專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)定銀杏葉組合物中總黃酮含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物藥制劑，具體涉及一種銀杏葉組合物及其制備方法與應(yīng)用。
銀杏(Ginkgo Biloba)是現(xiàn)存種子植物中最古老的一種，也是可上溯到2億多年前二疊紀(jì)時(shí)的銀杏家族的唯一幸存者。在中國(guó)，銀杏葉制劑用于治療已有5000多年了，也就是說(shuō)，從中草藥的最早起源就開(kāi)始用于治療了。自六十年代以來(lái)，銀杏葉的植藥提取物在很多國(guó)家用于治療腦血管及周?chē)芗膊?，如德?guó)、法國(guó)、日本和韓國(guó)。
背景技術(shù)：
銀杏葉中的主要有效成份是黃酮類(lèi)化合物，它包括至少14種不同的化合物，例如黃酮醇、黃酮、黃烷酮和雙黃酮等等，這些化合物中，黃酮苷和黃酮醇苷包括山萘素、槲皮素和異鼠李素與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合物，是市場(chǎng)上用于治療目的的銀杏葉提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或“EGb761”)中最顯著的組分，實(shí)驗(yàn)表明黃酮苷和黃酮醇苷為有力的抗氧劑，可清除氧自由基從而避免由于年齡老化而引起的細(xì)胞和組織損傷，它們會(huì)嚴(yán)重影響大腦功能，包括記憶力和注意力，參見(jiàn)J.Pincemail等人，La Presse Medicale Vol.15(1986)，1475-1479；J.Robak等人，Biochem Pharmacol Vol 37(1988)，837-841和J.Kleijnen與 P.Knipschild Ginkgo biloba(Drug Profiles)，the Lancet3401136(1992)，另外，黃酮苷和黃酮醇苷也可改善周?chē)苎h(huán)，含有高濃度活性成分黃酮苷的銀杏葉提取物的制備工藝在(專(zhuān)利)DE-B1767 098和DE-B 21 17 429中都有描述，這些制備物為銀杏葉單一成份提取物。
除黃酮外，銀杏葉中另一主要活性成份是萜內(nèi)酯，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M和白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯為含有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的萜類(lèi)，參見(jiàn)K.Nakanishi，Pure和Applied Chemistry，Vol.14(1967)89-113；M.Maruyama等人，Tetrahedron Letters(1967)，299-302及303-319和K.Okabe等人，Ginkgolides，J chem.Soc.(1967)，2201-2206，它們是20個(gè)碳的籠狀分子，含有一個(gè)叔丁基和六個(gè)5元環(huán)A至F，所述六個(gè)五元環(huán)包括一個(gè)螺[4.4}壬烷，一個(gè)四氫呋喃環(huán)和三個(gè)內(nèi)酯環(huán)，不同銀杏內(nèi)酯結(jié)構(gòu)僅是螺壬烷骨架上C1，C3或C7上羥基數(shù)目和位置不同。最近發(fā)現(xiàn)，由于它們拮抗血小板活化因子(PAF)的特性，銀杏內(nèi)酯A、B、C和M特別是白果內(nèi)酯B能有效治療血小板活化因子誘發(fā)的疾病如哮喘、支氣管炎、老年性癡呆、過(guò)敏、心功能失調(diào)、風(fēng)濕病等等以及其它循環(huán)系統(tǒng)疾病，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,734,280；P.Braquet，Drug of the Future，12，643，1987；V Lamant等人，Biochem Pharmacol Vol.36(1987)2749-52；K.Becker等人，Biomed Biochim Acta Vol 47(1988)10-11；P.Braquet等人，J Ethnopharmacol Vol.32(1991)135-9和B.Steinke等人，Planta Med Vol 59(1993)155-60銀杏內(nèi)酯A和B可增加腦血流量而對(duì)大腦起保護(hù)作用，參見(jiàn)J.Krieglstein等人，European Journal ofPharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,002,965描述了一種使用銀杏內(nèi)酯防止器官移植中排斥反應(yīng)的方法。
DE-A3338995和相關(guān)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,571,407使用白果內(nèi)酯，一種結(jié)構(gòu)與銀杏內(nèi)酯相關(guān)的倍半萜內(nèi)酯，參見(jiàn)K.Nakanishi等人，R.T.Major等人和K.Weinges等人，J.Am.chem Soc.，Vol.93，1971，3544-3546治療腦病，腦水腫，脫鞘神經(jīng)病和脊髓病，在中腦動(dòng)脈閉合前使用白果內(nèi)酯在梗塞部位，皮質(zhì)和梗塞面積明顯減小，參見(jiàn)J.Krieglstein等人，European Journal of Pharmaceutical Sciences Vol.3(1995)39-48.實(shí)驗(yàn)表明白果內(nèi)酯有助于復(fù)原動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)，參見(jiàn)C.Bruno等人，Planta Med 59，1993，302-307。另外，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明白果內(nèi)酯具有抑制卡氏肺囊蟲(chóng)生長(zhǎng)的特性，參見(jiàn)C.Atzori等人，Antimicrobe Agents Chemother 37(7)1993，1492-1496。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,264,216采用白果內(nèi)酯能治療下列病菌的某些感染陰道毛滴蟲(chóng)、大腸桿菌、乳酸桿菌，卡氏肺囊蟲(chóng)、金黃色葡萄球菌、類(lèi)鏈球菌。白果內(nèi)酯抗卡氏肺囊蟲(chóng)感染活性主要用于治療艾滋病并發(fā)感染。
除上述化合物外，銀杏葉至少含有12種烷基酚酸化合物，包括銀杏酸(漆樹(shù)酸)，它是6-烷基水楊酸，烷基為正13碳到正19碳有0-3個(gè)雙鍵的烷基基團(tuán)，參見(jiàn)J.L.Gellermann等人，Phytochemistry，Vol.15(1976)，1959-1961和Analytic.Chem.，Vol.40(1968)，739-743。同毒常青藤中刺激物結(jié)構(gòu)相仿，銀杏酸是銀杏葉提取物毒性作用的因素，這些毒性作用包括胃腸道副作用、頭痛、皮膚刺激和水腫，六十年代以來(lái)，已有多例在接觸銀杏葉或果實(shí)后出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的報(bào)告，參見(jiàn)G.A.Hill等人，J.Am.Chem Soc.，Vol.56(1934)，2736-2738，W.F.Sowers等人，Arch，Dermatol.，Vol.91(1965)，452-456；L.E.Becker等人，J.Am.Med.Assoc.，Vol.231(1975)，1162-1163；T.Nakamura,Contact Dermatitis，Vol.12(1985)，281-282；R.R.Tomb等人，Contact Dermatitis，Vol.19(1988)281-3和J.P.Lepoittevin等人，Arch Dermatol Res Vol.281(1989)，227-30。于是，許多國(guó)家的科學(xué)家努力開(kāi)發(fā)脫敏的物質(zhì)和方法以對(duì)抗銀杏酸所致的過(guò)敏(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,428,965)。DE-B 17 67 098和DE-B 21 17 429開(kāi)發(fā)了一種采用氯代脂肪烴如四氯化碳來(lái)去除烷基酚化合物的工藝，然而在該工藝中相當(dāng)多的有醫(yī)療價(jià)值的銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯也會(huì)失掉了。DE-B 21 17 429開(kāi)發(fā)了一種技術(shù)以除去具有丹寧特性的多酚類(lèi)化合物(原花色素)，在工藝中使用了鉛化合物。這些工藝的問(wèn)題是可能危害操作人員的健康，對(duì)環(huán)境的潛在威脅以及藥品中有害的殘留物。
當(dāng)前最常用的用于治療目的的銀杏葉提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或“EGb 761”)含有24％黃酮苷和6％萜內(nèi)酯；參見(jiàn)K.Driau La Presse Medicale Vol.15(1986)，1455-1457，銀杏內(nèi)酯A、B、C和J以及約占這6％的一半的白果內(nèi)酯，銀杏葉提取物通常含有低于10ppm烷基酚化合物，每日治療劑量120mg。
在九十年代，盡了很大的努力增加銀杏葉提取物中活性成分的含量并減小銀杏酸的濃度，同時(shí)，也探討了為不同治療提供不同銀杏葉提取物有效成份特定組合的可能性。銀杏內(nèi)酯和黃酮苷的組合可使提取物的活性轉(zhuǎn)向抗PAF作用。相反，白果內(nèi)酯和黃酮苷的組合對(duì)治療腦病、腦水腫、脫鞘神經(jīng)病、脊髓病更具活性，同時(shí)也開(kāi)發(fā)了不使用氯代脂肪烴去除烷基酚和不使用鉛去除原花色素的方法。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,399,348提及到一種銀杏葉提取物的制備方法，它不采用氯代脂肪烴分離烷基酚化合物，而是首先通過(guò)一沉淀過(guò)濾工序，然后從脂肪烴進(jìn)行多步液液萃取，使用鉛化合物或聚酰胺以去除原花色素。該方法如下銀杏葉以一種有機(jī)溶劑如丙酮水溶液，一至三個(gè)碳的醇水溶液或無(wú)水甲醇提取，分離大部份有機(jī)溶劑后得到一水溶液，然后用水稀釋至固體含量(含固量)5-25％(重量)。稀釋后的水溶液冷卻沉淀以去除親脂性組分，然后以硫酸銨處理并用甲乙酮、丙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取，萃取液以水和醇稀釋后得到一水醇溶液，再以鉛化合物或不溶性聚酰胺處理。處理后的水醇溶液最后再用一個(gè)脂肪烴或脂環(huán)烴溶劑萃取以進(jìn)一步去除烷基酚化合物，最終得到一干燥提取物。
另外，在以甲乙酮或甲乙酮、丙酮混合物萃取后，萃取液可被濃縮至含固量50～70％，然后以水和醇稀釋得到含固量10％(重量)含水、醇各50％(重量)的水醇溶液，然后將一種鉛鹽水溶液，乙酸鉛、堿或乙酸鉛或硝酸鉛或氫氧化鉛水懸浮液，最好是堿式乙酸鉛溶液加入到上述水醇溶液中，直到由顏色褐色轉(zhuǎn)為赭色，形成沉淀，并分離除去水醇溶液用脂肪烴或脂環(huán)烴溶劑萃取以進(jìn)一步去除烷基酚化合物，然后濃縮至醇濃度不超過(guò)5％，加入硫酸銨至濃度為20％(重量)，得到的醇水溶液用比例為9∶1至4∶6的甲乙酮乙醇混合物萃取，形成一有機(jī)相萃取液，該相濃縮至固體含量50～70％后干燥，除了鉛鹽也可用聚酰胺如聚酰胺6，聚酰胺66或交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(Polyvidon)。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,399 348發(fā)現(xiàn)采用上述方法，所得銀杏葉制備物含黃酮苷20到30％，銀杏內(nèi)酯A、B、C、J 2.5～4.5％，白果內(nèi)酯2.0～4.0％，烷基酚化合物小于10ppm以及小于10％的原花色素。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,688開(kāi)發(fā)了一種與上述相似的去除烷基酚化合物的工藝，但是與采用鉛去除原花色素不同，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,688采用了萃取工藝，使用了不與水混溶的4或5個(gè)碳的醇如正丁醇。該方法的特點(diǎn)是銀杏葉以丙酮水溶液，一至三個(gè)碳的醇水溶液或無(wú)水甲醇提取，蒸發(fā)或蒸餾除去提取液中大部份有機(jī)溶劑，得到的水溶液以水稀釋至固體含量5-25％。稀釋后的水溶液冷卻、沉淀除去水不溶性的親脂成分，然后水溶液以10～30％硫酸銨處理并用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物萃取，萃取液以丁醇或戊醇萃取，丁醇或戊醇萃取液以水和醇稀釋?zhuān)玫降乃既芤涸僖灾緹N或脂環(huán)烴溶劑萃取以進(jìn)一步除去烷基酚化合物，最后濃縮水相溶液，所得濃縮物經(jīng)干燥后即得提取物。
另外，在上述用甲乙酮或甲乙酮丙酮混合物提取后，也可將提取液濃縮至固體含量50至70％，然后以水稀釋至固體含量10％(重量)，水濃縮液即用不與水混溶的C4或C5醇萃取，醇層濃縮至固體含量50至70％，該濃縮液以水和醇稀釋得到一含干燥提取物5～20％的含醇20～60％(重量)的醇水溶液，將該溶液以脂肪烴或脂環(huán)烴溶劑萃取，以進(jìn)一步除去烷基酚化合物，最后，濃縮水相濃縮物，經(jīng)干燥得干燥提取物。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,688提出采用上述方法所得銀杏葉制備物含有黃酮苷20～30％，銀杏內(nèi)酯A、B、C和J 2.5-4.5％，白果內(nèi)酯2.0～4.0％，烷基酚類(lèi)化合物低于10ppm以及小于10％的原花色素。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,389,370也采用了美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,322,688所描述的去除烷基酚化合物和原花色素的方法，但是提供了含高濃度活性成份以及它們的組合物的銀杏葉提取物的制備方法。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,389,370的工藝的特點(diǎn)是含黃酮苷至少1.4％的銀杏葉以丙酮水溶液，最多三個(gè)碳的醇水溶液或無(wú)水甲醇提取，分離除去大部分有機(jī)溶劑直至濃度不大于10％，得到的經(jīng)濃縮的水性溶液以水稀釋至固體含量15～20％(重量)然后放置冷卻直至沉淀生成，這些沉淀由不易溶于水的親脂性成分組成，經(jīng)過(guò)濾除去，剩下的水溶液以甲酸酯或乙酸酯如乙酸乙酯或乙酸乙酯與一脂肪烴或脂環(huán)烴的混合物進(jìn)行多步萃取，水相中溶解的酯可藉蒸餾完全除去，剩余溶液以與水不相溶的C-4或C-5醇萃取，醇相以水洗滌，隨后濃縮，殘留的溶劑通過(guò)恒沸蒸餾完全除去，殘留物以40％(重量)醇水溶液稀釋生成一稀釋的殘留物。
另外，在上述工藝中，為去除乙酸乙酯或乙酸乙酯/烴萃取液中的提取伴隨物，可將萃取液用活性碳或硅膠柱層析處理。而且，上述工藝中乙酸乙酯或乙酸乙酯/烴混合得到的萃取液可首先用活性碳處理以除去伴隨的雜質(zhì)，然后銀杏內(nèi)酯結(jié)晶析出，純凈的白果內(nèi)酯和剩余的銀杏內(nèi)酯通過(guò)柱層析從母液中分離。
在上述工藝中最后一步得到的稀釋后的殘留物可用脂肪烴或脂環(huán)烴溶劑進(jìn)一步萃取以降低烷基酚化合物含量，水相濃縮蒸發(fā)后得到一干燥提取物。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,389,370報(bào)告采用上述方法，得到銀杏葉制備物含黃酮苷40～60％；銀杏內(nèi)酯A、B、C和J 5.5-8％而白果內(nèi)酯5-7％，或銀杏內(nèi)酯5.5～8％而白果內(nèi)酯小于0.1％，或白果內(nèi)酯5-7％而銀杏內(nèi)酯不大于0.1％；原花色素0-10％以及最大濃度為10ppm的烷基酚化合物，優(yōu)選其含量低于1ppm。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,637,302涉及到一種銀杏葉提取物的制備方法，在這里銀杏葉粗提物用由正丁醇和甲苯組成的溶劑進(jìn)行萃取從而避免了使用氯代脂肪烴和鉛化合物，此外，采用這一工藝也可解決其它發(fā)明中使用大量相互混溶的不同溶劑的問(wèn)題。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,737,302的工藝的特點(diǎn)如下，銀杏葉用一含水溶劑丙酮水溶液或甲醇和/或乙醇和水溶液提取，這些含水的提取液直接用正己烷或正庚烷或甲苯/丁醇混合物萃取以除去非活性親脂性物質(zhì)如烷基酚和多元酚，脫脂后的溶液濃縮至一定體積即相當(dāng)于生藥的重量，然后放入冰箱中24小時(shí)，然后離心，得到二聚類(lèi)黃酮組成的半結(jié)晶物質(zhì)，水相以體積比1∶2到1∶4的甲苯/丁醇逆流萃取。甲苯-丁醇相用水逆流洗滌后濃縮成浸膏樣并以水或水醇混合物洗滌，以進(jìn)一步去除殘留的微量甲苯和丁醇，最后干燥。
此外，脫脂后的水溶液仍含有一定比例的二聚黃酮，可使其通過(guò)吸附樹(shù)脂如一芳香族聚合物樹(shù)脂，它對(duì)酚有顯著的活性能很容易地吸附很多活性成分，被吸附的活性成分用有機(jī)溶劑如低級(jí)醇(C1-C4)或與水混溶的酮從樹(shù)脂上再洗脫。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,637,302發(fā)現(xiàn)采用上述方法，得到銀杏葉提取制備物含22～26％黃酮苷，2.5～4.5％銀杏內(nèi)酯2.5～4.5％白果內(nèi)酯，幾乎不含烷基酚化合物且原花色素小于10％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是進(jìn)一步確定每一個(gè)黃酮類(lèi)組份，提供更為精制的銀杏提取物，可測(cè)定其含量，調(diào)整它們之間的比例。這些單一的組份包括了黃酮醇，黃酮、黃烷醇及黃酮醇苷。產(chǎn)品的含量符合國(guó)家制定的藥物測(cè)試要求和組份重現(xiàn)性，不管銀杏葉原料中的各種組份有何不同。這種組份更確定的銀杏提取物聚集了有效的活性成份，減少了未知成份。具有更規(guī)范的生產(chǎn)工藝和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提高了所制備的藥物的安全性，增強(qiáng)了醫(yī)生、病人用藥的信心和藥物篩選的重現(xiàn)性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高含量的銀杏提取物，含量指標(biāo)分別為黃酮類(lèi)44-78％；銀杏內(nèi)酯2.5-10％；白果內(nèi)酯2.5-10％。高含量的銀杏提取物是許多國(guó)家藥物標(biāo)準(zhǔn)的要求，但由于這些條款僅適用提純的化合物，所以普通的提取物是難以滿足的。到目前為止還不可能制備如此高含量的銀杏提取物。
高含量提取物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是減少了每天的用藥劑量，縮小了制劑的體積。服用銀杏制劑的大多數(shù)患者為老年人，所以這優(yōu)點(diǎn)更為突出。
還有一優(yōu)勢(shì)是高含量提取物大大地除去了非活性成份，大量去除非活性成份增加了用藥的安全性，更為簡(jiǎn)化的活性成份使主要成份的測(cè)試及雜質(zhì)的確定更為方便。提純的銀杏提取物可用于器官移植時(shí)抑制異體排斥反應(yīng)。
該發(fā)明還有一個(gè)目的就是除去銀杏酸，消除過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。
因?yàn)楝F(xiàn)在的藥用銀杏提取物主要是用于治療腦及周?chē)鷦?dòng)脈循環(huán)不良癥，所以本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種方法，使該方法能用于治療冠心病引起的心絞痛。
本發(fā)明所提供的銀杏浸膏含黃酮類(lèi)44～78％，銀杏內(nèi)酯2.5～10％，白果內(nèi)酯2.5～10％，銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明涉及從銀杏葉中提取的組份，特別是包括含有新活性成份及其混合物的不同組份。提供了制備這些相同提取物的方法，鑒別及測(cè)定其含量的方法，還提供了含有這些活性成份和混合物的藥物及其應(yīng)用于治療冠心病引起的心絞痛的方法。
本發(fā)明提供了一種組合物，包括黃酮類(lèi)化合物約44％～78％，銀杏內(nèi)酯2.5％～10％(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和J或其混和物)，白果內(nèi)酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明提供了一種組合物，其中含有黃酮類(lèi)化合物約44％～78％(其中包括黃酮醇、黃烷醇和黃酮苷)，銀杏內(nèi)酯2.5％～10％(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和J或其混和物)，白果內(nèi)酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明提供了一種組合物，含黃酮類(lèi)化合物約44％～78％(其中黃酮苷20～75％)，銀杏內(nèi)酯2.5％～10％(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和J或其混和物)，白果內(nèi)酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明提供了一種組合物，含黃酮類(lèi)化合物約44％～78％(其中黃酮苷與黃酮醇的比率為1～30∶1)，銀杏內(nèi)酯2.5％～10％(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和J或其混和物)，白果內(nèi)酯2.5～10％和銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明提供了一種組合物，它含約44％～78％的黃酮類(lèi)化合物(其中含有黃酮苷)，5～20％的內(nèi)酯(其由2.5％～10％的銀杏內(nèi)酯A、B、C和J的單一成分或其混合物，以及2.5～10％的白果內(nèi)酯組成)，其中黃酮苷和內(nèi)酯之比約3.5～4.5∶1，還含銀杏酸0.1～5ppm。
本發(fā)明提供了一種組合物，其中含有黃酮苷的黃酮類(lèi)化合物不少于44％，其中含有銀杏內(nèi)酯A、B、C和J的單一成分或其混和物的銀杏內(nèi)酯不少于6％，并含0.1～5ppm的銀杏酸。
本發(fā)明提供的上述組合物中的銀杏酸含量約0.1～0.5ppm。
本發(fā)明提供的組合物，它的組成成分是從銀杏葉中提取的。
本發(fā)明提供的上述組合物，它的組成成分是從人工培養(yǎng)植物中獲得的銀杏葉中提取出來(lái)的。
本發(fā)明提供了一個(gè)獲得銀杏組合物的方法，步驟如下
(a)得到干燥銀杏葉(b)把葉子粉碎成小片(c)用水、1～3個(gè)碳的脂肪醇、丙酮及其混合溶液對(duì)粉碎的葉子進(jìn)行回流提取，在此條件下，使黃酮類(lèi)化合物和萜烯內(nèi)酯的提取成為可能，從而得到提取液和殘?jiān)?br> (d)將殘?jiān)吞崛∫悍蛛x(e)60℃濃縮提取液至密度約1.2到1.25。
(f)步驟(e)中的濃縮液至少要用兩種樹(shù)脂處理，處理?xiàng)l件是能結(jié)合黃酮類(lèi)化合物和內(nèi)酯。
(g)洗脫結(jié)合有黃酮和內(nèi)酯的層析柱，得到含有黃酮和內(nèi)酯的銀杏提取物。
本發(fā)明提供了一個(gè)色譜法，即裝柱進(jìn)行柱層析的色譜法。
本發(fā)明提供的色譜法的方法中采用的樹(shù)脂包括但并不限于多孔聚合物、硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、纖維素和葡萄糖凝膠。
本發(fā)明提供的色譜法，其中柱用水，1～3個(gè)碳的脂肪醇、丙酮及其混合物或酯(甲酯或乙酯)洗脫。
本發(fā)明提供了鑒別和分析銀杏組合物中黃酮的方法，步驟如下(a)把組和物溶解在甲醇里，制備供試品溶液。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液將銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)品置于60％的乙醇水溶液中回流，然后過(guò)濾，蒸發(fā)乙醇，濃縮濾液，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取濃縮的水溶液；濃縮正丁醇提取液至干燥，再溶解在甲醇中。
(c)根據(jù)薄層色譜(TLC)方法進(jìn)行分析在同一塊薄層硅膠板上將每一個(gè)上述提及的溶液點(diǎn)樣，用乙酸乙酯、甲酸、乙酸和水的混和液展開(kāi)后，在空氣中干燥，用1％氯化鋁的乙醇液噴勻，然后用365nm紫外光觀察，在標(biāo)準(zhǔn)樣品和供試樣品色譜圖上，可以在指定的位置看到8個(gè)黃色斑點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一鑒別、分析銀杏組合物中萜烯內(nèi)酯的方法，步驟如下(a)制備供試品溶液用乙酸乙酯回流銀杏組合物，然后過(guò)濾，濃縮濾液至干燥，并溶解于甲醇。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液將銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯等五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解于甲醇，制成五份標(biāo)準(zhǔn)溶液。
(c)根據(jù)TLC方法進(jìn)行分析在同樣的GF254薄層層析硅膠板上將上述提及的幾種溶液分別點(diǎn)樣，采用乙酸乙酯、甲苯、丙酮和環(huán)己烷的混和溶劑展開(kāi)薄板，待展好之后，在空氣中干燥，加熱，于254nm紫外燈下觀察，標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn)樣品在相同的位置出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一個(gè)鑒別和分析檢查銀杏組合物中銀杏酸的方法，步驟如下(a)制備供試品溶液，將銀杏組合物用正己烷進(jìn)行回流，然后過(guò)濾，濾液濃縮至干并溶解于乙酸乙酯。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液將銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于乙酸乙酯。
(c)用薄層層析法進(jìn)行分析在同樣的GF254薄層硅膠板上，取上述提及的溶液進(jìn)行點(diǎn)樣，采用正己烷、乙酸乙酯和乙酸的混和溶劑展開(kāi)薄板，在空氣中干燥，于315和368nm紫外光下觀察，分析樣品溶液吸收應(yīng)小于標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸收。
本發(fā)明提供了測(cè)定銀杏組合物中總黃酮的方法，步驟如下(a)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液將干燥蘆丁定量溶于乙醇水溶液，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
(b)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶，將每一容量瓶用水、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH＝4.5)、0.1M氯化鈉和70％的含水乙醇加至刻度，根據(jù)在270nm的吸收，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
(c)采用分光光度法分析樣品用70％乙醇溶解組合物樣品，吸取此溶液到一容量瓶，采用上述方法，制成樣品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在270nm處測(cè)出樣品的吸收后就可得出其濃度，從蘆丁干品計(jì)算出的總黃酮含量是標(biāo)示量的85～115％。
本發(fā)明提供了測(cè)定銀杏組合物中黃酮苷的方法，步驟如下(a)制備供試品溶液用甲醇和25％鹽酸糖溶解樣品組合物，回流，除去鹽及不溶物，放置冷卻并轉(zhuǎn)移容量瓶，燒瓶用甲醇洗滌，洗滌液傾至容量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度。
(b)標(biāo)準(zhǔn)液的制備將槲皮素、山萘素、異鼠李素溶解于同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。
(c)用高壓液相的方法測(cè)定含量，計(jì)算槲皮素、山萘素、異鼠李素相對(duì)峰面積再通過(guò)下列公式計(jì)算總黃酮苷的含量＝槲皮素的量×2.50+山萘素量×2.63+異鼠李素的量×2.36。
本發(fā)明提供了測(cè)定萜稀內(nèi)酯在銀杏提取物中的含量的方法，步驟如下(a)樣品溶液的制備該組合物用丙酮回流、過(guò)濾、濃縮濾液，殘?jiān)芙庥谝宜峒柞ブ校盟腿?，水層用乙酸甲酯再萃取一次。合并兩份乙酸甲酯層，蒸干后定溶于甲醇中?br> (b)標(biāo)準(zhǔn)液的制備將內(nèi)酯A、B。C、J和白果內(nèi)酯用甲醇定溶于同一容量瓶中。
(C)測(cè)試供試液及標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)檢測(cè)，根據(jù)外標(biāo)法算出A、B、C、J和白果內(nèi)酯的含量，總內(nèi)酯含量可藉求和得到。
本發(fā)明提供了用銀杏內(nèi)酯A、B、C、J及白果內(nèi)酯單體作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)試銀杏組合物中內(nèi)酯含量的方法。
本發(fā)明提供了用銀杏酸單體作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)試銀杏組合物中銀杏酸含量的方法。
本發(fā)明提供了用蘆丁單體作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定黃酮類(lèi)化合物的方法。
本發(fā)明提供了用槲皮素、山萘素、異鼠李素單體作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定黃酮醇及其苷的方法。
本發(fā)明提供的上述組合物可用于食品添加劑或加入飲料中。
本發(fā)明提供的上述組合物可用于霜?jiǎng)?、油膏劑或出現(xiàn)這些制劑的原料中。
本發(fā)明提供了含上述成份的口服劑。
上述口服劑型包括丸劑、膠囊、顆粒劑、片劑或懸浮液。
本發(fā)明提供了一種注射制劑，該注射劑可通過(guò)如下不同途徑使用，如靜脈、肌肉、皮下、腹腔注射。
本發(fā)明提供了采用上述成份的化妝品。
本發(fā)明提供了通過(guò)以上方法制備的藥用組合物，它含有上述有效量的上述組合物及藥用載體。本發(fā)明還提供了該藥用組合物的制備方法。
該發(fā)明可接受的藥用載體是指任何標(biāo)準(zhǔn)藥用載體。這些載體的實(shí)例是眾所周知的，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，例如磷酸鹽的緩沖生理鹽水液，含有聚山梨醇酯80、水的油/水混懸液和各種類(lèi)型的濕潤(rùn)劑的磷酸鹽緩沖生理鹽水，其他載體還包括滅菌溶液、片劑、包衣片和膠囊。
典型的載體包括賦形劑，例如淀粉、牛奶、糖、特種粘土、明膠、硬脂酸或鹽(包括硬脂酸鎂、鈣)、滑石粉、植物脂肪或植物油、樹(shù)膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。載體也包括調(diào)味品和色素或其他添加劑。含有載體的組和物按常規(guī)方法配制。
本發(fā)明提供了一種治療冠心病引起的各種類(lèi)型和程度的心絞痛的方法，該方法是將以上藥用組合物的有效劑量施予患者。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用以上藥用組合物的有效劑量改善局部缺血引起心動(dòng)過(guò)速的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量緩解心絞痛的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量減少三硝酸甘油酯的用量的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量緩解心悸的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量使血脂不正常的病人降低血液中的膽固醇和甘油三酸酯的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量減少血液中血小板凝聚的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用上述藥物組份的有效劑量提高運(yùn)動(dòng)耐受性，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間、延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)開(kāi)始到心絞痛發(fā)生以及開(kāi)始運(yùn)動(dòng)到ST部分降低1mm之間的間隔時(shí)間的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療陽(yáng)萎的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療牛皮癬的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療色素沉著的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)向患者施用以上有效劑量的藥用組合物治療健忘、AIDS、早老性癡呆癥(阿耳茨海默氏病)、心絞痛、動(dòng)脈硬化、關(guān)節(jié)炎、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、孤獨(dú)癥、遺尿、腦外傷、心律失調(diào)、凍瘡、風(fēng)寒、冠心病、耳聾、癡呆、抑郁、伴隨壞疽和絞痛的糖尿病血管收縮、頭昏、視力模糊、記憶力下降、疲勞、絲蟲(chóng)病、頭痛、高血脂、高血壓、間歇性跛行、腎功能紊亂、腿部痙攣、心肌梗塞、帕金森癥、血循環(huán)障礙、栓塞綜合癥、雷諾氏癥、風(fēng)濕、衰老、胸悶、耳鳴、結(jié)核、靜脈曲張、眩暈的方法。
上述藥用組合物被用于治療疾病，因?yàn)樗鼈兙哂腥缦伦饔面?zhèn)痛、止痛、緩解氣喘、消炎、阻止動(dòng)脈粥樣硬化形成、抗菌、抗癌、抗凝血、抗糖尿病、降高血脂、降高血壓、抗核輻射、抗血小板凝聚、抗氧化、抗血栓、抗結(jié)核、抗咳嗽、支氣管擴(kuò)張、毛細(xì)管擴(kuò)張、毛細(xì)管保護(hù)、腦循環(huán)興奮劑、腦血管舒張藥、使注意力集中、改善記憶力、改善聽(tīng)力、改善外周循環(huán)、增加多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、神經(jīng)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)劑、防止頸動(dòng)脈粥樣硬化和血管舒展劑等。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)例將更有助于對(duì)該發(fā)明的理解，有這方面知識(shí)的人將真正認(rèn)識(shí)到，上面所說(shuō)的這些方法和結(jié)果只不過(guò)是很表面的描述了該發(fā)明。以下的說(shuō)明將較為詳盡。
下面的實(shí)例將有助于對(duì)本發(fā)明的理解，進(jìn)而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)上述方法和結(jié)果。
實(shí)例1、本發(fā)明提供了一種制備銀杏組合物的方法，步驟如下(a)提取銀杏綠葉在夏末到初秋時(shí)采集，此時(shí)，有效治療成分含量高而水份低于8％，干燥后，在粉碎機(jī)里粉碎成小于4mm的碎片，然后用12倍體積的60％的含水乙醇常壓下回流兩次，每次3小時(shí)，過(guò)濾除去固體殘?jiān)笤儆?0倍體積的水進(jìn)行第三次回流0.5小時(shí)，合并三次濾液。
(b)濃縮將步驟a得來(lái)的濾液減壓濃縮至不含醇的粘稠浸膏(密度d＝1.2～1.25，溫度t＝60℃)。
(c)沉淀用2倍量的熱水溶解步驟(b)的粘稠浸膏，冷卻后形成沉淀，過(guò)濾除去沉淀。
(d)柱層析將步驟(c)的濾液上大孔樹(shù)脂柱(XAD-4)使樹(shù)脂和葉子的比率為1∶1，用2倍量的純水、6％、18％、30％含水乙醇分別洗脫，最后用65％乙醇洗脫，直至流分顏色變淺。18％和30％流分合并后真空濃縮至不含醇的小體積，然后此濃縮液上聚 酰胺柱，聚酰胺與粗葉比率為1∶3，用純水和95％乙醇分別洗脫，將95％的流分和大孔樹(shù)脂柱65％的流分合并，真空濃縮至不含醇。
(e)去除銀杏酸用三分之二體積的環(huán)己烷萃取步驟(d)的濃縮液三次，含水部分減壓濃縮。
(f)干燥將濃縮的浸膏的密度調(diào)整至1.05，然后噴霧干燥，噴霧干燥室溫度控制在140～160℃。
成品為棕黃色粉末，有特殊香味，略有苦味。
前述方法具體來(lái)說(shuō)，柱層析的特點(diǎn)是二次處理，即浸膏首先上大孔樹(shù)脂柱(XAD-4)，柱與葉子的比率為1∶1，接著上聚酰胺柱，柱與葉子的比率為1∶3。
具體來(lái)說(shuō)，除去銀杏酸的特點(diǎn)就是通過(guò)二次處理，即浸膏經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂柱(XAD-4)層析，然后用環(huán)己烷處理三次。
實(shí)例2、本發(fā)明提供了一個(gè)制備銀杏組合物的方法，步驟如下(a)提取采集夏末秋初的銀杏綠葉，此時(shí)的有效治療成分含量高而水份含量低于8％，干燥后，在粉碎機(jī)里粉碎成小于4mm的葉片。然后用12倍量的溶劑系統(tǒng)回流2次，每次1～3小時(shí)，，溶劑系統(tǒng)可采用水，水-乙醇和丙酮-水，過(guò)濾除去固體或渣，合并上述的兩次濾液。
(b)濃縮步驟(a)得到的濾液經(jīng)真空濃縮成不含有機(jī)溶劑的浸膏，(d＝1.2～1.25，t＝60℃)(c)沉淀將步驟(b)得到的浸膏溶解于2倍量的沸水中，冷卻至約12℃，有沉淀形成，過(guò)濾分離。
(d)柱層析將步驟(c)得到的浸膏上某一樹(shù)脂柱，用水或水和有機(jī)溶劑的混合溶劑洗脫，混合溶劑可選用1～3個(gè)碳的醇和丙酮。洗脫流分濃縮后上另一種樹(shù)脂柱，用一或兩種溶劑系統(tǒng)洗脫，溶劑系統(tǒng)可選擇水、1～3個(gè)碳的醇，酮和酯，然后可得到含高含量的內(nèi)酯和黃酮類(lèi)化合物的流分，減壓濃縮此流分除去含水醇。
(e)除去銀杏酸將步驟(d)得到的濃縮液用三分之二體積飽和或不飽和烷烴萃取三次，水部分真空濃縮。
(f)干燥將濃縮浸膏的密度調(diào)整至1.02～1.10(40℃)，然后噴霧干燥，噴霧干燥室溫控制在140～160℃。
實(shí)例3、本發(fā)明提供了一制備銀杏組合物的方法，步驟如下將100kg干燥銀杏葉粉末和1000kg，50％乙醇溶液回流2小時(shí)，過(guò)濾、將過(guò)濾殘?jiān)儆?000kg，50％含水乙醇回流2小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次濾液，在60℃下真空濃縮至無(wú)醇(d＝1.2)，將濃縮液溶解于300kg水中并放置48小時(shí)，過(guò)濾。將濾液上大孔樹(shù)脂和聚酰胺的混和柱，分別用100kg的水，100kg 30％乙醇溶液，100kg 60％乙醇溶液、100kg 90％乙醇溶液洗脫，合并30％、60％、90％乙醇的水溶液洗脫液，真空濃縮合并液至約70kg的浸膏，用正己烷萃取浸膏三次，將水相真空濃縮和干燥。1.5kg的最終產(chǎn)品含水低于5％，含47.2％黃酮類(lèi)化合物，其中黃酮苷約24.8％，內(nèi)酯6.3％和低于5ppm的銀杏酸。
實(shí)例4、從實(shí)例3的柱層析開(kāi)始從柱上下來(lái)的用30％的乙醇水溶液洗脫的流分經(jīng)減壓濃縮，除去乙醇，濃縮液萃取三次，每次用三分之二體積的乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯相在45℃減壓蒸發(fā)，殘留物用50％乙醇水溶液加熱溶解，放置24小時(shí)，形成銀杏內(nèi)酯結(jié)出。分離結(jié)晶后，母液減壓蒸發(fā)，分別用1.5倍重量活性炭和硅膠進(jìn)行層柱分離，將所有白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯的部分分別收集；濃縮至干，與銀杏內(nèi)酯結(jié)晶(A)10g合并，總萜內(nèi)酯的含量不低于80％。
收集合并實(shí)例3中從柱中洗脫的60％乙醇水溶液部分和70％乙醇水溶液部分。減壓濃縮至完全無(wú)醇。此濃縮物上聚酰胺柱，分別用10％、20％、75％和90％乙醇水溶液洗脫。將75％流分濃縮至干，粉狀物用無(wú)水乙醇溶解，上聚酰胺柱，分別用100％乙醇、70％乙醇水溶液和20％乙醇水溶液洗脫，收集70％乙醇水溶液，與2kg硅膠混合，將混和物濃縮至干，用乙酸乙酯、乙醇分別洗脫。濃縮乙醇部分至干得(B)90g?？傸S酮含量不低于80％。
高含量的內(nèi)酯(A)和黃酮(B)浸膏按不同比例混合，得到不同含量的最終產(chǎn)品，例如10g(A)和90g(B)，得100g(A+B)，此混合物中含77％黃酮類(lèi)化合物和8％內(nèi)酯，10g(A)和70g(B)混和得80g(A+B)，則這一產(chǎn)品含70％黃酮和10％內(nèi)酯。
實(shí)例5、鑒別和定量分析黃酮，內(nèi)酯和銀杏酸的方法，以及確定黃酮、內(nèi)酯、萜烯內(nèi)酯含量的方法。
本發(fā)明提供了一種鑒別和定量分析銀杏葉組合物中黃酮的方法，步驟如下(a)制備供試液將0.1g組合物溶解于1ml甲醇。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)液將1g標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉用10ml 60％乙醇回流2小時(shí)，過(guò)濾、濃縮濾液、蒸干乙醇；分別用10ml的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮正丁醇部分至干并將它溶解于1ml甲醇中。
(c)測(cè)定供試液在相同的硅膠薄板上將上述每個(gè)溶液點(diǎn)樣10μl，用乙酸乙酯∶甲酸∶乙酸∶水(100∶11∶11∶26)的混和溶劑展開(kāi)后，將溶劑在空氣中吹干除盡，用1％氯化鋁乙醇溶液噴涂，365nm紫外燈下觀察，在標(biāo)準(zhǔn)樣品和供試樣品色譜圖上，在指定的位置可看到8個(gè)黃色斑點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一種鑒別和定量分析銀杏組合物中內(nèi)酯的方法，步驟如下
(a)制備供試液用20ml乙酸乙酯回流0.5g組合物30min，過(guò)濾、濃縮濾液至干溶解于2ml甲醇中。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)液，各取銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯B的標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于甲醇中，得到5種0.5mg/1ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
(c)測(cè)試供試液將上述溶液各吸取10μl，點(diǎn)在同樣的硅膠GF254板上，用乙酸乙酯∶甲苯∶丙酮∶環(huán)己烷(4∶3∶2∶1)的混和溶劑展開(kāi)后，在空氣中吹干溶劑，150℃加熱1小時(shí)，在254nm波長(zhǎng)光下觀察，供試品和標(biāo)準(zhǔn)樣品在指定的位置可看到相同顏色的色譜斑點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一種鑒別和定量分析銀杏混和物中銀杏酸的方法，步驟如下(a)制備供試液將4g組合物加100ml正己烷回流2小時(shí)，過(guò)濾，濃縮濾液至干，并溶解在1ml乙酸乙酯中。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)液將銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙酸乙酯，使該溶液為每毫升含0.04mg標(biāo)準(zhǔn)品，(c)測(cè)試供試液將上述溶液各吸取10μl分別點(diǎn)在同樣的硅膠GF254薄板上，用正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸(80∶15∶5)的混和溶劑展開(kāi)后，在空氣中吹干溶劑，在315nm波長(zhǎng)處和368nm波長(zhǎng)處的紫外燈下觀察，供試液的吸收應(yīng)低于標(biāo)準(zhǔn)液的吸收(0.0005％)。
本發(fā)明提供了一定量分析銀杏葉組合物中黃酮化合物總含量的方法，步驟如下(a)制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液將20mg干燥蘆丁溶于70ml 70％含水乙醇中。
(b)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線各吸取該標(biāo)準(zhǔn)液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，到10ml的容量瓶中，分別加入3ml水，2ml的乙酸-乙酸鈉的緩沖液(PH＝4.5)，2ml的0.1M的氯化鋁，然后用70％含水乙醇加至10ml，在270nm處根據(jù)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液樣品的吸收繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(c)用分光光度法測(cè)定供試液在50ml的容量瓶中將25mg銀杏組合物溶于70％含水乙醇中。吸取0.5ml該溶液加到一10ml容量瓶中，參照上述方法制備成供試液，在270nm處測(cè)定其吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知供試液濃度，在無(wú)水情況下，總黃酮量以蘆丁計(jì)為標(biāo)示量的85～115％之間。
本發(fā)明提供了一測(cè)定黃酮苷含量的方法，步驟如下(a)制備供試液用20ml甲醇和5ml25％的鹽酸溶解75mg銀杏葉組合物，并回流60min，分離后，放置冷卻并立即轉(zhuǎn)移至50ml的容量瓶中，燒瓶用5ml甲醇洗3次，洗滌液并入容量瓶，用甲醇稀釋至刻度。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)液將4.2mg的槲皮素、6.0mg的山萘素、1.2mg的異鼠李素用甲醇溶解于一個(gè)50ml的容量瓶中，并用甲醇稀釋。此標(biāo)準(zhǔn)液每1ml中含24μg的異鼠李素，84μg的槲皮素、120μg的山萘素。
(c)測(cè)定供試液計(jì)算HPLC的相對(duì)峰面積來(lái)測(cè)定山萘素、槲皮素和異鼠李素的含量。總的黃酮苷含量＝槲皮素含量×2.50+山萘素的量×2.63+異鼠李素的量×2.36。
本發(fā)明提供了一測(cè)定萜烯內(nèi)酯含量的方法，步驟如下(a)制備供試液將100mg組合物和60ml丙酮一起回流2小時(shí)，過(guò)濾后，濃縮濾液，殘?jiān)儆?0ml乙酸甲酯溶解，用10ml水萃取，水層再用20ml乙酸甲酯萃取，合并兩次的乙酸甲酯液層，濃縮至干并溶解于5ml甲醇中。
(b)制備標(biāo)準(zhǔn)液用甲醇溶解各30mg銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯(BB)于50ml的容量瓶中。
(c)測(cè)定供試液標(biāo)準(zhǔn)品和供試品進(jìn)樣量各15μl得，到它們的液相色譜圖，用外標(biāo)法可計(jì)算出銀杏內(nèi)酯A(GA)、B、C、J和白果內(nèi)酯(BB)各自的含量，再計(jì)算出總的內(nèi)酯含量，在無(wú)水浸膏中總的萜烯內(nèi)酯含量約5～20％。
上述方法具體來(lái)說(shuō)，用高度純化的化學(xué)結(jié)構(gòu)為C27H30O16的蘆丁單體作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定銀杏總黃酮類(lèi)化合物含量。
上述方法具體說(shuō)來(lái)，用高度純化的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的槲皮素、山萘素、異鼠李素的單體作標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)測(cè)定銀杏葉組合物中黃酮醇苷和黃酮苷的含量。
上述方法具體說(shuō)來(lái)即用高度純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的GA、GB、GC、GJ和BB作標(biāo)準(zhǔn)品，鑒別內(nèi)酯并測(cè)定內(nèi)酯含量。
上述方法具體來(lái)說(shuō)即用高度純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的銀杏酸作標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)鑒定銀杏葉組合物中的銀杏酸。
實(shí)例6、包衣片，每片含銀杏浸膏 40.00mg乳糖 100.00mg淀粉 40.00mg微晶纖維素 36.00mg羥丙基甲基纖維素 30.00mg硬脂酸鎂 1.50mg歐巴托(OPADRY)(用于包衣) 7.50mg包衣片總量 約255.00mg實(shí)例7、顆粒劑每袋的組成銀杏浸膏 40mg蔗糖 20mg糊精 480mg淀粉 20mg羥丙基纖維素 20mg甜葡糖苷 20mg顆?？偭? 1000mg實(shí)例8、注射液1安瓿包括銀杏浸膏 40mg甘露醇 100mg煙酰胺 100mg精氨酸單鹽酸鹽 50mg乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na) 4.00mg實(shí)例9、飲料500ml飲料包括銀杏浸膏2.0g38％乙醇500ml香料適量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)本發(fā)明中描述的銀杏提取物可用常規(guī)方法配制制劑，例如，可制成口服液，包衣片劑，片劑或注射劑。本發(fā)明中的制劑可用來(lái)治療腦血管和外周血管循環(huán)障礙，尤其是可用于治療冠脈疾病所引起的心絞痛，在中國(guó)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，共243個(gè)病例證實(shí)了銀杏提取物在治療冠心疾病引起的心絞痛是安全有效的，臨床試驗(yàn)詳細(xì)情況概述如下參加醫(yī)院4家醫(yī)院參加了這項(xiàng)臨床試驗(yàn)，包括北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門(mén)醫(yī)院；上海醫(yī)科大學(xué)附屬華山醫(yī)院；上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院；上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院。
病人選擇標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)在1995年11月至1996年7月進(jìn)行，243個(gè)患有冠脈疾病引起的心絞痛病人參與了試驗(yàn)。
選擇病人的標(biāo)準(zhǔn)如下
入選標(biāo)準(zhǔn)病人被明確診斷為心絞痛，胸痛每周發(fā)作2次以上。心電圖上缺血改變或運(yùn)動(dòng)測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性。
排除標(biāo)準(zhǔn)(1)病人具活動(dòng)性心肌缺損或別的心肺功能疾病者，以及重度神經(jīng)官能癥，更年期綜合癥和頸椎病引起的胸痛。(2)病人患心絞痛并有高血壓者(BP＞24/14.87Kpa)。(3)病人具嚴(yán)重的心肺功能衰竭，嚴(yán)重的心律失常，肝腎功能異常和造血功能障礙者。(4)哺乳期婦女和過(guò)敏體質(zhì)患者。(5)年齡小于18歲或是大于70歲者。
刪除數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)不按處方服藥的病人和缺少資料，臨床試驗(yàn)結(jié)果無(wú)法確定的病人。
研究者隨機(jī)把153個(gè)病人分屬銀杏組，90個(gè)病人分屬對(duì)照組。銀杏組再隨機(jī)分組，123個(gè)屬測(cè)試組，30個(gè)屬開(kāi)放組。在4個(gè)醫(yī)院中治療的243位病人的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是表1-表5，結(jié)果表明，三組中的性別、年齡、發(fā)病時(shí)間，心絞痛和并發(fā)癥的種類(lèi)和嚴(yán)重程度均表現(xiàn)出顯著差異，住院比例為72.4％。
表1 3組中年齡平均值和性別分布情況P＞0.05

表2 3組中疾病持續(xù)時(shí)間P＞0.05

表3 3組中心絞痛嚴(yán)重程度P＞0.05

表4 3組中心絞痛類(lèi)型 P＞0.05

表5 3組中心絞痛的并發(fā)癥P＞0.05

診斷標(biāo)準(zhǔn)1、心絞痛嚴(yán)重程度的診斷標(biāo)準(zhǔn)在臨床試驗(yàn)中心絞痛嚴(yán)重程度的診斷標(biāo)準(zhǔn)是參照1979年中西藥結(jié)合治療冠心病心絞痛及心律失常研討會(huì)《冠心病心絞痛及心電圖療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》，標(biāo)準(zhǔn)詳述如下(1)輕度典型的心絞痛發(fā)作常持續(xù)幾分鐘，1天發(fā)作1-3次或每周2～3次，發(fā)作并不嚴(yán)重，但病人有時(shí)需要服用硝酸甘油。
(2)中等程度每天心絞痛發(fā)作超過(guò)3次，每次持續(xù)幾分鐘至10分鐘，疼痛比輕度發(fā)作嚴(yán)重，且病人通常需要服用硝酸甘油。
(3)嚴(yán)重每天心絞痛發(fā)作頻繁，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且嚴(yán)重，日常生活受影響，病人經(jīng)常服用硝酸甘油。
2、心絞痛類(lèi)型的診斷標(biāo)準(zhǔn)在臨床試驗(yàn)中心絞痛類(lèi)型的診斷標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)及世界衛(wèi)生組織聯(lián)合委員會(huì)制訂的《缺血性心臟病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)》，診斷標(biāo)準(zhǔn)詳述如下(1)勞累型心絞痛由于過(guò)度疲勞或其它增加心肌耗氧量需求引起的短暫性胸痛發(fā)作，疼痛通過(guò)休息或服用硝酸甘油后能迅速緩解。
(2)自發(fā)性心絞痛胸痛發(fā)作與任何提高心肌耗氧量的狀況無(wú)明顯關(guān)系，與勞累型心絞痛相比，疼痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且更嚴(yán)重，通常服用硝酸甘油不易緩解。
(3)混合型心絞痛自發(fā)性心絞痛可伴隨勞累型心絞痛產(chǎn)生，稱(chēng)為混合型心絞痛。
臨床試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)按以下方法進(jìn)行243個(gè)患冠脈疾病引起的心絞痛患者參加了試驗(yàn)。研究者把153個(gè)病人作為銀杏試驗(yàn)組，90個(gè)病人為對(duì)照組，銀杏試驗(yàn)組再隨機(jī)把123個(gè)病人分為測(cè)試組，30個(gè)病人分為開(kāi)放組，這213個(gè)測(cè)試組與對(duì)照組的病例采用雙盲，放大平行對(duì)照和開(kāi)放治療法進(jìn)行。銀杏組所用藥物為這項(xiàng)發(fā)明所述銀杏提取物的制劑。1g制劑含40mg銀杏提取物，480mg糊精，420mg蔗糖，20mg淀粉，20mg低取代羥丙基纖維素和20mg甜菊糖甙。銀杏制劑先制成顆粒然后裝入小袋，每袋1g在臨床試驗(yàn)中病人每次服用1袋銀杏制劑，每天3次，治療周期為6周。
對(duì)照組所用藥物為百路達(dá)(Brainway)，由位于中國(guó)上海四川北路70號(hào)的上海信誼藥廠生產(chǎn)。臨床試驗(yàn)中病人每次服1粒百路達(dá)，每天3次。作為陽(yáng)性對(duì)照品，治療周期同樣6周。
由于兩藥劑型不同(顆粒劑和膠囊)，所以各組均加服不同劑型的空白安慰劑，即治療組除服用銀杏顆粒外，加服空白膠囊(安慰劑)，對(duì)照組服用百路達(dá)外，加服空白顆粒劑(安慰劑)。各安慰劑的包裝、外觀均與相應(yīng)藥物完全一致。
從臨床試驗(yàn)前一周開(kāi)始，停服長(zhǎng)效冠心病藥物。病人患輕度高血壓者允許服用他們的常用藥。如病人不能忍受心絞痛發(fā)作時(shí)，硝酸甘油可暫時(shí)服用。
評(píng)估藥物療效的標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部1993年頒布的《中藥新藥臨床試驗(yàn)指南》關(guān)于冠心病心絞痛病人的治療這一部分以及1979年中西藥結(jié)合治療冠心病心絞痛及心律失常研討會(huì)，《冠心病心絞痛及心電圖療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行評(píng)價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)詳述如下對(duì)輕度心絞痛病人(1)顯效胸痛消失或基本消失(2)有效胸痛發(fā)作明顯減輕(3)無(wú)效胸痛癥狀無(wú)改善(4)惡化胸痛發(fā)作加重，達(dá)到“中度”以上標(biāo)準(zhǔn)度。
對(duì)中度心絞痛病人(1)顯效胸痛癥狀消失(2)有效胸痛減輕或達(dá)到輕度標(biāo)準(zhǔn)(3)無(wú)效沒(méi)有觀察到有改善(4)惡化胸痛加劇，達(dá)到“較重度”水平。
對(duì)較重心絞痛病人(1)顯效胸痛消失或減輕到“輕度”標(biāo)準(zhǔn)(2)有效胸痛減輕到“中度”標(biāo)準(zhǔn)(3)無(wú)效胸痛癥狀與治療前相同(4)加重胸痛癥狀加重(或達(dá)到“重癥標(biāo)準(zhǔn)”)。
心電圖療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(1)顯效心電圖恢復(fù)到“大致正?！被蜻_(dá)到“正常心電圖”(2)有效降低的S-T段，提高＞0.05mv，但不到正常水平，T波變化降低，或T波變化從平到向上，房室阻滯或室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯改善。
(3)無(wú)效在心電圖上未觀察到改善。
(4)加重治療后S-T段降低加重，T波加深或T波從平坦變?yōu)榈怪?，以及出現(xiàn)異位心律及心律失常者。
計(jì)算停止硝酸甘油停減率 臨床試驗(yàn)結(jié)論在臨床試驗(yàn)中，銀杏組和對(duì)照組沒(méi)有觀察到明顯的副作用，只有3個(gè)病人在治療過(guò)程中有胃不適，其中一位病人有輕度嘔吐，未經(jīng)治療即緩解。
從隨機(jī)對(duì)照、雙盲和開(kāi)放的臨床試驗(yàn)資料結(jié)果表明，這項(xiàng)發(fā)明中銀杏提取物制劑在治療冠心病心絞痛是安全、有效的。銀杏制劑顯示了很強(qiáng)的生物活性，與現(xiàn)有的治療心絞痛的中藥制劑比較，在安全性和有效性?xún)煞矫?，銀杏制劑在一個(gè)或多個(gè)方面已超過(guò)現(xiàn)有制劑，且能降低硝酸甘油的使用。
1、銀杏制劑藥效成份在治療冠心病心絞痛時(shí)是有效的，且療效超過(guò)了對(duì)照藥物。
表6銀杏提取物藥效成份對(duì)心絞痛病人的作用

**P＜0.01，*P＜0.05，與對(duì)照組比。
2、銀杏制劑藥效成份在改善缺血性心電圖時(shí)是有效的，且有效率超過(guò)了對(duì)照組。
表7銀杏提取物藥效成份改善缺血性心電圖的作用

3、銀杏制劑藥效成份在減輕心絞痛過(guò)程中是有效的，且在減少硝酸甘油的使用上作用強(qiáng)于對(duì)照組。
表8銀杏提取物藥效成份對(duì)硝酸甘油停減情況

*P＜0.01，與對(duì)照組比4、銀杏制劑藥效成份能有效減輕心悸，且有效率超過(guò)了對(duì)照組。
表9銀杏提取物藥效成份對(duì)心絞痛癥狀的改善

*P＜0.01與對(duì)照組比5、銀杏制劑有效成份能有效降低血脂異常病人的膽固醇及甘油三酯水平。
表10銀杏提取物有效成份對(duì)血脂異常病人血脂的作用

*P＜0.05，與給藥前比6、銀杏制劑藥效成份能降低中等密度和低密度全血比重，抑制血小板聚集，且給藥前與給藥后差異顯著。
表11銀杏提取物藥效成份對(duì)病人血象變化的作用

*P＜0.05，**P＜0.01與給藥前比。
7、銀杏制劑藥效成份具有改善運(yùn)動(dòng)耐受力和延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)開(kāi)始和心絞痛發(fā)作間隔時(shí)間，以及運(yùn)動(dòng)開(kāi)始至ST段降低1mm間隔時(shí)間。且此作用強(qiáng)于對(duì)照藥物。
表12銀杏提取物藥效成份對(duì)病人運(yùn)動(dòng)能力的作用

*P＜0.05**P＜0.01與給藥前比^P＜0.05 ^^P＜0.01與對(duì)照組比8、銀杏制劑藥效成份可用于各種類(lèi)型與不同程度的心絞痛，(表13、14)，且不影響血壓和心率(表15)，也不影響肝、腎功能。
表13銀杏提取物藥效成份對(duì)3種程度心絞痛的作用

表14銀杏提取物藥效成份對(duì)3種類(lèi)型心絞痛的作用

表15 3組病人給藥前后血壓和心率變化表(X±SD)

表16銀杏提取物藥效成份對(duì)病人肝腎功能的影響

通過(guò)上述說(shuō)明可見(jiàn)，本發(fā)明提供了一種新的銀杏葉提取物組合物，該組合物的制備方法，以及組合物中各種成分的檢測(cè)方法。所述組合物可用作食品添加劑或加到飲料中，也可添加到霜?jiǎng)?、油膏劑或制作它們的原料中。所述組合物也可制成口服制劑、注射劑或化妝品。將本發(fā)明的組合物與藥用載體結(jié)合可制成藥用組合物從而治療冠心病引起的不同程度不同類(lèi)型的心絞痛、缺血性心臟病、心悸、降低血小板凝集、改善運(yùn)動(dòng)耐受力和延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)持久力、治療陽(yáng)萎、牛皮癬、色素沉著等疾病。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定銀杏葉組合物中總黃酮含量的方法，包括以下步驟a)將干燥的蘆丁溶于70％乙醇配成標(biāo)準(zhǔn)溶液；b)移取不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，每一容量瓶中均加入pH為4.5的水、乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.1M氯化鋁和70％乙醇，以每個(gè)樣品270nm下的吸收描點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)線；c)依據(jù)分光光度法進(jìn)行檢驗(yàn)，將組合物以70％乙醇溶解，移取一定量的溶液于容量瓶中，其余同上測(cè)定270nm下的吸收，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得知樣品的濃度，按無(wú)水狀態(tài)下總黃酮含量以蘆丁計(jì)為標(biāo)示量的85％-115％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中以所述的蘆丁單體作為標(biāo)準(zhǔn)品以測(cè)定銀杏葉組合物中總黃酮的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定銀杏葉組合物中總黃酮含量的方法。在本發(fā)明方法中用蘆丁配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度法進(jìn)行檢驗(yàn)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到待測(cè)樣品中總黃酮含量。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1740787SQ200510105218
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期1999年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月19日
發(fā)明者謝德隆, 王寧, 高崎, 張國(guó)安, 邵寶平, 金小吾, 黃新生 申請(qǐng)人:上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司