Phaeocaulisin A在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物PhaeocaulisinA的新用途，具體涉及PhaeocaulisinA在制 備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] YueLiu等人首次分離純化出化合物PhaeocaulisinA，并將成果發(fā)表在著名天然 產(chǎn)物雜志JournalofNaturalProduct上（Guaiane-TypeSesquiterpenesfromCurcuma phaeocaulisandTheirInhibitoryEffectsonNitricOxideProduction,J.Nat. Prod. ，2013,76,1150-1156)。
[0003]目前尚未有該化合物的活性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種PhaeocaulisinA的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] PhaeocaulisinA在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，所述PhaeocaulisinA化學(xué) 結(jié)構(gòu)式如下，
[0007]
[0008] 進(jìn)一步地，所述黑色素瘤為人A375黑色素瘤。
【附圖說明】
[0009] 圖I=BrdU免疫熒光檢測細(xì)胞增殖結(jié)果。
【具體實施方式】
[0010] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。
[0011] 實施例I:PhaeocaulisinA的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0012] PhaeocaulisinA的制備方法同文獻(xiàn)報道的制備方法（Guaiane-Type SesquiterpenesfromCurcumaphaeocaulisandTheirInhibitoryEffectsonNitric OxideProduction，J.Nat.Prod.，2013, 76,1150-1156)〇
[0013] 結(jié)構(gòu)確證：結(jié)合HRESI-MS(m/z281. 1387 [M+H]+)和NMR數(shù)據(jù)可得分子式為 C15H2qO5，不飽和度為6。紅外光譜表明化合物含有羥基（3452cm1)和羰基（1756cm1)基團(tuán)， 紫外光譜在215nm處有一個最大吸收波長，表明該化合物含有a，0不飽和Y-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH (ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-2 (1. 58,m)，H-2 (2. 02,m)，H-3 (1. 82,m)， H-3 (I. 76,m)，H-5 (2. 56,d，J= 8. 8)，H-6 (2. 87,d，J= 16. 8)，H-6 (2. 78,ddd，J= 16. 8， 8. 8, 2. 0)，H-9 (2. 22,d，J= 13. 8)，H-9 (2. 12,d，J= 13. 8)，H-13 (I. 74,d，J=I. 92)， H-14(l. 11，s)，H-15(l. 34,s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)SG(ppm，DMS0-d6,75Hz) :96. 3(C，1-C)， 28. 5 (CH2, 2-C)，39. 8 (CH2, 3-C)，80. 8 (C，4-C)，50. 4 (CH，5-C)，21.I(CH2, 6-C)，162. 4 (C， 7-C)，107.I(C，8-C)，47.I(CH2,9-C)，76. 9(C，10-C)，118. 8(C，11-C)，174. 3(C，12-C)， 7. 9 (CH3,13-C)，25. 9 (CH3,14-C)，27. 9 (CH3,15-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，因此可 以確定本發(fā)明制備的化合物即為文獻(xiàn)報道的PhaeocaulisinA。
[0014] 實施例2:PhaeocaulisinA的藥理作用試驗
[0015] 一、材料和儀器
[0016] 人A375黑色素瘤細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈。PhaeocaulisinA自制，HPLC歸一 化純度大于98%。DMEM培養(yǎng)基、0.25 %胰酶購自美國Gibco公司。MTT(3-(4, 5-二甲基 噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍(lán)）、DMSO(二甲基亞砜）、BrdU購自美 國Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cell signaling公司。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0017] 恒溫CO2培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺 (中國蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）。電熱恒溫培 養(yǎng)箱（中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。自動酶標(biāo)儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀（美 國Beckman公司）。J6-HC高速離心機(jī)（美國Beckman公司）。低溫微量離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）。振蕩搖床（美國Forma公司）。
[0018] 二、試驗方法
[0019] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0020] I. 1細(xì)胞復(fù)蘇
[0021] 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細(xì)胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動 使其盡快融化（大約lmin)。然后吸出細(xì)胞懸液，加入到已加有2mL培養(yǎng)基的離心管中，輕 輕吹打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養(yǎng)基。用含有10 %FBS和1 %的青霉G/鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)基8mL制成細(xì)胞懸液后，接種至IOcm培養(yǎng)盤中。然后置于5 %C02、37°C恒 溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0022] 1. 2細(xì)胞傳代
[0023] 顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)80% -90%時即可進(jìn)行傳代。先用2mLPBS洗滌細(xì)胞2 次，然后加入0. 25%的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養(yǎng)盤，使消化液能覆蓋細(xì)胞的表面，然后 置于37°C溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細(xì)胞變圓回縮，然后迅速加入ImL含有FBS 的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打至細(xì)胞分散均勻，然后根據(jù)細(xì)胞密度按照1:2或1:3傳代，重 新接種于新的培養(yǎng)盤中，置于5%C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0024] 1. 3細(xì)胞凍存
[0025] 取1盤處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化并收集到離心管中，1000 r/min離心 5min，棄上清。然后加入ImL凍存液，輕輕吹散細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入到I. 5mL 的凍存管中。在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，保存時間，保存者的姓名。先將凍存管放入4°C冰箱，放置約30min。接著置于-20°C冰箱，放置約2h。然后放于-80°C超低溫冰箱中放置 過夜。第二天將凍存的細(xì)胞置于液氮罐中長期保存。
[0026] 2、細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線
[0027] (1)取對數(shù)生長期A375黑色素瘤細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2X104/mL。
[0028] (2)將細(xì)胞懸液接種于12孔板中，I. 5mL/孔。
[0029] (3) 12h后，待細(xì)胞貼壁，換ImL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/ LPhaeocaulisinA和DMSO(對于DMSO稀釋的PhaeocaulisinA控制在DMSO濃度在 1/1000 以下，確保對細(xì)胞無害）處理，每組細(xì)胞設(shè)3個平行孔，置于5%C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn) 行培養(yǎng)。
[0030] (4)分別于他、2411、4811、7211、9611終止培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶 消化，離心，重懸。
[0031] (5)細(xì)胞計數(shù)：吸取細(xì)胞混懸液10y1，加入等體積的臺酚藍(lán)區(qū)分活細(xì)胞，吸取 10yL混合液輕輕加入細(xì)胞計數(shù)板凹槽中，保證無空隙和氣泡。倒置顯微鏡下，計數(shù)周邊四 個大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，代入公式：原細(xì)胞混懸液濃度（細(xì)胞數(shù)/mL) = (4個大方格的細(xì)胞數(shù) /4)XlO4X稀釋倍數(shù)。
[0032] (6)計算活細(xì)胞數(shù)目，繪制細(xì)胞生長曲線。
[0033]3、MTT法檢測細(xì)胞增殖
[0034] (1)取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，消化，離心，重懸，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液中細(xì)胞的密 度為 2X104/mL。
[0035] (2)將各組細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，200yL每孔，每組細(xì)胞3個平行孔，同 時設(shè)空白對照孔（只加入培養(yǎng)基）。
[0036] (3) 12h待細(xì)胞貼壁后，換200yL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L PhaeocaulisinA和DMSO處理。
[0037] (4)分別于0、1、2、3、4天終止培養(yǎng)。
[0038] (5)向每孔加入濃度為5mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT) 20yL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4h。
[0039] (6)吸棄各小孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入200yLDMS0,在微振蕩器上振蕩lOmin，使結(jié)晶 物充分溶解。
[0040] (7)以空白對照孔調(diào)零，采用自動酶標(biāo)儀測定各孔570nm處的吸光光度值（0D 值），以對應(yīng)的OD值表示細(xì)胞增殖能力，各組取3個平行孔的平均值，以時間為橫軸，以各吸 光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。
[0041] 4、BrdU免疫熒光檢測細(xì)胞增殖
[0042] (1)準(zhǔn)備爬片：將爬片放入75%酒精中浸泡24h消毒處理。
[0043] (2)將無菌爬片放置24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取對數(shù)生長期的A375黑色素瘤細(xì)胞，消化，離 心，制成細(xì)胞懸液，2XIO4ceIl/孔，接種于放有爬片的孔中。
[0044] (3) 12h待細(xì)胞貼壁后，換ImL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L PhaeocaulisinA和DMSO處理。
[0045] (4)72h后，在培養(yǎng)基中加入 10yIBrdU(lmg/mL)，37°C培養(yǎng)lh。
[0046] (5)取出24孔板，以冷PBS洗5minX2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫30min。
[0047] (6)PBS洗 5minX3 次。
[0048] (7) 2mol/LHCl處理，室溫IOmin后，37°C20min〇
[0049] (8)細(xì)胞用 1%TritonX-IOO通透處理，洗 5minX3 次。
[0050] (9) 10%山羊血清封閉，室溫，lh。
[0051] (10)加入BrdU單克隆抗體（1:300 稀釋），37°C1.5h。
[0052] (11)IXPBST搖洗 5minX3 次。
[0053] (12)加BrdU二抗（1:300)，室溫避光Ih后，IXPBST洗 3 次。
[0054] (13)DAPI染色液染細(xì)胞核15min。
[0055] (14)PBS洗 5minX3 次。
[0056] (15)加1滴抗焚光淬滅封片液，中性樹膠封片，焚光顯微鏡下觀察、照相。
[0057] 5、統(tǒng)計分析
[0058] 應(yīng)用SPSS17. 0統(tǒng)計分析軟件，采用兩獨立樣本t檢驗及單因素方差分析進(jìn)行數(shù) 據(jù)分析，數(shù)據(jù)用X±S表示，P〈0. 05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0059] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0060] 細(xì)胞形態(tài)觀察及計數(shù)顯示，與DMSO對照組比，PhaeocaulisinA處理A375細(xì)胞 24h、48h、72h后，活細(xì)胞顯著降低達(dá)44. 5%。結(jié)果見表1 (與對照組比*P〈0. 05廣P〈0. 01，下 同）。
[0061]MTT結(jié)果顯示，PhaeocaulisinA能顯著抑制A375細(xì)胞增殖，OD值呈濃度（5ymol/ 1、10^111〇1/1、20^111〇1/1)依賴性下降達(dá)27.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2 〇
[0062] 通過BrdU免疫焚光染色進(jìn)一步證實PhaeocaulisinA能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖， 5ymol/LPhaeocaulisinA處理A375細(xì)胞3天后，與對照（26. 07±2. 59%)相比，實驗組 BrdU陽性細(xì)胞百分比（7. 55 ±2. 76% )顯著降低（P= 0. 000)。結(jié)果見圖I(#P〈0. 01)。
[0063] 本實驗檢測了PhaeocaulisinA對黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞計數(shù)和MTT分 析結(jié)果均證明PhaeocaulisinA可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞生長，且細(xì)胞數(shù)與Phaeocaulisin A濃度呈依賴性下降。BrdU免疫熒光染色也顯示PhaeocaulisinA處理后BrdU陽性 細(xì)胞百分比顯著低于對照組，說明PhaeocaulisinA可抑制A375黑色素瘤細(xì)胞增殖。 PhaeocaulisinA可能是黑色素瘤的有效革E向治療藥物。
[0064]表IPhaeocaulisinA劑量依賴性抑制A375細(xì)胞增殖（細(xì)胞計數(shù)法，單位：XIO4/ ml) (X土S，n=3)
[0065]
[0066]表 2PhaeocaulisinA劑量依賴性抑制A375 細(xì)胞增殖（MTT法，0D570) (i±:S,
[0067]
【主權(quán)項】
1.PhaeocaulisinA在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，所述PhaeocaulisinA化學(xué)結(jié) 構(gòu)式如下，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PhaeocaulisinA在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，其特 征在于：所述黑色素瘤為人A375黑色素瘤。
【專利摘要】本發(fā)明公開了Phaeocaulisin？A在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。本實驗檢測了PhaeocaulisinA對黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞計數(shù)和MTT分析結(jié)果均證明Phaeocaulisin？A可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞生長，且細(xì)胞數(shù)與PhaeocaulisinA濃度呈依賴性下降。BrdU免疫熒光染色也顯示Phaeocaulisin？A處理后BrdU陽性細(xì)胞百分比顯著低于對照組，說明PhaeocaulisinA可抑制A375黑色素瘤細(xì)胞增殖。Phaeocaulisin？A可能是黑色素瘤的有效靶向治療藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/365
【公開號】CN105078967
【申請?zhí)枴緾N201510558950
【發(fā)明人】林天樣
【申請人】林天樣
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月5日