞的主要結構物質的一組有機化合物中的任一者，包括脂肪、 油、蠟、甾醇以及甘油三酯。
[0030] "醫(yī)藥學上可接受的"指的是在合理醫(yī)學判斷的范圍內適合用于與受試者的組織 接觸而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應等等，與合理的效益風險比相匹配，并且有效用于 其預期用途的物質。
[0031] "反應原性"指的是在受試者中對施用佐劑、免疫原性或疫苗組合物有反應而引發(fā) 的副作用。其可以在施用部位出現(xiàn)，并且通常依據許多癥狀的發(fā)展來評估。這些癥狀可以 包括發(fā)炎、發(fā)紅以及膿腫。其還依據出現(xiàn)情況、持續(xù)時間以及嚴重性來評估。"低"反應將例 如涉及僅可通過心悸檢測到并且不被眼睛檢測到，或將持續(xù)時間很短的膨脹。更嚴重的反 應將為例如眼睛可見或持續(xù)時間更長的反應。
[0032] "室溫"意指18至25°C的溫度。
[0033] "皂苷"指的是植物來源的一組表面活性糖苷，其由與甾體或三萜結構的疏水區(qū)締 合的親水區(qū)（通常是幾