從廣金錢草中提取總黃酮提取物的方法和測定廣金錢草中有效成分含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體的，本發(fā)明涉及一種從廣金錢草中提取總黃酮提 取物的方法和一種測定廣金錢草中有效成分含量的方法。
【背景技術】
[0002] 廣金錢草為豆科山螞幢屬植物Desmodium Styracifolium(Osbeck)Merr.，其藥用 部位為干燥地上部分，主要化學成分為黃酮、皂苷、多糖、生物堿等化合物。具有清熱除濕， 利尿通淋之功效。用于熱淋、沙淋、石淋、小便澀痛、水腫尿少、黃疸尿赤、尿路結石。
[0003] 夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3為廣金錢草中的有效成分，均屬于黃酮碳苷類 化合物，并且這三種成分含量較高。為了控制廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取物及其制 劑的質量，需要測定這三種成分的含量。
[0004] 然而，用于檢測廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取物及其制劑中多種有效成分 夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3含量的方法仍有待改進。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現有技術中的問題至少之一。
[0006] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的以下發(fā)現而完成的：
[0007] 現有技術中，采用色譜法測定廣金錢草提取物中各組分的含量，往往需要相應的 高純度標準品作對照，由于中藥化學對照品分離難度大或單體不穩(wěn)定難以供應或供應價格 高等因素，致使高純度的標準品不易獲得或獲得的成本較高，實際生產中難以大規(guī)模實施。 本發(fā)明的發(fā)明人通過超高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質譜聯用技術（uplc-dad-ms) 對廣金錢草總黃酮提取物進行色譜分離，并對各化合物進行峰歸屬及純度分析，最終選擇 對夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3三個成分進行含量測定。其中夏佛塔苷對照品可從 中檢院獲取，另外兩者為自制獲得，且因為夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3為廣金錢草 中的有效成分，并且這三種成分含量較高、分離度較好，故最終確定以夏佛塔苷對照品為對 照，采用"一測多評"（QAMS)法對夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3三個成分進行含量測 定。
[0008] 需要說明的是，高效液相色譜"一測多評"技術，是以夏佛塔苷為內標物，確立其與 Vicenin-I和Vicenin-3的相對校正因子、相對保留時間，從而實現用夏佛塔苷一種易得的 對照品同時測定廣金錢草藥材中夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3的含量，從而實現控制 廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取物及其制劑的藥品質量的目的。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種從廣金錢草中提取總黃酮提取物的方 法。根據本發(fā)明的實施例，該方法包括：將廣金錢草樣品與乙醇混合，并通過回流或超聲方 法進行提取，以便獲得總黃酮提取物，其中，所述乙醇的濃度為25~90%，所述廣金錢草的 重量與所述乙醇的體積比為25mg :25~100ml，優(yōu)選25mg :50ml。通過上述提取方法，既可 以確保完全提取廣金錢草中的總黃酮，提取效率高，又可以使得后期液相色譜分析中峰的 分離度良好。
[0010] 根據本發(fā)明的實施例，上述從廣金錢草中提取總黃酮提取物的方法可以進一步包 括下列附加技術特征至少之一：
[0011] 根據本發(fā)明的實施例，上述方法采用超聲方法進行提取10~40分鐘，優(yōu)選20分 鐘。通過上述超聲提取方法，既節(jié)約了提取時間，又確保了完全提取廣金錢草中的總黃酮， 使得提取效率高，利于黃酮的藥用和液相色譜分析。
[0012] 根據本發(fā)明的實施例，上述乙醇的濃度為75%。發(fā)明人驚奇的發(fā)現，廣金錢草樣品 在75%乙醇里面提取效率最高，且液相色譜分析中峰的分離度良好。
[0013] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種測定廣金錢草中有效成分含量的方法。 根據本發(fā)明的實施例，方法包括以下步驟：（1)按照前面所述的方法，從廣金錢草中提取總 黃酮提取物；（2)對所述總黃酮提取物進行高效液相色譜分析，并基于所得到的液相色譜 分析結果確定所述廣金錢草藥材中有效成分的含量。超高效液相色譜（UPLC)的方法，節(jié)約 了藥物分析的時間，而且使得流動相的使用量減少，方法更實用更環(huán)保。根據本發(fā)明的實施 例，上述測定廣金錢草中有效成分含量的方法能夠實現用夏佛塔苷一種易得的對照品同時 測定廣金錢草藥材中有效成分的含量，從而實現控制廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取 物及其制劑的藥品質量的目的。
[0014] 根據本發(fā)明的實施例，上述測定廣金錢草中有效成分含量的方法還可以進一步包 括下列附加技術特征之一：
[0015] 根據本發(fā)明的實施例，所述有效成分是夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3,其中， 所述Vicenin-I和Vicenin-3的含量是基于所述夏佛塔苷的含量以及預先確定的相對校正 因子確定的。發(fā)明人通過UPLC-DAD-MS法對廣金錢草總黃酮提取物進行色譜分離，并對各 化合物進行峰歸屬及純度分析發(fā)現，夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3三種成分在廣金錢 草中含量較高、分離度較好。從而通過對夏佛塔苷、Vicenin-I和Vicenin-3三個成分進行 含量測定，可實現控制廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取物及其制劑的藥品質量的目的。
[0016] 根據本發(fā)明的實施例，相對校正因子是通過下列步驟確定的：a、對照品溶液的制 備：精密稱取一定量的Vicenin-I、夏佛塔苷及Vicenin-3對照品，于同一 75%乙醇中超聲 溶解，配制成含Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3的對照品儲備液，再將所述對照品儲備 液按1 - 5,2 - 5,1 - 10,1 - 25,1 - 50的比例進行稀釋，得六種不同濃度的對照品溶 液，于4°C保存，備用；b、相對校正因子fsl的計算：取步驟（a)所得對照品溶液，進樣1微 升，用高效液相色譜測定色譜圖并進行峰面積積分，選取夏佛塔苷為內標化合物，分別計算 夏佛塔苷對Vicenin-I和Vicenin-3的相對校正因子f si和相對保留時間。根據本發(fā)明的 實施例，步驟（b)中夏佛塔苷對Vicenin-3、Vicenin-I的相對校正因子為1. 1。該數值的確 定是發(fā)明人在經過多次試驗的基礎上，根據盡可能少地保留校正因子的有效數字的原則的 基礎上確定的。根據本發(fā)明的實施例，夏佛塔苷與Vicenin-I、Vicenin-3的相對校正因子， 可將其作為常數，同時測定廣金錢草總黃酮提取物或制劑中Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛 塔苷的含量，實現科學、靈敏、快速地監(jiān)控工業(yè)生產中廣金錢草總黃酮提取物或制劑中的質 量，克服了對照品短缺這一問題，同時可計算出其他待測有效成分的含量。
[0017] 根據本發(fā)明的實施例，所述Vicenin-I和Vicenin-3的含量按照下列公式確定的： C1 = (f S1X A1X Cs) /As，其中，As為內標化合物峰面積，C s為內標化合物質量;A i為被測組分i 的峰面積，C1為被測組分i的質量，f S1為夏佛塔苷對Vicenin-I和Vicenin-3的相對校正因 子；其中，所述Vicenin-I峰和Vicenin-3峰的位置是基于夏佛塔苷峰的位置以及所述夏佛 塔苷對Vicenin-I和Vicenin-3的相對保留時間而確定的。根據本發(fā)明的實施例，步驟（b) 中，Vicenin-I的相對保留時間為0. 83, Vicenin-3的相對保留時間為1. 39。發(fā)明人經過多 次試驗摸索發(fā)現儀器自身狀態(tài)的變化、室內外的溫度變化，對保留時間差的影響較為明顯， 而相對保留值的波動相對較小，因此采用相對保留時間法進行待測成分色譜峰的定位科學 可行。發(fā)明人結合上述試驗結果，考慮各影響因素，確定Vicenin-I和Vicenin-3的相對保 留時間，有利于在"一測多評"檢測中準確定位各樣品峰位置。根據本發(fā)明的實施例，上述測 定方法能夠實現用夏佛塔苷一種易得的對照品同時測定廣金錢草藥材中有效成分的含量， 從而實現有效控制廣金錢草藥材、廣金錢草總黃酮提取