專利名稱：自體活細胞軟組織填充凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用生物組織工程技術(shù)和細胞再生醫(yī)學原理制備的人體用軟組織填充劑，尤其是涉及一種自體活細胞軟組織填充凝膠，本發(fā)明還涉及該填充凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來隨著醫(yī)療美容市場的高度繁榮，人們對美的追求也逐漸從最初的階段轉(zhuǎn)向到對自然健康美的更高一級的階段，這也相應的對醫(yī)療美容機構(gòu)的美容技術(shù)提出了更高的要求。在目前的美容手術(shù)中，除了常規(guī)的矯形類美容手術(shù)外，微整形類的面部軟組織填充術(shù)占據(jù)了 30%以上的份額。以玻尿酸填充為例，年產(chǎn)值就高達70多億。玻尿酸之所以能取得這么好的市場業(yè)績，一是因為面部軟組織填充市場的巨大，二是因為玻尿酸的成分與人體的相似性極高，可以安全無殘留的降解。但由于玻尿酸屬于異體填充物，臨床上會經(jīng)常出現(xiàn)一些并發(fā)癥，且玻尿酸降解周期短，作用效果只能持續(xù)6-13個月，而高昂的價格及每年的重復注射對消費者又是極大的負擔，因而醫(yī)療美容工作者一直在尋求一種安全無副作用且效果可以長久保持的軟組織填充劑。生物組織工程技術(shù)和再生醫(yī)學的不斷進步，為我們開拓了新的研究方向，其中以自體成纖維細胞的體外培養(yǎng)擴增然后回輸移植到皮膚內(nèi)，依靠自體成纖維細胞成活后分泌合成膠原和細胞外基質(zhì)來達到填充作用的技術(shù)最為成熟。在美國獲得了專利技術(shù)認定的 Isolagen，于2011年6月22日獲FDA批準應用于臨床，說明該技術(shù)的安全性和有效性已受到認可。在我國由秦軍俠等發(fā)明的《人自體膠原蛋白活細胞注射劑及其制備方法》已獲得國家發(fā)明專利(專利號ZL 200610017330. 7)，該技術(shù)是將體外培養(yǎng)的自體成纖維細胞和在培養(yǎng)時所分泌的膠原蛋白等物質(zhì)，混合成成纖維細胞和膠原蛋白混合液，依靠膠原蛋白起到暫時的填充作用，以移植成活的成纖維細胞分泌合成膠原達到長久的填充效果。臨床使用中發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在三方面嚴重缺陷其一，由于原代培養(yǎng)采用的是胎牛血清，傳代培養(yǎng)使用的是無血清培養(yǎng)基，細胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，對人體內(nèi)部的環(huán)境適應性差，影響細胞的成活， 對美容效果有一定影響；其二，由于注射劑中的膠原蛋白含量太少，即時性的軟組織缺陷填充效果很不理想；其三，回輸液中缺少促進細胞成活、提高分裂增殖能力的物質(zhì)，回輸后會出現(xiàn)細胞營養(yǎng)缺乏，從而影響后期填充效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了解決先前的自體皮膚成纖維細胞移植存在的不完善的問題，提供一種更為可靠和完善的升級產(chǎn)品，即自體活細胞軟組織填充凝膠。該凝膠注射到皮膚真皮深層后，即可起到即時的填充作用，又可保證成纖維細胞的高成活率，以及成活后分泌合成膠原和細胞外基質(zhì)所需營養(yǎng)物質(zhì)的供給，從而達到長久填充功能，本發(fā)明還提供該填充凝膠的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案本發(fā)明所述的自體活細胞軟組織填充凝膠，包括培養(yǎng)擴增至至少8 X IO8個的成纖維細胞，血小板濃度為正常血濃度8倍以上的富血小板血漿和凝血酶-鈣劑。凝血酶-鈣劑是按1000U凝血酶溶于Iml 10%氯化鈣配制而成，屬于常規(guī)配制方法。本發(fā)明自體活細胞軟組織填充凝膠的制備方法為
第一步，將自體外周靜脈血離心后抽取血清分離膠以上的血漿，將其再次分離后抽取最下層血漿，此血漿中的血小板和生長因子的濃度為正常血濃度的8倍以上；
第二步，將第一步制備好的血漿按5%的比例加入到無血清培養(yǎng)基中，制成全營養(yǎng)培養(yǎng)基備用；
第三步，按常規(guī)方法將自體成纖維細胞在第二步制備成的全營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，直至成纖維細胞的數(shù)量達到至少8 X IO8個；
第四步，將第三步得到的成纖維細胞按照8X IO8個需要Iml富血小板血漿的比例加入到第一步制得的血漿中，再加入凝血酶-鈣劑激活，即可得到纖維蛋白原網(wǎng)狀填充凝膠。本發(fā)明的優(yōu)點在于較好的解決了成纖維細胞培養(yǎng)、回輸、成活繁殖過程中細胞健康狀態(tài)的保持、回輸后的成活、細胞繁殖營養(yǎng)供給、細胞繁殖空間的釋放等問題，保證了細胞的高成活率、高合成機能。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的本發(fā)明所述的自體活細胞軟組織填充凝膠，包括培養(yǎng)擴增至至少8 X IO8 個的成纖維細胞，血小板濃度為正常血濃度8倍以上的富血小板血漿和凝血酶-鈣劑。凝血酶-鈣劑是按1000U凝血酶溶于Iml 10%氯化鈣配制而成，屬于常規(guī)配制方法。本發(fā)明填充凝膠的具體制備步驟為
第一步，將自體外周靜脈血20ml加入到兩個IOml裝有血清分離膠和抗凝劑的采血管中，用臺式低速自平衡離心機以315 X g離心力離心lOmin，用IOml注射器抽取血清分離膠以上的全部血漿，將其加入到兩個普通IOml采血管中，再以260Xg離心力離心5min，用 5ml注射器分別抽取兩個采血管最下層的Iml血漿，得到2ml富血小板血漿；所得血漿中的血小板和生長因子的濃度可以達到正常血濃度的8倍以上，同時可以最大限度的保證血小板的完整性和活性；由于富血小板血漿會因設(shè)備和提取方法的不同，對提取的血小板濃度造成很大影響，而本發(fā)明采用兩步法提取的富血小板血漿血小板濃度可以達到正常血濃度的8倍以上，完全滿足了細胞生長的需要；
富血小板血漿中含有豐富細胞生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)的高濃營養(yǎng)液，對人體細胞組織的生理機能具有較強的提高作用。富血小板血漿中含有豐富的血小板、纖維蛋白原、多種氨基酸、蛋白多糖、微量元素等，經(jīng)凝血酶-鈣劑激活后，纖維蛋白原凝聚成具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白膠，可以誘導血小板持續(xù)長時間的釋放各類細胞生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β , TGF-β )、血小板衍生生長因子(platelet derivedgrowthfactor, PDGF)、類姨島素生長因子(insulinlike growth factor, IGF)、 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endohelial growth factor,VEGF)等，這些生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)對組織的修復和再生起著重要的作用。
第二步，將第一步制備好的富血小板血漿以5%的比例加入到無血清培養(yǎng)基(品牌優(yōu)選GIBC0)中，制成全營養(yǎng)培養(yǎng)基備用；
第三步，按常規(guī)方法將自體皮膚組織在培養(yǎng)皿中進行原代培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為第二步制備的全營養(yǎng)培養(yǎng)基；原代細胞的培養(yǎng)擴增后，仍使用第二步制備的全營養(yǎng)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的環(huán)境控制在37°C、CO2濃度為5%，3-4天換一次培養(yǎng)基，當細胞傳代至4-5代時，成纖維細胞的數(shù)量即可達到8 X IO8個；在細胞培養(yǎng)的原代和傳代時使用第二步制備的全營養(yǎng)培養(yǎng)基可以使細胞適應機體的環(huán)境，同時富血小板血漿中各種營養(yǎng)物質(zhì)之間的比例與人體正常比例一致，可以發(fā)揮出最佳的協(xié)調(diào)作用，促進細胞的分裂增殖，并保持良好的功能狀態(tài)；
第四步，將第三步得到的成纖維細胞消化、離心、沉淀、收集后裝入到按第一步的方法制備的Iml富血小板血漿中，再加入0. Iml的凝血酶-鈣劑(凝血酶-鈣劑按1000U凝血酶溶于lmll0%氯化鈣配制而成)進行激活，激活后血漿中的纖維蛋白原會在5-lOmin內(nèi)凝成滿足要求的自體活細胞軟組織填充凝膠，成纖維細胞被固定在纖維蛋白原網(wǎng)狀凝膠內(nèi)，網(wǎng)狀凝膠形成了天然的細胞支架。注射進皮膚后，依靠凝膠的支撐作用，起到即時的填充作用，并隨著凝膠的降解逐漸為成纖維細胞的繁殖釋放出足夠的空間，釋放出的空間被新繁殖的細胞和細胞所分泌合成的膠原及細胞外基質(zhì)所填補，從而達到了既促進細胞成活和繁殖，又能即時并長久的保持軟組織填充的效果。本發(fā)明制備的自體活細胞軟組織填充凝膠，所用成纖維細胞和富血小板血漿均取自自體，與先前同類技術(shù)相比具有三大優(yōu)點1、富血小板血漿中豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)可以極大提高移植成纖維細胞的成活率，并可以持續(xù)為細胞的繁殖提供足夠的營養(yǎng)支持；2、網(wǎng)狀的纖維蛋白凝膠為細胞繁殖提供了天然可降解的生長支架，可以提高移植細胞的成活率，同時網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的可降解凝膠可以為細胞的分裂繁殖釋放出足夠的生長空間，避免了直接的細胞移植注射由于皮膚內(nèi)沒有足夠的空間容積影響細胞的成活和繁殖；3、富血小板血漿中的活性成分與人體內(nèi)成分比例一致，只是濃度有所提高，細胞已適應了富血小板血漿的環(huán)境，移植到皮膚內(nèi)后，細胞不需要重新再適應，可以快速成活并發(fā)揮正常生理機能。從臨床200多名志愿者的使用效果觀察，無一例發(fā)生不良反應，效果滿意率90%以上。
權(quán)利要求
1.一種自體活細胞軟組織填充凝膠，其特征在于包括培養(yǎng)擴增至至少8 X IO8個的成纖維細胞，血小板濃度為正常血濃度8倍以上的富血小板血漿和凝血酶-鈣劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體活細胞軟組織填充凝膠的制備方法為第一步，將自體外周靜脈血離心后抽取血清分離膠以上的血漿，將其再次分離后抽取最下層血漿，此血漿中的血小板和生長因子的濃度為正常血濃度的8倍以上；第二步，將第一步制備好的血漿按5%的比例加入到無血清培養(yǎng)基中，制成全營養(yǎng)培養(yǎng)基備用；第三步，按常規(guī)方法將自體成纖維細胞在第二步制備成的全營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，直至成纖維細胞的數(shù)量達到至少8 X IO8個；第四步，將第三步得到的成纖維細胞按照8X IO8個需要Iml富血小板血漿的比例加入到第一步制得的血漿中，再加入凝血酶-鈣劑激活，即可得到纖維蛋白原網(wǎng)狀填充凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自體活細胞軟組織填充凝膠，包括培養(yǎng)擴增至8×108個的自體成纖維細胞、血小板濃度為正常血濃度8倍以上的富血小板血漿和凝血酶-鈣劑。制備方法為首先將提取的成纖維細胞經(jīng)體外擴增至8×108個，加入到制備好的富血小板血漿中，經(jīng)凝血酶-鈣劑激活，血漿中的纖維蛋白原凝聚成具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白膠，即得到活細胞軟組織填充凝膠；成纖維細胞的原代和傳代所用培養(yǎng)基均由無血清培養(yǎng)基和5%的富血小板血漿配制而成。本發(fā)明的優(yōu)點在于較好的解決了成纖維細胞體外擴增培養(yǎng)、收集回輸、體內(nèi)成活繁殖過程中細胞健康狀態(tài)的保持、回輸后的成活、細胞繁殖的營養(yǎng)供給、細胞繁殖的空間釋放等問題，保證了細胞的高成活率。
文檔編號A61L27/54GK102488924SQ201110437800
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者侯強, 吳剛, 潘萬立, 秦軍俠, 郭棟梁 申請人:侯強, 吳剛, 潘萬立, 秦軍俠, 郭棟梁