專利名稱：心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物的制作方法
技術(shù)范圍本發(fā)明涉及以作用于作為鈉利尿肽(NP)受體的鳥苷酸環(huán)化酶A(GC-A)、促進環(huán)鳥苷酸(cGMP)產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分的心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物。
背景技術(shù)：
當(dāng)發(fā)生因高血壓和心臟瓣膜疾病所致的心室負荷增大、或心肌梗塞、心肌炎和心肌疾病等引起的心肌細胞自身障礙時，心室為保持心輸出量，主要發(fā)生心肌細胞肥大的形態(tài)改變，即所謂心肌肥大。這種心肌肥大在一定程度上是對于心肌細胞障礙和機械負荷的適應(yīng)現(xiàn)象，但是持續(xù)過重負荷使心肌過度肥大時，收縮機能和擴張機能發(fā)生缺陷，心輸出量降低，甚至導(dǎo)致慢性心功能不全，以至于容易陷入缺血狀態(tài)發(fā)生致死性的心率不齊。心肌肥大的程度被作為決定心臟病預(yù)后的因素之一來考慮，根據(jù)以弗拉門哥斯塔丁(フラミンガムスタティ-)為代表的大規(guī)模普查，發(fā)現(xiàn)如果具有心肌肥大則心功能不全、冠心病和心肌梗塞等缺血性心臟病、心律不齊等的發(fā)病率上升2.5～3倍(山崎力、矢崎義雄，心不全，p37-45，筱山重威編，醫(yī)藥雜志社，1997)。所以，抑制過度心肌肥大形成、或使心肌肥大消退的藥物應(yīng)能夠有效防止含慢性心功能不全的心臟病的發(fā)病進程。
作為慢性心功能不全的治療方法，以前以改善心臟收縮力、增大心輸出量為目的主要應(yīng)用強心藥。然而，強心藥只顯示了急性的自覺癥狀改善、運動耐量改善的效果，在作為慢性心功能不全治療最終目標(biāo)的生命預(yù)后改善，即延長生命方面沒有效果，甚至得到預(yù)后變差的結(jié)果(Packer et al.,N.Engl.J.Med.,Vol.325,p1468,1991)。
另一方面，心肌肥大的發(fā)生和發(fā)展涉及兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、醛固酮、エンドセリン、加壓素等神經(jīng)體液因子，阻斷這些因子產(chǎn)生或信號傳遞系統(tǒng)的藥物的開發(fā)、臨床應(yīng)用正在進行。但是，機體內(nèi)心肌肥大的發(fā)生機制與這些因子的多個有關(guān)，只對單一因子有拮抗作用是不夠的。例如，作為血管緊張素Ⅱ生成酶的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的阻斷劑能抑制動物模型中心肌肥大的發(fā)病進程(Brilla et al.,Circulation,Vol.83,p1771,1991)，臨床上給予慢性心功能不全患者時，也可觀察到心肌肥大消退、生命予后延長(The Save Investigation,N.Engl.J.Med.,Vol.327,p678,1992)，但還不能說其效果是很好的。
實際上，即使進行最先進的治療，慢性心功能不全發(fā)病后5年內(nèi)的死亡率現(xiàn)在仍達50％。最近有報道說エンドセリン拮抗劑(Ito et al.,Circulation,Vol.89,p2198,1994)和加壓素拮抗劑(Tomura et al,Circulation,Vol.94(Supple.I-264),1996)在動物模型中能抑制心肌肥大的形成，但人們更希望有基于新機制的抑制心肌肥大的心臟病治療藥物。
發(fā)明的公開所以，本發(fā)明的目的在于提供可有效防止與慢性心功能不全等心臟病發(fā)病進展有關(guān)的心肌肥大的藥物組合物，更詳細地說，就是提供以結(jié)合作為鈉利尿肽(NP)受體的鳥苷酸環(huán)化酶A(GC-A)、促進環(huán)鳥苷酸(cGMP)產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分的心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物。
附圖的簡單說明

圖1表示在主動脈狹窄所致大鼠心肌肥大模型中，狹窄形成后給予ANP0.1μg/kg/分或5％葡萄糖1周時的Sham組、對照組和ANP給予組的尿排泄量(A)、和尿中鈉排泄量(B)的經(jīng)時變化。Δ表示Sham組(n=19),▲表示對照組(n=20),●表示ANP組(n=12)。此外各值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖2表示在腹部大動靜脈分流所致大鼠心功能不全模型中，手術(shù)2周后給予ANP0.1μg/kg/分或5％葡萄糖2周時的Sham組、對照組和ANP給予組的右心房重量/體重比(A)、左心房重量/體重比(B)、右心室重量/體重比(C)、左心室重量/體重比(D)。各值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。此外，*和**分別表示與Sham組之間具有p＜0.05、0.01的明顯差別，#和##分別表示與對照組之間具有p＜0.05、0.01的明顯差別。明顯差別以ANOVA的方差分析法進行判定。
圖3表示在與圖2的相同條件下，實驗結(jié)束時Sham組、對照組和ANP給予組的肺重量/體重比(A)、紅細胞壓積值(B)。各值表示為6例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*和**分別表示與Sham組之間具有p＜0.05、0.01的明顯差別，#和##分別表示與對照組之間具有p＜0.05、0.01的明顯差別。明顯差別以ANOVA的方差分析法進行判定。
發(fā)明實施的形式本發(fā)明涉及以作用于作為鈉利尿肽(NP)受體的鳥苷酸環(huán)化酶A(GC-A)、促進環(huán)鳥苷酸(cGMP)產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分的心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物。作為心肌肥大性心臟病的具體例子，有心功能不全(例如慢性心功能不全)、缺血性心臟病(例如心肌梗塞、冠心病)和心律不齊等。
作為本發(fā)明藥物組合物有效成分使用的物質(zhì)，是具有通過作為NP受體的GC-A介導(dǎo)促進cGMP產(chǎn)生的特性的物質(zhì)，沒有什么特殊的限定。為了得到具有該特性的物質(zhì)，可以將候選物質(zhì)加入發(fā)現(xiàn)有GC-A的細胞或組織(例如血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、腎上腺皮質(zhì)球狀層細胞和強制具有GC-A的細胞、或主動脈、肺動脈、腎小球、腎上腺皮質(zhì)等)中，進行孵育后，在cGMP分解酶磷酸二酯酶的阻斷劑存在下，把(1)測定細胞內(nèi)cGMP濃度發(fā)現(xiàn)可使該活性上升的物質(zhì)、或(2)測定具有GC-A的細胞或組織的膜部分的鳥苷酸環(huán)化酶活性發(fā)現(xiàn)能使該活性上升的物質(zhì)認為是具此活性的物質(zhì)。還有，上述測定方法可以用已知的方法，例如可以用Minamitake,Y.et al,Biochem,Biophys.Res.Commun.,172,971-978(1990),Furuya,M.,etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.,170,201-208(1990),Furuya,M.,et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.,177,927-931(1991)、日高壽范等，日本藥理雜志，101,309-325(1993)等記載的方法。作為具有上述特性的物質(zhì)，優(yōu)選鈉利尿肽(NP)，更優(yōu)選心房鈉利尿肽(ANP)和腦鈉利尿肽(BNP)等。
作為ANP，可以用28個氨基酸構(gòu)成的人α-hANP(Kangawa etal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.118,p131,1984)(序列號1)和α-rANP(Kangawa et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.121,p585,1984)(序列號2)，但作為本發(fā)明中有效成分的肽，可以是具ANP環(huán)狀結(jié)構(gòu)(形成基于半胱氨酸的二硫鍵)和連接著環(huán)狀結(jié)構(gòu)的具有C末端的肽。作為該肽例如有具α-hANP的7-28位氨基酸殘基的肽(序列號3)。作為ANP特別優(yōu)選人的α-hANP。
此外，作為BNP例如有32個氨基酸構(gòu)成的人BNP(Sudoh et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.159,p1420,1989)(序列號4)。
基于上述物質(zhì)(例如α-hANP)的氨基酸序列，研究者可以根據(jù)適當(dāng)?shù)囊阎椒?，對該序列的氨基酸殘基進行缺失、置換、添加、插入等修飾，這些肽中只要是能作用于ANP受體GC-A、促進cGMP產(chǎn)生的肽都可以使用。
此外，該肽可以用純粹天然分離精制的、化學(xué)合成法或轉(zhuǎn)基因法制造的任一種。作為這些肽，除了上述的以外，還有蛙ANP(序列號5)、豬ANP(序列號6)、大鼠ANP(序列號7)、雞ANP(序列號8)等。
還有，本發(fā)明藥物組合物的有效成分物質(zhì)可以以無機酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸，或有機酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、檸檬酸等的酸加成鹽的形式應(yīng)用。也可以是鈉、鉀、鋰、鈣等金屬鹽和有機堿形成的鹽的形式。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以是其有效成分物質(zhì)的游離形式，也可是醫(yī)藥上允許的鹽。
本發(fā)明的物質(zhì)或其藥理學(xué)上允許的鹽優(yōu)選和周知的藥理學(xué)上允許的載體、賦形劑、稀釋劑等進行混合，按藥物的一般給藥方法，即經(jīng)口給藥方法、或者靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予或皮下給予等非經(jīng)口給藥方法進行給藥。
有效成分為肽時，因為經(jīng)口給藥會在消化道內(nèi)分解，一般的給藥方法無效，可以用在消化道內(nèi)不易分解的制劑，例如用將作為活性成分的肽包裹在脂質(zhì)體中的微囊劑進行經(jīng)口給藥。此外，也可用從直腸、鼻內(nèi)、舌下等消化道以外的粘膜吸收的給藥方法。這種情況下可以以栓劑、鼻噴霧劑、舌下含片等形式給藥。
本發(fā)明藥物組合物的給藥量因疾病種類、患者年齡、體重、癥狀程度和給藥途徑等的不同而不同，但一般來說可在0.1μg/kg～100mg/kg的范圍內(nèi)給予，優(yōu)選在0.5μg/kg～5mg/kg的范圍內(nèi)給予。
ANP是心臟分泌的、對水電解質(zhì)代謝和血壓的調(diào)節(jié)有重要作用的肽激素。ANP的受體具有膜結(jié)合型鳥苷酸環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)，被稱為GC-A或NPR-A。即ANP與GC-A結(jié)合，使細胞內(nèi)的cGMP上升，從而發(fā)揮利尿、血管擴張等生理作用。
已知在人和動物模型中，重度心肌肥大和心功能不全伴有血中ANP濃度上升。此外，ANP在正常心臟中由心房合成，而在心肌肥大時心室產(chǎn)生的ANP明顯增加。這種病情發(fā)展中所伴隨的ANP產(chǎn)生增加可認為是機體為保護自身而對心功能不全產(chǎn)生的一種代償性機制。事實上，對心功能不全患者短時間(1～24小時)給予ANP可產(chǎn)生血管擴張作用和利尿作用，使心臟的前后負荷降低、血流動力學(xué)改善。
但是，目前還沒有闡明ANP對心肌肥大到底有什么作用。一方面，Cao等報道ANP在體外能阻斷培養(yǎng)心臟成纖維細胞的DNA合成(Caoet al,Hypertension,Vol.25,p227,1995)，但至于ANP對占心室最大容量(約70％)、在心肌肥大中起主要作用的心肌細胞的作用還沒有進行研究。
更進一步，有報道表明在容量負荷誘發(fā)的心肌肥大模型中，與機體內(nèi)ANP的代謝分解有關(guān)的中性內(nèi)肽酶(NEP,EC3.4.24.11)的阻斷劑顯示出利尿作用和輕度的心肌肥大抑制作用，但此時血中ANP并沒有明顯的上升，此外，因為除了ANP外NEP還與舒緩激肽等其它肽激素的代謝有關(guān)，所以不能明確利尿作用和心肌肥大抑制作用是否是基于ANP分解的抑制，即是否反映了ANP的作用(Willenbrock et al.,Hypertension,Vol.27,p1259,1996)。
如上所述，現(xiàn)在不能判斷給予ANP是否能抑制心肌肥大的發(fā)病或使心肌肥大消退。
因此，本發(fā)明者們用壓力負荷所致心肌肥大模型，以下述方法研究ANP持續(xù)給予對心肌肥大發(fā)病的預(yù)防效果和消退效果。
此外，心肌肥大與高血壓所致的壓力負荷增加、瓣膜疾病所致的容量負荷增加等種種因素有關(guān)。所以為了明確ANP對心肌肥大的抑制效果，除了上述高血壓性的壓力負荷型心肌肥大模型外，還以下述方法作成為容量負荷型心肌肥大模型的大鼠腹部動靜脈分流模型，研究ANP對心肌肥大的抑制效果。還有，本模型的慢性心功能不全的主要癥狀之一是肺充血，因而還就ANP對肺充血的減輕效果進行研究。A．用壓力負荷型心肌肥大模型的心肌肥大發(fā)生預(yù)防效果和消退效果的實驗方法1．制造壓力負荷所致大鼠心肌肥大模型的方法實驗動物用Sprague-Dawley系的9周齡雄性大鼠。將大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔給藥麻醉后，以腹臥位固定。開腹后露出腹部大動脈，剝離左右腎動脈間的部分。用21G注射針插入大動脈，在左右腎動脈間將其和大動脈一起用線結(jié)扎，然后拔出注射針，形成大動脈狹窄。在本模型中，這樣的腹部大動脈狹窄使收縮壓上升，心臟的后負荷增加，左心室產(chǎn)生肥大。假手術(shù)〔Sham-operation(Sham)〕組只進行腹部大動脈的剝離。2．ANP的給藥方法在腹腔內(nèi)給予戊巴比妥鈉(40mg/kg)使其麻醉，將大鼠頸部切開，往右頸靜脈中插入硅導(dǎo)管，在背部固定后，將導(dǎo)管連接上微量注入泵。人型ANP(α-hANP)用5％葡萄糖溶解后，以0.1μg/kg/分的速度靜脈內(nèi)持續(xù)給予。對照組和Sham組以2.5μl/分的速度靜脈內(nèi)持續(xù)給予5％葡萄糖。3．評價方法實驗結(jié)束時，將大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔給藥麻醉后，從左頸動脈插入聚乙烯導(dǎo)管，通過壓力換能器介導(dǎo)測定血壓和心率。在這之后，為了測定血漿中α-hANP和rat ANP的濃度以及ANP的細胞內(nèi)信號傳遞的第二信使cGMP的濃度，用含1/10容量1％(w/v)EDTA·2Na和5000KIU/ml抑肽酶的注射器從頸動脈采集血液2ml。血液直接在4℃下離心分離，所得血漿在-80℃下保存。血漿中α-hANP、rat ANP和cGMP分別用抗α-hANP兔血清、抗rat ANP兔血清和抗琥珀?；痗GMP單克隆抗體以放射免疫法進行測定。還有，采血后用過量的戊巴比妥鈉靜脈注射處死大鼠，測定體重后，摘出心臟，分離左心室和右心室，分別測定重量。將左心室重量對體重的比率作為心肌肥大的指標(biāo)。B．用容量負荷型心肌肥大模型的心肌肥大抑制效果和肺充血減輕效果的實驗方法1．制造容量負荷所致大鼠心肌肥大模型的方法實驗動物用Sprague-Dawley系的9周齡雄性大鼠。將大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔給藥麻醉后，以腹臥位固定。開腹后，露出腹部大動靜脈，在大動脈的腎動脈分支處和大腿動脈分支處分別用血管夾停止血流。在止血部位往大動脈中插入18G注射針，向大靜脈內(nèi)貫通，作成動靜脈分流。拔出注射針，動脈部的傷口用手術(shù)用粘合劑塞住，取下血管夾。確認在短路部位靜脈內(nèi)流入動脈血后，閉合腹部。在本模型中，象這樣腹部大動靜脈短路的形成會使靜脈壓上升，心臟的前負荷增大，按右心房、右心室、左心房、左心室的順序負荷逐漸增大，產(chǎn)生心肌肥大。更進一步，因靜脈系統(tǒng)的順應(yīng)性降低使血液潴留，肺部發(fā)生充血。假手術(shù)〔Sham-operation(Sham)〕組只進行腹部大動靜脈的剝離。
2．ANP的給藥方法以和壓力負荷型肥大模型的場合相同方法給予。
3．評價方法實驗結(jié)束時，將大鼠用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔給藥麻醉后，從左頸動脈和左頸靜脈插入聚乙烯導(dǎo)管，分別測定血壓、心率和右心房壓。在這之后，為了測定血漿中α-hANP和rat ANP的濃度，用含1/10容量1％(w/v)EDTA·2Na和5000KIU/ml抑肽酶的注射器從頸動脈采集血液2ml。血液直接在4℃下離心分離，所得血漿在-80℃下保存。血漿中α-hANP和rat ANP的濃度分別用抗α-hANP兔血清和抗rat ANP兔血清以放射免疫法進行測定。此外，采集動脈血入血沉管，離心分離后測定血沉值。還有，采血后用過量的戊巴比妥鈉靜脈注射處死大鼠，測定體重后，摘出心臟，分離右心房、左心房、右心室、左心室和肺，分別測定重量。將各部分心重量和肺重量對體重的比率作為心肌肥大和肺充血的指標(biāo)。
實施例下面就實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。
實施例1．ANP對心肌肥大發(fā)病預(yù)防效果的研究本發(fā)明者們首先就ANP對心肌肥大發(fā)病的預(yù)防效果進行研究。大鼠進行腹部大動脈狹窄手術(shù)或假手術(shù)后從頸靜脈插入硅導(dǎo)管，以α-hANP0.1μg/kg/分、或5％葡萄糖2.5μl/分的速度1周內(nèi)靜脈內(nèi)持續(xù)給藥。1周后在麻醉下測定大鼠的血流動力學(xué)狀態(tài)，采血后處死，測定心臟重量。結(jié)果如表1所示。
表1:ANP1周持續(xù)給藥對腹部大動脈狹窄大鼠體重、心臟重量、血壓和心率的影響

Sham組進行假手術(shù)，對照組和ANP組進行腹部大動脈狹窄手術(shù)，對Sham組和對照組給以5％葡萄糖2.5μl/分、對ANP組給以α-hANP0.1μg/kg/分，在手術(shù)后1周內(nèi)持續(xù)靜脈內(nèi)給藥。各值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*,**:p＜0.05或0.01，以ANOVA的方差分析法判定與Sham組之間的顯著差異。#:p＜0.05，以ANOVA的方差分析法判定與對照組之間的顯著差異。
如表1所示，在大動脈狹窄手術(shù)和藥物給予開始1周后，Sham組、對照組和ANP給藥組之間的體重和心率未見明顯的差別。對照組因大動脈狹窄所致的血管阻力增大，與Sham組對比可見明顯的收縮壓上升，ANP給藥未觀察到對血壓變化的影響。另一方面，對照組和Sham組相比可見左心室重量明顯增加、作為心肌肥大指標(biāo)的左心室重量/體重比(mg/g)從2.01±0.03到2.34±0.07的明顯增大，但ANP給藥組中左心室重量的增加較小，左心室重量/體重比(mg/g)為2.09±0.04，和對照組相比明顯減小。右心室重量/體重比各組間沒有差異。
ANP給藥組給藥第7天的血漿中α-hANP濃度為502±72pg/ml(約0.17nM)。此外，關(guān)于ANP的細胞內(nèi)信號傳遞的第二信使cGMP的血漿濃度，ANP給藥組為5.3±0.4pmole/ml，與Sham組和對照組(分別為2.0±0.3，和3.4±0.5pmole/ml)相比顯示出更高的值，可確認這是持續(xù)靜脈內(nèi)給予ANP的結(jié)果。
此外，關(guān)于血漿中內(nèi)源性大鼠ANP濃度，對應(yīng)Sham組的83±8pg/ml，對照組的139±19pg/ml是明顯上升，這說明是對大動脈狹窄所致心臟負荷的代償性內(nèi)源性ANP分泌增加。
另一方面，ANP給藥組的內(nèi)源性大鼠ANP濃度為113±10pg/ml，顯示出低值傾向，這是心肌肥大的形成被抑制的反映。
此外，在本實驗中α-hANP給藥開始后將大鼠放入代謝籠中飼養(yǎng)，收集24小時的尿量，測定尿量和尿中鈉的排泄量。如圖1所示，給藥期間的尿量和尿中Na排泄量和各組間沒有明顯差別，對于本模型ANP給藥沒有觀察到利尿作用。
如上所述，ANP1周持續(xù)靜脈內(nèi)給藥顯示出對心肌肥大形成的抑制作用。因為此時對體重和右心室重量沒有影響，所以認為ANP的作用是對受負荷的左心室特異性的，而不是對全身代謝障礙和細胞毒性產(chǎn)生作用。此外，因為對本模型在此次的用藥量(0.1μg/kg/min)下沒有觀察到ANP的利尿和降壓作用，所以認為ANP是直接作用于心臟，抑制心肌肥大的發(fā)病。
實施例2．ANP對心肌肥大消退效果的研究按實施例1所示的方法，產(chǎn)生心肌肥大后持續(xù)給予ANP，研究具有心肌肥大消退效果的可能性。
大鼠進行腹部大動脈狹窄手術(shù)或假手術(shù)后放置15周，使心肌肥大達穩(wěn)定狀態(tài)后，從頸靜脈插入硅導(dǎo)管，以α-hANP0.1μg/kg/分、或5％葡萄糖2.5μl/分的速度3周靜脈內(nèi)持續(xù)給藥。給藥開始3周后在麻醉下測定大鼠的血流動力學(xué)狀態(tài)，采血后處死，測定心臟重量。表2表示Sham組、對照組和ANP給藥組在給藥結(jié)束時心臟重量和血流動力學(xué)狀態(tài)的測定值。
表2:ANP3周持續(xù)給藥對腹部大動脈狹窄手術(shù)15周后的大鼠體重、心臟重量、血壓和心率的影響

Sham組進行假手術(shù)，對照組和ANP組進行腹部大動脈狹窄手術(shù)，對Sham組和對照組給以5％葡萄糖2.5μl/分、對ANP組給以α-hANP0.1μg/kg/分，在手術(shù)15周后3周內(nèi)持續(xù)靜脈內(nèi)給藥。各值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*,**:p＜0.05或0.01，以ANOVA的方差分析法判定與Sham組之間的顯著差異。##:p＜0.01，以ANOVA的方差分析法判定與對照組之間的顯著差異。
如表2所示，各組的體重沒有明顯的差別。對照組因大動脈狹窄所致的血管阻力增大，與Sham組相比可見明顯的收縮壓上升，ANP給藥組和對照組一樣血壓上升，未觀察到ANP對血壓的影響。對照組和ANP給藥組的心率和Sham組相比明顯增加。
一方面，關(guān)于左心室重量和作為心肌肥大指標(biāo)的左心室重量/體重比(mg/g)，對照組(2.36±0.05)和ANP給藥組(2.11±0.06)與Sham組(1.80±0.04)相比明顯增加，可見產(chǎn)生心肌肥大，但ANP給藥組和對照組相比顯示出明顯的低值，說明心肌肥大減輕。右心室重量/體重比各組間沒有差異，說明ANP的減輕心臟重量的作用是對肥大的左心室特異性的。
還有，手術(shù)15周后即給藥開始時的左心室重量，Sham組為937±23mg、對照組為1199±28mg(各n=3)，對照組和Sham組相比有顯著的心臟重量增加，即可以確定心肌肥大的形成。因為此時的心臟重量和給藥結(jié)束時(18周后)沒有差異[Sham組為938±15mg，對照組為1171±25mg(各n=9)]，說明在手術(shù)15周后壓力負荷所致的心肌肥大形成并達到穩(wěn)定狀態(tài)、在給藥期間(手術(shù)后15～18周)心肌肥大也沒有進一步發(fā)展。所以，從手術(shù)15周后因ANP給藥所致的左心室重量/體重比的降低說明了ANP具有使已形成的心肌肥大消退的作用。
此時，關(guān)于內(nèi)源性大鼠ANP濃度，對應(yīng)于Sham組的70±5pg/ml，對照組為126±9pg/ml，有明顯上升，ANP給藥組則有降低傾向(105±18Pg)。此外，ANP給藥組在給藥結(jié)束時的血漿中α-hANP濃度為426±53pg/ml(約0.14nM)。
如上所述，ANP顯示出防止心肌肥大產(chǎn)生、使已發(fā)病的心肌肥大消退的作用。
實施例3．ANP對心肌肥大和肺充血減輕效果的研究大鼠進行腹部大動靜脈分流形成術(shù)或假手術(shù)2周后，以α-hANP0.1μg/kg/分、或5％葡萄糖2.5μl/分的速度2周內(nèi)持續(xù)給藥，研究ANP對心肌肥大和肺充血的作用。表3表示Sham組、對照組和ANP給藥組在給藥結(jié)束時體重和血流動力學(xué)狀態(tài)的測定值。
表3:ANP2周持續(xù)給藥對腹部大動靜脈分流手術(shù)2周后的大鼠體重、血壓、心率和右心房壓的影響

Sham組進行假手術(shù)，對照組和ANP組進行腹部大動靜脈分流手術(shù)，對Sham組和對照組給以5％葡萄糖2.5μl/分、對ANP組給以α-hANP0.1μg/kg/分，在手術(shù)2周后2周內(nèi)持續(xù)靜脈內(nèi)給藥。各值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*,**:p＜0.05或0.01，以ANOVA的方差分析法判定與Sham組之間的顯著差異。
如表3所示，各組的體重沒有明顯的差別。各組間平均血壓和心率也沒有差異。對照組因動靜脈分流所致的容量負荷增大，與Sham組相比可見明顯的右心房壓上升。ANP給藥組和對照組一樣右心房壓上升，未觀察到ANP對血流動力學(xué)狀態(tài)的影響。
此外，作為心肌肥大指標(biāo)的右心房、左心房、右心室和左心室重量的體重比(mg/g)如圖2所示。在所有部位中，與Sham組相比，對照組的值明顯增加，形成顯著的心肌肥大。另一方面，ANP給藥組和對照組相比，右心房、右心室、左心房重量、左心室重量/體重比的任一個均明顯降低，心肌肥大的形成被抑制。
還有，作為肺充血指標(biāo)的肺重量/體重比(mg/g)和血沉值(％)如圖3所示。在肺重量/體重比方面，對照組和Sham組相比顯示出明顯的高值[Sham組為4.02±0.13，對照組為4.81±0.17]，但ANP組降低到與Sham組同程度的值(4.06±0.25)，說明ANP有減輕肺充血的作用。在血沉值方面，與Sham組相比，對照組顯示出較低值，說明血液量增加，即出現(xiàn)全身性的充血傾向，ANP組此值有改善。
在本模型中此次用藥量(0.1μg/kg/分)下，ANP對血壓、右心房壓沒有影響，說明ANP直接作用于心臟，抑制心肌肥大的發(fā)病。此時，關(guān)于內(nèi)源性大鼠ANP濃度，對應(yīng)于Sham組的43±11pg/ml，對照組為854±265pg/ml，有顯著上升，ANP給藥組則顯著降低(419±202pg/m1)。此結(jié)果與分流手術(shù)所致心肌肥大的形成、和ANP給藥對心肌肥大的抑制相對應(yīng)。此外，ANP給藥組在給藥結(jié)束時的血漿中α-hANP濃度為329±113pg/ml(約0.11nM)。
還有，手術(shù)2周后即給藥開始時，與Sham組相比對照組的右心房重量/體重比可見增加(Sham組為0.10±0.01(n=6)、對照組為0.13±0.004(n=8))，但左心房、右心室、左心室、肺重量/體重比等兩組間沒有差異，血漿中大鼠ANP濃度則顯示上升傾向(Sham組為34±3pg/ml(n=6),對照組為47±8pg/ml(n=8))。如上所述，可認為腹部大動靜脈分流手術(shù)2周后幾乎沒有發(fā)病，從2周后到4周后病情發(fā)展。所以，從手術(shù)2周后到4周后ANP給藥顯示出對心肌肥大和肺充血的抑制。
如上所述，ANP不僅能抑制壓力負荷所致高血壓性左心室肥大，也能抑制容量負荷所致的心肌肥大，此外，它不僅能有效減輕心肌肥大的發(fā)病、也能減輕肺充血。產(chǎn)業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明，以作用于作為鈉利尿肽受體的GC-A、促進cGMP產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分的組合物被證明可以有效預(yù)防與慢性心功能不全等心臟病的發(fā)病進展有關(guān)的心肌肥大。特別是在將ANP作為有效成分使用時，對于壓力負荷型心肌肥大，ANP不僅能抑制心肌肥大的形成過程，也顯示出使心肌肥大消退的效果，說明用于已發(fā)生心肌肥大的患者可有治療效果，在臨床上會很有用。
此外，對于容量負荷心肌肥大模型，ANP也顯示出心肌肥大抑制作用，甚至它還顯示出減輕肺充血的作用，所以它用于具有慢性心功能不全的主要癥狀、即作為引起呼吸困難原因的肺充血的患者時也會有效。更進一步，ANP在對血壓、心率、尿量沒有影響的用量就顯示出肺充血的抑制作用，所以可認為其在血流動力學(xué)方面的副作用較小，能夠安全使用。
綜上所述，ANP能夠改善高血壓和瓣膜疾病、或心肌梗塞等引起的心肌肥大，甚至能夠明顯改善作為心功能不全的結(jié)果而發(fā)生的肺充血。心肌肥大本身是缺血性心臟病、心律不齊和慢性心功能不全的獨立危險因子，特別是慢性心功能不全為死亡率高、預(yù)后不良的疾病。所以，在目前對改善心肌肥大、減輕心臟負荷有效的新藥有很高需求的現(xiàn)狀下，本發(fā)明的心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物非常有用。
序列表序列號1序列長度28序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20 25序列號2序列長度28序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Ile Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20 25序列號3序列長度22序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly1 5 10 15Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20序列號4序列長度32序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp1 5 10 15Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His20 25 30序列號5序列長度24序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Ser Asp Cys Phe Gly Ser Arg Ile Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser1 5 10 15Gly Met Gly Cys Gly Arg Arg Phe20序列號6序列長度32序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Pro Lys Thr Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Leu Asp1 5 10 15Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gly Leu Gly Cys Asn Val Leu Arg Arg Tyr20 25 30序列號7序列長度45序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Ser Gln Asp Ser Ala Phe Arg Ile Gln Glu Arg Leu Arg Asn Ser Lys1 5 10 15Met Ala His Ser Ser Ser Cys Phe Gly Gln Lys Ile Asp Arg Ile Gly20 25 30Ala Val Ser Arg Leu Gly Cys Asp Gly Leu Arg Leu Phe35 40 45序列號8序列長度29序列類型氨基酸拓撲學(xué)直鏈序列種類肽序列Met Met Arg Asp Ser Gly Cys Phe Gly Arg Arg Ile Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ser Leu Ser Gly Met Gly Cys Asn Gly Ser Arg Lys Asn20 2權(quán)利要求
1．心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物，以作用于作為鈉利尿肽受體的鳥苷酸環(huán)化酶A、促進環(huán)鳥苷酸產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分。
2．根據(jù)權(quán)利要求1記載的藥物組合物，其中心肌肥大性心臟病為慢性心功能不全。
3．根據(jù)權(quán)利要求1記載的藥物組合物，其中作用于作為鈉利尿肽受體的鳥苷酸環(huán)化酶A、促進環(huán)鳥苷酸產(chǎn)生的物質(zhì)為鈉利尿肽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3記載的藥物組合物，其中鈉利尿肽為心房鈉利尿肽。
5．根據(jù)權(quán)利要求3記載的藥物組合物，其中鈉利尿肽為腦鈉利尿肽。
全文摘要
提供基于作為心功能不全、缺血性心臟病和心律不齊等心臟病發(fā)病原因的心肌肥大的心臟病治療用藥物組合物。為達到此目的,提供以結(jié)合作為NP受體的GC－A、促進cGMP產(chǎn)生的物質(zhì)為有效成分的心肌肥大性心臟病治療用藥物組合物。作為有效成分的具體例子,鈉利尿肽例如有心房鈉利尿肽、腦鈉利尿肽。
文檔編號A61K38/22GK1219134SQ9880024
公開日1999年6月9日 申請日期1998年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月5日
發(fā)明者豬俁則夫, 山木明, 古谷真優(yōu)美, 日高壽范 申請人:三得利株式會社