NO: 1 的氨基酸 226-455-或 226-260 或氨基酸 225-455-或 225-260,其中 發(fā)生R或K的氨基酸替代或單殘基缺失。一些實(shí)施方案中，在參照SEQ ID N0:1確定的位 置423發(fā)生替代。一些實(shí)施方案中，在參照SEQ ID NO: 1確定的位置423發(fā)生缺失。一些實(shí) 施方案中，蛋白酶抗性多肽包含相應(yīng)于SEQ ID NO: 1的氨基酸區(qū)域207-455或207-460的 連續(xù)氨基酸，其中發(fā)生R或K的氨基酸替代或單殘基缺失。在一些實(shí)施方案中，在位置423 發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案中，替代為極性氨基酸，例如民乂〇,5，!'，，或￥。在一些 實(shí)施方案中，替代為H，N，Q，S，T，或Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施方案 中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，包括在相對于SEQ ID NO: 1的位置423的缺失。
[0064] 本發(fā)明還提供蛋白酶抗性多肽，其中該多肽包含與SEQ ID N0:1的氨基酸 240-454、SEQ ID N0:1 的氨基酸 241-455、或 SEQ ID N0:1 的氨基酸 242-455 具有至少 95% 同一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基酸序列，且在相應(yīng)于SEQ ID NO: 1 的位置423的氨基酸處具有替代或缺失，其中替代氨基酸不是R，且其中該多肽具有軟骨發(fā) 生活性。在其它實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸240-454、SEQ ID NO: 1的氨 基酸241-455、或SEQ ID NO: 1的氨基酸242-455,且每個(gè)多肽在相應(yīng)于SEQ ID NO: 1的位 置423的氨基酸處具有替代或缺失，其中替代氨基酸是Q或S。
[0065] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含與SEQ ID NO: 1的氨 基酸 242-455 或 242-460 ;SEQ ID NO: 1 的氨基酸 241-455 或 241-460 ;SEQ ID NO: 1 的氨 基酸 233-455 或 233-460 ;SEQ ID NO: 1 的氨基酸 228-455 或 228-460, SEQ ID NO: 1 的氨基 酸 226-455-或 226-260,或 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 225-455-或 225-260 具有至少 95% 同 一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基酸序列，其中發(fā)生R或K的氨基酸替 代，或R或K缺失。在一些實(shí)施方案中，在位置423發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案中， 替代為極性氨基酸，例如氏乂〇,5，!'，，或￥。在一些實(shí)施方案中，替代為11，1〇,5，1'，或￥。 在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在相對 于SEQ ID NO: 1的位置423存在殘基缺失。
[0066] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽長250或240個(gè)氨基酸或更短， 并包含 SEQ ID N0:16，SEQ ID N0:19，SEQ ID N0:20，SEQ ID N0:21，SEQ ID N0:22，SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31,SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:63, SEQ ID N0:64, SEQ ID N0:65,SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,或 SEQ ID NO:70 的氨 基酸序列。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶抗性ANGPTL3多肽長230或225個(gè)氨基酸或更 短，并包含 SEQ ID N0:24，SEQ ID N0:25，SEQ ID N0:26，SEQ ID N0:27，SEQ ID N0:28，SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID N0:41，SEQ ID N0:62，SEQ ID N0:63，SEQ ID N0:64，SEQ ID N0:68，SEQ ID N0:69,或 SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
[0067] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白包含與犬、?；蝰RANGPTL3 蛋白C端序列具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基 酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3蛋白至少包含天然犬（SEQ ID N0:4)，馬（SEQ ID N0:5)，或牛（SEQ ID N0:6)ANGPTL3蛋白序列的一個(gè)片段（例如，至少 100, 150, 200, 215個(gè)連續(xù)氨基酸），或與該天然犬、牛或馬ANGPTL3蛋白序列基本相同的序 列，其中多肽在參考SEQ ID NO: 1所確定的位置423包含非K或R的極性氨基酸，或多肽在 位置423包含缺失，且多肽具有軟骨發(fā)生活性。在一些實(shí)施方案中，分離的多肽包含與SEQ ID N0:42或SEQ ID N0:43具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%,或99%序列 同一性的氨基酸序列，其中多肽在參考SEQ ID NO: 1所確定的位置423包含非K或R的極 性氨基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有軟骨發(fā)生活性。在一些實(shí)施方案中，多 肽與SEQ ID N0:42或SEQ ID N0:43具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%,或 99%序列同一性，其中多肽在參考SEQ ID N0:1所確定的位置423包含非K或R的極性氨 基酸，或多肽在位置423包含缺失，且多肽具有軟骨發(fā)生活性。在一些實(shí)施方案中，多肽包 含5￡〇10勵(lì):42或3￡〇10勵(lì):43。在再一實(shí)施方案中，多肽是3￡〇10勵(lì):42或3￡〇10 N0:43〇
[0068] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含與SEQIDN0:4的氨基酸 232- 454、SEQ ID N0:4 的氨基酸 240-454、SEQ ID N0:4 的氨基酸 227-454、或 SEQ ID N0:4 的氨基酸224-454具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基 酸序列，其中發(fā)生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:4的位置422 (相應(yīng)于SEQ ID NO: 1的位置423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案 中，替代為極性氨基酸，例如民乂〇,5，!'，，或￥。在一些實(shí)施方案中，替代為11，1〇,5，1'，或 Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在 SEQ ID N0:4的位置422發(fā)生氨基酸缺失。
[0069] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含與SEQIDN0:5的氨基酸 233- 455、SEQ ID N0:5 的氨基酸 241-455、SEQ ID N0:5 的氨基酸 228-455、或 SEQ ID N0:5 的氨基酸225-455具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基 酸序列，其中發(fā)生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:5的位置423 (相應(yīng)于SEQ ID NO: 1的位置423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案 中，替代為極性氨基酸，例如民乂〇,5，!'，，或￥。在一些實(shí)施方案中，替代為11，1〇,5，1'，或 Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在 SEQ ID N0:5的位置423發(fā)生氨基酸缺失。
[0070] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶抗性ANGPTL3包含與SEQ ID N0:6的氨基酸 233-455、SEQ ID N0:6 的氨基酸 241-455、SEQ ID N0:6 的氨基酸 228-455、或 SEQ ID N0:6 的氨基酸225-455具有至少95%同一性、或至少96% ,97% ,98%，或99%同一性的氨基 酸序列，其中發(fā)生R或K的氨基酸替代、或存在R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:6的位置422 (相應(yīng)于SEQ ID NO: 1的位置423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案 中，替代為極性氨基酸，例如民乂〇,5，!'，，或￥。在一些實(shí)施方案中，替代為11，1〇,5，1'，或 Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在 SEQ ID N0:6的位置422發(fā)生氨基酸缺失。
[0071] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相應(yīng)于如下氨基酸區(qū)域的 連續(xù)氨基酸：SEQ ID N0:4 的氨基酸 240-454、SEQ ID N0:4 的氨基酸 232-454、SEQ ID N0:4 的氨基酸227-455、或SEQ ID N0:4的氨基酸224-454,其中發(fā)生R或K的氨基酸替代或存在 R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:4的位置422 (其是參照SEQ ID NO: 1確定 的位置423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案中，替代為極性氨基酸，例如H，N，Q，S，T，A， 或Y。在一些實(shí)施方案中，替代為H，N，Q，S，T，或Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在 一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:4的位置422發(fā)生氨基酸缺失。
[0072] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相應(yīng)于如下氨基酸區(qū)域的 連續(xù)氨基酸：3￡0 1〇勵(lì):5的氨基酸241-455、5￡0 1〇勵(lì):5的氨基酸233-455、5￡0 1〇勵(lì):5 的氨基酸228-455、或SEQ ID N0:5的氨基酸225-455,其中發(fā)生R或K的氨基酸替代、或存 在R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在位置423(相應(yīng)于參照SEQ ID N0:1確定的位置 423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案中，替代為極性氨基酸，例如H，N，Q，S，T，A，或Y。在 一些實(shí)施方案中，替代為H，N，Q，S，T，或Y。在一些實(shí)施方案中，替代為S或Q。在一些實(shí)施 方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:5的位置423發(fā)生氨基酸缺失。
[0073] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白酶抗性ANGPTL3多肽包含相應(yīng)于如下氨基酸區(qū)域 的連續(xù)氨基酸：SEQ ID N0:6的氨基酸241-455、SEQ ID N0:6的氨基酸233-455、SEQ ID N0:6的氨基酸228-455、或SEQ ID N0:4的氨基酸225-455,其中發(fā)生R或K的氨基酸替 代、或存在R或K的缺失。在一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:6的位置422 (其是參照SEQ ID N0:1確定的位置423)發(fā)生替代或缺失。在一些實(shí)施方案中，替代為極性氨基酸，例如 H，N，Q，S，T，A，或Y。在一些實(shí)施方案中，替代為H，N，Q，S，T，或Y。在一些實(shí)施方案中，替代 為S或Q。在一些實(shí)施方案中，替代為Q。一些實(shí)施方案中，在SEQ ID N0:6的位置422存 在缺失。
[0074] 如上所述本發(fā)明ANGPTL3蛋白可以包括位于上述區(qū)域側(cè)翼的天然ANGPTL3蛋白序 列?；蛘?，一些實(shí)施方案中，本發(fā)明ANGPTL3蛋白可以包括非天然ANGPTL3蛋白側(cè)翼序列。 例如，ANGPTL3蛋白的軟骨發(fā)生活性部分可以與一個(gè)或多個(gè)融合配偶體和/或異源氨基酸 融合以形成融合蛋白。融合配偶體序列可以包括但不限于，氨基酸標(biāo)簽、非L(例如D-)氨 基酸或其它氨基酸模擬物（以延長體內(nèi)半衰期和/或蛋白酶抗性）、靶向序列或其它序列。
[0075] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽PEG化。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽與異源肽 融合。一些實(shí)施方案中，多肽與以下任一融合：人血清白蛋白（HAS)、免疫球蛋白重鏈恒定 區(qū)（Fc)、聚組氣酸、谷脫甘妝S轉(zhuǎn)移酶（GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、甘露糖結(jié)合蛋白 (MBP)、或上述任何異源多肽的片段。一些實(shí)施方案中，異源多肽融合在本發(fā)明多肽的氨基 末端。在其它或備選實(shí)施方案中，異源多肽融合在本發(fā)明多肽的羧基末端。
[0076] 本發(fā)明ANGPTL3蛋白具有軟骨發(fā)生活性和蛋白酶抗性。如本文定義的，軟骨生成 或軟骨發(fā)生活性指從MSC生成軟骨細(xì)胞。軟骨發(fā)生活性的標(biāo)志包括但不限于軟骨基質(zhì)產(chǎn) 生。軟骨基質(zhì)產(chǎn)生可以通過各種標(biāo)志物，例如Sox9, II型膠原或糖胺聚糖（GAG)的產(chǎn)生進(jìn) 行度量。一些實(shí)施方案中，測量GAG產(chǎn)生作為軟骨基質(zhì)產(chǎn)生的標(biāo)志。一些實(shí)施方案中，GAG 產(chǎn)生的3倍增加聯(lián)合軟骨特異性蛋白表達(dá)指示陽性軟骨基質(zhì)產(chǎn)生。
[0077] 可以使用測量由絲氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶引起的切割的任何已知試驗(yàn)，評價(jià)多 肽的蛋白酶抗性。在一些實(shí)施方案中，用于評價(jià)蛋白酶解易感性的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶 胰蛋白酶。如果多肽與其野生型對應(yīng)物相比對胰蛋白酶具有降低的敏感性，則該多肽被認(rèn) 為具有蛋白酶抗性。一個(gè)試驗(yàn)例子是測量，與相應(yīng)的天然人肽相比，在多肽暴露于胰蛋白酶 一段時(shí)間后產(chǎn)生的切割產(chǎn)物的量?？梢允褂萌魏我阎囼?yàn)，例如SDS PAGE或LCMS測量切 害J。示例性試驗(yàn)在實(shí)施例部分提供。
[0078] 在一個(gè)示例性試驗(yàn)中，通過將10ng待評價(jià)的蛋白質(zhì)與胰蛋白酶以8000:1的質(zhì)量 比（蛋白質(zhì)：胰蛋白酶）在室溫孵育1小時(shí)，實(shí)施由胰蛋白酶解導(dǎo)致的限制性蛋白酶解。 然后，通過加入乙酸將反應(yīng)調(diào)節(jié)至PH3. 0,淬滅胰蛋白酶解反應(yīng)。然后，通過SDS-PAGE，例如 在4-12% Tris-Bis凝膠上，分離淬滅后的樣品，通過胰蛋白酶切割產(chǎn)生的片段的外觀，從 切割的蛋白質(zhì)中鑒定出抵抗切割的蛋白質(zhì)。與其野生型對應(yīng)物相比，在蛋白酶抗性多肽中 不存在或具有減少的切割產(chǎn)物。
[0079] -些實(shí)施方案中，本發(fā)明ANGPTL3多肽包含至少一個(gè)非天然編碼的氨基酸。一 些實(shí)施方案中，多肽包含1，2, 3, 4,或更多個(gè)非天然氨基酸。制備非天然氨基酸和將非 天然氨基酸引入蛋白的方法是已知的。參見例如US專利號(hào)7, 083, 970 ;和7, 524, 647。 本領(lǐng)域已知適用于產(chǎn)生包含一個(gè)或多個(gè)期望的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng) 的一般制備原則，本領(lǐng)域也已知用于產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的一般方法。例如，參見國際 公布號(hào) W02002/086075,發(fā)明名稱〃METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS ;"TO 2002/085923,發(fā)明名 稱〃IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS ;〃TO2004/094593,發(fā)明名 稱"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE ;〃TO 2005/019415, 2004 年 7 月 7 日遞 交；TO 2005/007870, 2004 年 7 月 7 日遞交；TO 2005/007624, 2004 年 7 月 7 日遞交；TO 2006/110182, 2005 年 10 月 27 日遞交，發(fā)明名稱〃ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS〃 ；和 TO 2007/103490, 2007 年 3 月 7 日遞交，發(fā)明名稱〃SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS. 〃。對于并入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng) 和其制備和使用方法的討論，也參見Wang和Schultz, (2005)〃Expanding the Genetic Code. "Angewandte Chemie Int Ed 44:34-66 ;Xie 和 Schultz, (2005)〃An Expanding Genetic Code. "Methods 36:227-238 ;Xie 和 Schultz, (2005)"Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire. 〃Curr Opinion in Chemical Biology 9:548-554; 和 Wang, et al.，（2006)"Expanding the Genetic Code. 〃Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249 ;Deiters, et al,(2005)〃In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli. ''Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 ；Chin, et al. , (2002)''Addition of p-Azid〇-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. "J Am Chem Soc 124:9026-9027 ;和 2005 年9月20日遞交的國際公布號(hào)W02006/034332。其它細(xì)節(jié)可以見于美國專利號(hào) 7, 045, 337 ；No. 7, 083, 970 ；No. 7, 238, 510 ；No. 7, 129, 333 ；No. 7, 262, 040 ；No. 7, 183, 082 ； No. 7, 199, 222 ;和 No. 7, 217, 809。
[0080]"非天然編碼的氨基酸"指，非常規(guī)氨基酸或吡咯賴氨酸、吡咯啉-羧基-賴氨酸、 或硒代半胱氨酸的氨基酸。可以與術(shù)語"非天然編碼氨基酸"作為同義詞使用的其它術(shù)語 是"非天然氨基酸"、"非天然的氨基酸"、"非天然發(fā)生的氨基酸"、和各種帶連字符和不帶連 字符的形式。術(shù)語"非天然編碼氨基酸"也包括，但不限于，通過修飾（例如翻譯后修飾）天 然編碼的氨基酸（包括但不限于20種常規(guī)氨基酸或吡咯賴氨酸、吡咯啉-羧基-賴氨酸、 和硒代半胱氨酸）而形成的、但本身不能通過翻譯復(fù)合物天然地?fù)饺肷L的肽鏈中的氨基 酸。此類非天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于N-乙酰葡糖氨基-L-絲氨酸、N-乙?；咸?氨基-L-蘇氨酸、和0-磷酸酪氨酸。
[0081] 非天然編碼氨基酸典型地可以是具有與20種天然氨基酸中使用的取代基側(cè)鏈不 同的任何取代基側(cè)鏈的任何結(jié)構(gòu)。由于本發(fā)明的非天然編碼氨基酸與天然氨基酸的不同典 型地僅在于側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，故該非天然編碼氨基酸可以與其它氨基酸，包括但不限于，天然的或 非天然編碼的氨基酸，以和天然多肽中酰胺鍵形成的方式相同的方式，形成酰胺鍵。然而， 非天然編碼氨基酸具有區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，R任選地可以包含烷基、芳基、 酰基、酮基、疊氮基、羥基、肼（hydrazine)、氰基、鹵代、酰肼（hydrazide)、鏈烯基、炔基、 醚、硫羥基（thiol)、硒代、磺?；?、硼酸（borate)、硼化（boronate)、二氧磷基（phospho)、 膦?；╬hosphono)、膦（phosphine)、雜環(huán)、稀酮（enone)、亞胺（imine)、醛、酯、硫羰酸 (thioacid)、羥胺、氨基基團(tuán)等、或其任何組合?？梢赃m用于本發(fā)明的其它有意義的非天然 氨基酸包括，但不限于，包含可光激活的交聯(lián)劑的氨基酸、自旋標(biāo)記的氨基酸、熒光氨基酸、 金屬結(jié)合性氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能基團(tuán)的氨基酸、共價(jià)地或 非共價(jià)地與其它分子相互作用的氨基酸、光籠蔽的（photocaged)和/或可光異構(gòu)化的氨基 酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化的氨基酸例如糖取代的絲氨酸、其它糖修 飾的氨基酸、含酮氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化學(xué)斷 裂的和/或可光斷裂的氨基酸、與天然氨基酸相比具有延長的側(cè)鏈（包括但不限于，聚醚或 長鏈烴，包括但不限于，大于約5個(gè)或大于約10個(gè)碳）的氨基酸、含碳連接的糖的氨基酸、 氧還活性氨基酸、含有氨基硫羰酸的氨基酸、和含有一個(gè)或多個(gè)毒性部分的氨基酸。
[0082] 可以適用于本發(fā)明并可以用于與水溶性聚合物反應(yīng)的示例性非天然編碼氨基酸 包括但不限于，具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲（semicarbazide)、疊氮、和炔反應(yīng)性 基團(tuán)的氨基酸。一些實(shí)施方案中，非天然編碼氨基酸包含糖部分。此類氨基酸的例子包括 N-乙?；?L-葡糖氨基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-半乳糖氨基-L-絲氨酸、N-乙?；?L-葡 糖氨基-L-蘇氨酸、N-乙酰基-L-葡糖氨基-L-天冬酰胺、和0-甘