用于治療關(guān)節(jié)損壞的肽和組合物的制作方法
【專利說明】用于治療關(guān)節(jié)損壞的肽和組合物
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年3月8日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/775, 400和2014年2 月10日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/938, 123的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所有這些文獻(xiàn)均完整地 特此并入作為參考。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 骨關(guān)節(jié)炎（0A)是最常見的肌肉骨骼紊亂。大約4千萬美國人目前患有0A ;預(yù)計該 數(shù)目在接下來的20年里會由于群體老齡化和壽命的增加而增加到6千萬，從而導(dǎo)致0A成 為第四大致殘原因。0A的特征在于，緩慢的關(guān)節(jié)退行性破壞，包括關(guān)節(jié)軟骨（含有為關(guān)節(jié)提 供潤滑和緩沖的細(xì)胞和基質(zhì)）和位于關(guān)節(jié)軟骨下方的軟骨下骨。0A可以被認(rèn)為是各種病因 學(xué)因素的后果。例如，它可以由關(guān)節(jié)軟骨或骨的異常生物機(jī)械壓力或遺傳性或獲得性異常 而引起。目前0A治療包括使用口服NSAID或選擇性環(huán)加氧酶2 (C0X-2)抑制劑緩解疼痛、 關(guān)節(jié)內(nèi)（IA)注射活性劑例如皮質(zhì)類固醇和透明質(zhì)酸、以及手術(shù)方法。
[0005] 關(guān)節(jié)損壞例如急性關(guān)節(jié)損傷，例如半月板或韌帶撕裂、或關(guān)節(jié)內(nèi)骨折，也可以導(dǎo)致 關(guān)節(jié)炎，例如創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎。由于關(guān)節(jié)軟骨具有有限的修復(fù)能力，甚至小的不可檢測的損傷 也常?？赡茈S時間而惡化并導(dǎo)致0A。目前關(guān)節(jié)損傷的治療可以包括手術(shù)和聚焦于使受傷關(guān) 節(jié)再生的其它侵入性方法，以及用活性劑治療以減少疼痛和炎癥。
[0006] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)存在于成年關(guān)節(jié)軟骨中，分離后可以在體外程序化以分 化為軟骨和其它間充質(zhì)細(xì)胞譜系，并可以用于軟骨再生。部分地，該過程受生長因子 (TGF 0 s，BMPs)、血清條件和細(xì)胞-細(xì)胞接觸的調(diào)節(jié)。W02011/008773描述肽組合物及其用 于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的用途和用于誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的用途。此 外，W02011/008773描述小分子化合物、組合物及其用于改善關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的用途和用 于誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的用途。
[0007] 盡管手術(shù)技術(shù)和再生技術(shù)已經(jīng)在軟骨恢復(fù)、延緩?fù)嘶透纳脐P(guān)節(jié)損壞的修復(fù)上取 得了一些進(jìn)展，但是仍持續(xù)需要用于有效軟骨再生、治療關(guān)節(jié)損壞、和改善或防止0A的改 良組合物和方法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明涉及鑒定新的血管生成素樣3(ANGPTL3)多肽和蛋白質(zhì)變體，所述變體具 有改善的藥物性質(zhì)，例如比野生型ANGPTL3更穩(wěn)定、更不易于發(fā)生蛋白水解和酶促降解。本 發(fā)明還提供在哺乳動物中用于治療關(guān)節(jié)損壞或關(guān)節(jié)損傷的組合物和方法、和改善或預(yù)防關(guān) 節(jié)炎、關(guān)節(jié)損壞或關(guān)節(jié)損傷的方法。
[0010] 因此，本發(fā)明提供蛋白酶抗性多肽，其包含與選自表1序列之任一或多個的氨基 酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性、或至少96%，97%，98%，99%或100%氨基酸序 列同一性的氨基酸序列，如本文進(jìn)一步描述。表1的修飾多肽在位置423包括非K或R的 極性氨基酸，其中所述位置參照全長ANGPTIL3多肽序列SEQ ID N0:1確定。一些實施方案 中，參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸是Q或S。一些實施方案中，參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸是Q。一些實施方案中，參照SEQ ID NO: 1確定的位置423 的氨基酸是S。一些實施方案中，參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸缺失。此外， 提供的多肽具有軟骨發(fā)生活性。
[0011] 一些實施方案中，多肽包含與 SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO:70中任一個具有至少95 %同一性或至少 96 % ,97 % ,98 % ,99 %或100 %同一性的序列。一些實施方案中，多肽包含與SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID N0:60,SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中任一個具有至少 95%同一性或至少96% ,97% ,98% ,99%或100%同一性的序列。一些實施方案中，多 肽包含表1中的任一序列。一些實施方案中，多肽包含SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和 SEQ ID NO:70 中的任一個。一些實施方案中， 多肽包含 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和SEQ ID N0:64中的任一個。一些實施方案中，多肽是表1中 的任一序列。一些實施方案中，多肽是 SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID N0:32，SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO: 70中的任一個。一些實施方案中，多肽是SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中的任一個。
[0012] 本發(fā)明多肽可以并入一種或多種化學(xué)修飾（例如，PEG化）。一些實施方案中，本 發(fā)明多肽可以以融合蛋白的形式包含異源肽，其中所述異源肽可以任選地融合在該多肽的 氨基端或羧基末端。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸；包含編碼該多肽的多核苷 酸的載體；和包含該載體的宿主細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明多肽和可藥用載體的藥物組合物。該組合物可以用于本 文所述的在患者中治療、改善或防止關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)損壞的方法中，其中該方法包括向患者 的關(guān)節(jié)施用治療有效量的本發(fā)明藥物組合物。可以得益于該方法的病癥實例包括，但不限 于關(guān)節(jié)炎（例如，骨關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎）、和關(guān)節(jié)損壞（例如，急性關(guān)節(jié)損傷）。
[0014] 本發(fā)明還提供治療個體的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明多肽。所提供的方 法包括治療罹患或有危險罹患關(guān)節(jié)損壞和/或關(guān)節(jié)炎的個體，包括向個體施用治療有效量 的一種或多種本發(fā)明多肽或其藥物組合物。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì) 胞的方法，包括使間充質(zhì)干細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明多肽以誘導(dǎo)該間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟 骨細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的這些和其它方面，包括其它特征、優(yōu)點和實施方式，將在以下詳細(xì)描述和 后附本發(fā)明權(quán)利要求書中進(jìn)一步詳細(xì)地描述和闡釋。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1描述經(jīng)工程化的hANGPTL3蛋白的示意圖，該工程化改善蛋白穩(wěn)定性和增強(qiáng)蛋 白水解抗性。在野生型蛋白和肽序列的蛋白生產(chǎn)過程中，在Lys423和Ser424之間觀察到 100%的斷裂。為了減少蛋白水解，產(chǎn)生了各種突變肽，其中Lys 423被突變?yōu)镚in或Ser; 或Ser424被突變?yōu)門hr ;或Lys 423被缺失。
[0018] 圖2A和B描述在ANGPTL3和工程化構(gòu)建體存在或不存在時軟骨特異性蛋白質(zhì)的 表達(dá)。對固定的細(xì)胞進(jìn)行（2A)2A型前膠原定量（PIIANP)或（2B)II型膠原定量，以確定在 實施例中所述處理后分化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞％。圖2C描述在ANGPTL3或工程化構(gòu)建體存 在或不存在時血管發(fā)生測定試驗的定量結(jié)果，其中與陽性對照蛋白bFGF比較?？偣荛L度和 分支點數(shù)量是血管發(fā)生的定量量度。盡管其他人已經(jīng)報道了 ANGPTL3的血管發(fā)生活性，且 本研究證實活性與FGF的活性一樣好；但是結(jié)果說明在C端ANGPTL3構(gòu)建體中沒有顯著活 性保留。
[0019] 圖3顯示在ANGPTL3或工程化構(gòu)建體存在時軟骨特異性蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。3A.在 處理后10天使用qRT-PCR評價細(xì)胞，以測量在所述處理后軟骨特異性蛋白的RNA表達(dá)。 Lubricin，聚集蛋白聚糖（aggrecan)和Sox9代表軟骨相關(guān)蛋白；IGF和IFITM1代表分化 潛力，骨鈣蛋白（osteocalcin)和X型膠原代表骨/纖維化相關(guān)蛋白。3B.在所述處理后3 天評價細(xì)胞。用工程化構(gòu)建體或野生型ANGPTL1C端區(qū)多肽處理后，觀察到增加的聚集蛋白 聚糖表達(dá)。
[0020] 圖4顯示ANGPTL3和工程化構(gòu)建體的軟骨保護(hù)活性。4A?糖胺聚糖（GAG)釋放（基 質(zhì)損壞的一個指標(biāo)）隨著遞增量的ANGPTL3和突變構(gòu)建體而被抑制。使用在所示構(gòu)建體存 在或不存在下處理的牛軟骨，實施離體GAG釋放（基質(zhì)損壞的一個指標(biāo)）抑制試驗。4B和 4C :使用遞增量的ANGPTL3和所示工程化構(gòu)建體抑制了 N0釋放。在所示構(gòu)建體存在或不 存在時處理軟骨細(xì)胞，之后實施Greiss反應(yīng)試驗，以確定N0釋放抑制作用作為軟骨保護(hù)指 標(biāo)。
[0021] 圖5顯示在肥大病況下構(gòu)建體存在時X型膠原表達(dá)（纖維軟骨形成活性的指標(biāo)） 的抑制。在肥大病況下在所示構(gòu)建體存在或不存在的情況下處理原代軟骨細(xì)胞，之后通過 免疫熒光評估，以確定X型膠原表達(dá)，作為纖維及肥大軟骨形成/軟骨細(xì)胞分化的量度。5A 描述野生型C端ANGPTL3或工程化構(gòu)建體的結(jié)果。5B描述C端ANGPTL3 (WT)或工程化構(gòu)建 體242KQ或242Kdel或C端ANGPTL1的結(jié)果。
[0022] 圖6示意性顯示給藥范例（6A)，之后圖示（6B)用小鼠ANGPTL3(17-460)處理后關(guān) 節(jié)嚴(yán)重度的改善（通過股骨外側(cè)課（lateral femoral condyle)的軟骨侵蝕評分測定）。
[0023] 圖7顯示，在手術(shù)誘導(dǎo)軟骨損壞和隨后用ANGPTL3構(gòu)建體每周一次持續(xù)三周（始 于第7日）處理后，小鼠中的失能測量結(jié)果（疼痛指標(biāo)）。7A顯示手術(shù)后第35天的失能測 量結(jié)果；7B顯示手術(shù)后第56天進(jìn)行測量的結(jié)果。
[0024] 圖8顯示，在3次ANGPTL3構(gòu)建體（所示）的每周一次處理（第7、14和21天） 后，對于小鼠中膠原酶誘導(dǎo)的軟骨損壞，關(guān)節(jié)嚴(yán)重度的總得分和嚴(yán)重度的改善。
[0025] 圖9顯示，在用工程化ANGPTL3構(gòu)建體處理后，在關(guān)節(jié)損壞的大鼠半月板撕裂模型 中的結(jié)果。圖9A圖示處理后5周關(guān)節(jié)中的蛋白聚糖含量；圖9B圖示處理后5周股骨關(guān)節(jié) 嚴(yán)重度得分。結(jié)果說明，在3次ANGPTL3構(gòu)建體（所示）的每周一次處理（第7、14和21 天）后，對大鼠中手術(shù)切斷半月板誘導(dǎo)的軟骨損壞的改善。
[0026] 圖10顯示，在用工程化ANGPTL3構(gòu)建體處理后，在關(guān)節(jié)損壞的大鼠半月板撕裂模 型中的結(jié)果。圖10A圖示通過嚴(yán)重度、番紅菌素（safranin)O強(qiáng)度、軟骨面積和軟骨厚度測 定的體內(nèi)修復(fù)百分?jǐn)?shù)。圖10B顯示，在手術(shù)誘導(dǎo)軟骨損壞和隨后處理后，大鼠中的失能測量 結(jié)果（疼痛指標(biāo)）。
[0027] 圖11圖示總體嚴(yán)重度的總得分，以說明：自第4天開始每兩周一次給藥（各 1. 5ug/劑或15ug/劑）后或僅在第7天給藥（單個30 y g劑量）后，犬中由手術(shù)破壞內(nèi)側(cè) 半月板（medial meniscus)誘導(dǎo)的軟骨損壞的改善。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 本發(fā)明至少部分地基于鑒定到可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞并對蛋 白酶（例如胰蛋白酶樣蛋白酶）切割具有抵抗性的血管生成素樣3(ANGPTL3)多肽。 TO2011/008773描述ANGPTL3肽組合物及肽組合物用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的 用途和用于誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的用途。我們發(fā)現(xiàn)野生型ANGPTL3蛋白易于 發(fā)生蛋白酶剪切和不穩(wěn)定，由此鑒定了減輕該效應(yīng)的序列變體。本發(fā)明由此提供用于修復(fù) 軟骨的改良肽組合物。尤其是，提供了根據(jù)本發(fā)明修飾的ANGPTL3肽，該修飾肽與野生型 ANGPTL3多肽相比具有增加的蛋白酶抗性。本發(fā)明還提供用于施用ANGPTL3多肽以預(yù)防或 改善關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)損傷的組合物和方法，其中向關(guān)節(jié)、軟骨組織、或軟骨鄰近組織中、或全 身性地施用本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的組合 物和方法。
[0030] 定義
[0031] 術(shù)語"蛋白酶抗性"在本文中指包含修飾的多肽，所述修飾可以使該多肽與相應(yīng)的 未修飾野生型多肽相比更不容易被胰蛋白酶樣蛋白酶切割。在特定實施方案中，蛋白酶抗 性多肽是，相對于天然野生型肽序列，在R或K殘基上具有氨基酸替代的ANGPTL3多肽。
[0032]"ANGPTL3"指血管生成素蛋白家族的成員。ANGPTL3(GenBank登錄號NP_055310. 1) 的氨基酸序列示于SEQ ID N0:1中；相應(yīng)的多核苷酸序列示于SEQ ID N0:2(NCBI參考序 列號 NM014495. 2,其中 ANGPTL3 編碼序列包含 SEQ ID N0:2 的 nt 52-1434)。"ANGPTL3 多 肽"指天然表達(dá)的多肽。為了本公開的目的，氨基酸編號典型地參考全長野生型人ANGPTL3 多肽序列（SEQ ID N0:1)確定。因此，在本發(fā)明多肽僅含有全長ANGPTL3的C端部分而不 含N端部分的實施方案中，盡管該肽的長度小于460個氨基酸，但位置仍基于SEQ ID NO: 1 編號。例如，提及本發(fā)明ANGPTIL3多肽的位置423,即使該本發(fā)明ANGPTIL3多肽本身可能 僅200個氨基酸長度，也指SEQ ID NO: 1的位置423?？梢酝ㄟ^最佳比對序列，例如，使用默 認(rèn)CLUSTAL比對參數(shù)或默認(rèn)BLAST2比對參數(shù)，并比較序列，以確定與參考序列例如SEQ ID NO: 1中的位置"相應(yīng)"的目的序列中的氨基酸。例如，"參考SEQ ID NO: 1確定"的目的序 列的位置423、或"相應(yīng)于" SEQ ID NO: 1位置423的氨基酸，指當(dāng)目的序列與SEQ ID NO: 1 最佳比對后，與SEQ ID NO: 1的位置423對齊的氨基酸。
[0033] 術(shù)語"肽模擬物"（peptidomimetic)和"模擬物"指合成的化學(xué)化合物，該化合物 與天然或非天然的多肽（例如ANGPTL3)具有實質(zhì)上相同的功能特征，但不同的（盡管典 型地是相似的）結(jié)構(gòu)特征。肽類似物在本領(lǐng)域中通常用作和模板肽具有類似性質(zhì)的非肽 活性化合物（例如藥物）。此類非肽化合物被稱為"肽模擬物"（"peptide mimetics〃或 〃peptidomimetics〃）（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986) ；Veber and Freidinger TINS p.392 (1985) ;and Evans et al.J. Med. Chem. 30:1229 (1987))。與治療有用肽結(jié)構(gòu) 相似的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等同或增強(qiáng)的治療或預(yù)防效果。一般，肽模擬物與范例多 肽（即具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性的多肽）結(jié)構(gòu)相似（例如在目的多肽中發(fā)現(xiàn)的），但一 個或多個肽鍵任選地替代為選自例如-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH = CH-(順式和反 式），-C0CH2-，-CH(OH) CH2-，和-CH2S0-的連接。模擬物可以完全由合成的非天然氨基酸 類似物構(gòu)成，或可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。模擬物 也可以并入任何數(shù)量的天然氨基酸保守替代，只要該保守替代也不實質(zhì)性改變模擬物的結(jié) 構(gòu)和/或活性即可。例如，如果模擬物組合物能夠具有ANGPTL3多肽的軟骨發(fā)生活性，則該 模擬物組合物落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0034] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語適用于其中的一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸 聚合物、以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本發(fā)明多肽、肽和蛋白質(zhì)包括具有 軟骨發(fā)生活性的蛋白酶抗性ANGPTL3肽模擬物。
[0035] 術(shù)語"氨基酸"指天然的和合成的氨基酸、以及以類似于天然氨基酸的方式發(fā)揮 功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸、以及之后 修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指，與天然 氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)一一即與氫、羧基基團(tuán)、氨基基團(tuán)和R基團(tuán)結(jié)合的碳一一 的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍（methionine methyl sulfonium)。此類類似物具有修飾的R基團(tuán)（例如正亮氨酸）或修飾的肽骨架，但保持與天 然氨基酸一樣的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。天然編碼的氨基酸為20種常見氨基酸（丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸）以及吡咯賴 氨酸（pyrrolysine)、P比略啉-羧基-賴氨酸（pyrroline-carboxy-lysine)、和硒代半胱氨 酉愛（selenocysteine) 〇
[0036] "保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列，保守修飾的 變體指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在該核酸不編碼氨基酸序列的情況 下，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，任何給定的蛋白質(zhì)均可以由多個功能相同 的核酸編碼。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個由密 碼子規(guī)定丙氨酸的位置上，該密碼子均可以被改變?yōu)槿我凰龅南鄳?yīng)密碼子而不改變編碼 的多肽。該核酸變異是"沉默變異"，其是保守修飾變異中的一種。本文中每一個由多核苷 酸編碼的多肽序列都涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，核酸中 的每一個密碼子（除了 AUG-一通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG-一通常是色氨酸的 唯一密碼子）均可以被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，本文描述的每一個序列都隱含 了編碼多肽的核酸的每一種沉默變異。
[0037] 本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，對于核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列上的各替代、缺失或添加， 當(dāng)其導(dǎo)致相對于原始編碼的氨基酸序列而言改變、添加或缺失了單個氨基酸或小百分?jǐn)?shù) 的氨基酸，如果該改變造成氨基酸被化學(xué)相似的氨基酸替代、和/或造成可以產(chǎn)生與原始 蛋白質(zhì)具有相似功能活性的結(jié)構(gòu)相似蛋白質(zhì)的多肽序列時，則該改變導(dǎo)致"保守修飾的變 體"。本領(lǐng)域熟知提供功能相似氨基酸的保守替代表。此類保守修飾變體與本發(fā)明的多態(tài) 性變體、物種間同源物和等位基因一起涵蓋在本發(fā)明中，且不排斥本發(fā)明的多態(tài)性變體、物 種間同源物和等位基因。
[0038] 術(shù)語"保守氨基酸替代"指，來自一個保守氨基酸替代組的氨基酸（概念地或以其 它方式）替代為來自相同組的不同氨基酸。替代的一個例子基于分析同源生物的相應(yīng)蛋白 質(zhì)之間氨基酸變化的標(biāo)化頻率（參見例如Schulz, G.E.和R.H.Schirme