Sepulturin A在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物SepulturinA的新用途，具體涉及SepulturinA在制備心肌 保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ElihiiBautista等人首次分離純化出化合物SepulturinA，并將成果發(fā)表在 著名天然產(chǎn)物雜志JournalofNaturalProduct上（HydroxyclerodanesfromSalvia shannoni，J.Nat.Prod.，2013, 76,1970-1975)。
[0003] 目前尚未有該化合物關(guān)于心肌保護(hù)活性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種SepulturinA的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] SepulturinA在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用，所述SepulturinA化學(xué)結(jié)構(gòu)式如 下，
[0007]

【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。
[0009] 實(shí)施例I:SepulturinA的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0010] SepulturinA的制備方法同文獻(xiàn)報(bào)道的制備方法（Hydroxyclerodanesfrom Salviashannoni，J.Nat.Prod.，2013, 76,1970-1975)。
[0011] 結(jié)構(gòu)確證：無色結(jié)晶，恪點(diǎn)252-254°C，分子式為CmH22O7，不飽和度為10。核磁共 振氫譜數(shù)據(jù)SH(ppm，DMS0-d6,500MHz) :H-1 (3. 27,d，J= 3. 5)，H-2(3. 51，m)，H-3(2. 33， ddd，J= 15. 0,5. 0,1. 5)，H-3(l. 81，ddd，J= 15. 5,12. 5,2. 5)，H-4(2. 59,dd，J= 12. 5， 5. 0)，H-6(l. 27,ddd，J= 11. 0,3. 0,1. 0)，H-6(l. 59,m)，H-7(2. 06,m)，H-7(l. 60,m)， H-8(2. 57,m)，88,dd，J= 16. 0,7. 5)，04,m)，H-12(5. 61，dd，J= 8. 5， I. 5)，H-14 (6. 30,m)，H-15 (7. 37,t，J=I. 5)，H-16 (7. 29,m)，H-19 (4. 10,d，J= 8. 5)， H-19(4.16，dd，J= 8.5,2.0)，H-20(1.19，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS0-d6，150Hz): 56. 0 (CH，1-C)，58. 7 (CH，2-C)，19. 6 (CH2, 3-C)，35. 8 (CH，4-C)，47.I(C，5-C)，21.I(CH2， 6-C)，16. 3 (CH2, 7-C)，43. 3 (CH，8-C)，41. 6 (C，9-C)，73. 3 (C，10-C)，34. 9 (CH2, 11-C)， 71. 7(CH，12-C)，126. 2(C，13-C)，108. 5(CH，14-C)，144. 4(CH，15-C)，138.6 (CH，16-C)， 173. 0 (C，17-C)，175. 4 (C，18-C)，70. 3 (CH2,19-C)，26. 6 (CH3, 20-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào) 道一致，因此可以確定本發(fā)明制備的化合物即為文獻(xiàn)報(bào)道的SepulturinA。
[0012] 實(shí)施例2:SepulturinA的藥理作用試驗(yàn)
[0013] -、材料和儀器
[0014] 新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF級(jí)），雌雄不拘，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提 供（試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2009-0002)。S印ulturinA(純度彡98%)為自制。胎 牛血清購于HyClone公司，DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司，二甲基亞砜（DMSO)、0. 25 %胰酶 (含EDTA)購于Solarbio公司，5-溴脫氧尿苷（5-Brdu)、四甲基偶氮唑鹽（MTT)購于美國 Sigma公司，LDH測試盒購于南京建成生物工程研究所，NOS試劑盒（分型）南京建成生物 工程研究所，ATP酶試劑盒（南京建成生物工程研究所），cTnl酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒、 CK-MB酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒購于武漢優(yōu)爾生。
[0015]CO2培養(yǎng)箱（ThermoForma)，CKX41 相差顯微鏡（OLUMPUS),Model450 自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國Bio-Rad公司），96孔板（JET)，722sp可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）， 可調(diào)式微量移液器（ThermoForma)，單人單面超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備總廠），XD-101型 倒置生物顯微鏡（南京江南光電），DW-40L262 (低溫保存箱）、DW-86L628立式超低溫保存 箱（Haier特種電器有限公司），手提式壓力蒸汽滅菌器、立式蒸汽滅菌器（廣州華南醫(yī)藥器 械有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平儀器廠），541?型低溫高速離心機(jī)（德國 Eppendorf)，LQP-B-4顆粒制冰機(jī)（上海安亭）。
[0016] 二、試驗(yàn)方法
[0017] 1、心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)
[0018] 具體步驟：（1)超凈工作臺(tái)中，將乳鼠放置于250mL燒杯中，噴以75%酒精進(jìn)行皮 膚消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持無菌眼科剪在胸骨正中偏左平劍突刺入胸腔，抬起剪 刀頭端，向前挑起剪一縱向切口，再平劍突往左右剪開約2cm，左手捏住背部皮膚擠壓胸部， 就可以見跳動(dòng)的心臟，換無菌彎鑷將心臟取出，置于冷的PBS溶液培養(yǎng)皿中。用無菌眼科剪 和鑷除去心房、結(jié)締組織及細(xì)胞膜后將心臟放入IOmL西林瓶中，用冷PBS溶液反復(fù)沖洗三 遍，洗凈殘血。（3)用無菌彎剪剪碎心臟（約1~2mm大小），加入冷PBS溶液，并沖洗無菌 彎鑷，用吸管將小組織塊懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，冷PBS再清洗兩遍。（4)第一、二次消化：按 預(yù)溫好的胰酶與組織塊以2:1的比例緩慢沿離心管壁緩慢加入，室溫下以無菌吸管反復(fù)輕 柔吹打幫助消化，觀察組織塊出現(xiàn)絲狀物，上清變渾濁，根據(jù)濁度停止消化，吸出第一、二次 消化的上清液，棄去。（5)繼續(xù)消化，步驟同（4)，直至小組織炔基本消化完全為止。收集細(xì) 胞懸液。（6)將所有細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消 化，冷PBS洗滌，1000 rpm離心2次，每次8min，棄去上清。（7)臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)：（6)所得沉淀中 加入適量DMEM培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，取0. 4%臺(tái)盼蘭染液10yL與細(xì)胞懸液90yL混勻， 室溫放置2~3min，將清潔的細(xì)胞計(jì)數(shù)板放置在倒置顯微鏡臺(tái)上，在蓋玻片邊緣滴1~2滴 已染色好的細(xì)胞懸液，鏡檢可見圓形分散的細(xì)胞分布在各處，活細(xì)胞整體完整，透明而不著 色，而不健康細(xì)胞會(huì)著色，計(jì)數(shù)時(shí)除去，計(jì)數(shù)四大方格的細(xì)胞數(shù)。壓線的細(xì)胞只記左線和上 線者，細(xì)胞團(tuán)按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算懸液的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)/mL=四大方格細(xì)胞 數(shù)總數(shù)/4X10000X稀釋倍數(shù)（8)按3XIO5~5X10 5細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)瓶中，放入95 % 02, 5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁約2h。差速貼壁后的細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)板中，前48h加入終 濃度為100ymol/L的5-Brdu，以抑制非心肌細(xì)胞的生長，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每24h 進(jìn)行換液。
[0019] 2、過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立
[0020] 選取培養(yǎng)3~4天、生長良好、搏動(dòng)規(guī)律的心肌細(xì)胞，吸棄孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，換新培養(yǎng) 基，同時(shí)加入終濃度為600ymol/L的H2O2，重置于0)2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)24h，建立H202誘 發(fā)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。
[0021] 3、實(shí)驗(yàn)分組及給藥
[0022] S印ulturinA給藥設(shè)低、中、高三個(gè)劑量組，濃度分別為0? 6、6和60ymol/L;陽 性藥物維拉帕米（Verapamil)組的終濃度為25ymol/L。選擇生長良好、搏動(dòng)規(guī)律的細(xì)胞， 隨機(jī)分為：正常（control);模型（Model);陽性藥物組；溶媒對(duì)照組（DMSO)!Sepulturin A低、中、高劑量，共7組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組均于造模前12h吸去孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，換成 Hanks液以使各組細(xì)胞同步生長（即平衡），各給藥組在造模前加入相應(yīng)藥物預(yù)孵2h。除正 常組外，平衡后的各組細(xì)胞均按上方法加入建立心肌細(xì)胞H2O2損傷模型。造模結(jié)束后吸取 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20°C冰箱保存待測生化指標(biāo)。各組心肌細(xì)胞則按常規(guī)方法加入適量 0. 125%胰蛋白酶消化，4°C、800rpm離心10min，棄去上清，以生理鹽水制成2X106~3X106 細(xì)胞懸液，_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0023] 4、MTT法測定心肌細(xì)胞存活力
[0024] 用96孔板培養(yǎng)的各組心肌細(xì)胞于造模后加入10yLMTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng) 液，加入DMSO150yL，平板震蕩器震蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解。以Hanks液培養(yǎng)調(diào)零，用 酶標(biāo)儀以570/630nm雙波長測定去除本底光吸收值后的吸光度（0D值），重復(fù)3次。
[0025]5、心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力的測定
[0026] 實(shí)驗(yàn)原理：乳酸脫氫酶（LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2, 4-二硝基苯肼 反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。樣品前處 理，按照下表進(jìn)行。依照試劑盒要求將輔酶I、堿性溶液適當(dāng)稀釋。
[0027]
[0028] 計(jì)算心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力：LDH活力（U/L) = (ODu-ODc)/ (ODs-ODb)XCsXNX1000。N為培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù)。
[0029] 6、統(tǒng)計(jì)分析
[0030] 數(shù)據(jù)采用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（i±S)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)， 計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。
[0031] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0032] 1、過氧化氫損傷前后心肌細(xì)胞活力
[0033] 正常組的細(xì)胞存活率按100%計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果顯示=H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活率 較正常組心肌細(xì)胞下降（P〈〇.05);DMS0溶媒組與模型組相比較，DMSO對(duì)心肌細(xì)胞存活率無 影響（P>0.05);而S印ulturinA各給藥組均能使心肌細(xì)胞存活率明顯增加（P〈0.01)。結(jié) 果見表I(*P〈〇. Olvs正常組，#P〈0.0 lvs模型組，▲PM).05vs模型組）。
[0034] 2、心肌細(xì)胞過氧化氫損傷培養(yǎng)液中LDH的活性
[0035] 與正常組比，模型組LDH含量明顯增高（P〈0. 01);與模型組比較，溶媒組的LDH含 量無顯著性差異（P>〇.05)，而S印ulturinA低、中、高劑量組、陽性藥物組的LDH活性明顯 降低（P〈〇.01)。結(jié)果見表2(*P〈0.0 lvs正常組，#P〈0.0 lvs模型組，▲PM).05vs模型組）。
[0036] 提示S印ulturinA可以進(jìn)一步研究開發(fā)成心肌細(xì)胞保護(hù)的藥物。
[0037] 表1SepulturinA對(duì)H2O2應(yīng)激損傷后心肌細(xì)胞存活率的影響（X土s, n=6)
[0038]

【主權(quán)項(xiàng)】
1.SepulturinA在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用，所述SepulturinA化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下，
【專利摘要】本發(fā)明公開了Sepulturin？A在制備心肌保護(hù)藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)SepulturinA能使H2O2應(yīng)激損傷后的心肌細(xì)胞存活率明顯增加，可以進(jìn)一步研究開發(fā)成制備心肌保護(hù)的藥物。
【IPC分類】A61P9/00, A61K31/365
【公開號(hào)】CN105078968
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510590295
【發(fā)明人】潘光賢
【申請(qǐng)人】潘光賢
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月16日