一種針對(duì)透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌的細(xì)菌響應(yīng)性鈦基抗菌植入材料制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種功能性鈦基植入材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈦及鈦合金移植體因其出色的力學(xué)性能及良好的生物相容性等被廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)等外科手術(shù)中。然而，鈦移植體植入體內(nèi)后，材料介導(dǎo)的細(xì)菌感染將會(huì)導(dǎo)致植入手術(shù)的失敗。研宄顯示，金黃色葡萄球菌是臨床骨科手術(shù)后最常見的感染性細(xì)菌，該細(xì)菌感染發(fā)生后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量增殖并分泌多種有害物質(zhì)(例如外毒素，腸毒素，透明質(zhì)酸酶等)，影響正常機(jī)體細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，進(jìn)而阻礙植入材料與機(jī)體之間的機(jī)械整合。為了解決這一難題，對(duì)鈦材進(jìn)行表面改性以提高其抗菌性能成為醫(yī)用材料研宄領(lǐng)域的重要內(nèi)容。
[0003]目前此類研宄多集中在植入材料中抗菌性離子(銀、銅、鋅)的嵌入、抗生素類藥物的儲(chǔ)池裝載、抗細(xì)菌粘附性涂層的構(gòu)建等方面。但研宄中仍存在以下問題:第一，目前多項(xiàng)研宄中制備的抗菌材料多忽略其生物相容性問題，因其載藥種類或載藥量等問題會(huì)大幅度降低鈦基材本身的良好生物相容性，在植入受體后不能很好的與人體相容，致使受體發(fā)生排異反應(yīng)，嚴(yán)重危害受體健康。第二，抗細(xì)菌粘附性的涂層多會(huì)在一定程度上影響的正常細(xì)胞在材料表面的附著，進(jìn)而降低了材料的細(xì)胞相容性。第三，目前研宄的抗菌性植入材料很少能智能有效的調(diào)控藥物釋放速率，它們?cè)诩?xì)菌感染前后藥物釋放速率往往不會(huì)發(fā)生大的變化，從而導(dǎo)致藥物過早或過晚釋放，達(dá)不到良好的抗菌目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本專利旨在制備一種針對(duì)透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌的細(xì)菌響應(yīng)性鈦基抗菌植入材料。該制備方法不需要特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)。利用該方法構(gòu)建的功能化鈦材界面具有良好的生物相容性以及抗菌活性，在骨移植技術(shù)中有重要的研宄價(jià)值和臨床意義。
[0005]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種針對(duì)透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌的細(xì)菌響應(yīng)性鈦基抗菌植入材料制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a.利用陽極氧化法構(gòu)建管徑70nm的二氧化鈦納米管(TNT)，并對(duì)其進(jìn)行藥物(天蠶肽B)裝載。
[0007]b.利用酰胺反應(yīng)在透明質(zhì)酸鈉(SH)多糖鏈上接枝天蠶肽B (CecB)。
[0008]c.利用層層自組裝方法(旋涂法)，在載藥納米管表面構(gòu)建殼聚糖/透明質(zhì)酸-天蠶肽(Chi/SH-CecB)多層膜。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟a是利用陽極氧化法構(gòu)建管徑70nm的二氧化鈦納米管(TNT)，并對(duì)其進(jìn)行藥物(天蠶肽B)裝載。具體步驟是:首先，將鈦箔(1mmXlOmm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸餾水各自清洗10?20分鐘。60°C干燥。利用鉑箔作為電化學(xué)電池的陰極，鈦箔作為電化學(xué)電池的陽極。所述電化學(xué)電池的電解溶液為溶解有氟化銨的水/甘油混合物，其中:水和甘油的體積比為0:1、1:3、1:1、3:1或1:0，氟化銨濃度為0.27M。在10?30V恒定電壓的條件下，電解30?90分鐘。將電解后的鈦箔在450°C條件下煅燒2小時(shí)，得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的銳欽礦型一氧化欽納米管。最后，在每片含納米管樣品中裝載20?200 μ g的抗菌短肽-天蠶肽B。
[0010]更優(yōu)選的，所述步驟a是利用陽極氧化法構(gòu)建管徑70nm的二氧化鈦納米管(TNT)，并對(duì)其進(jìn)行藥物(天蠶肽B)裝載。具體步驟是:首先，將鈦箔(1mmXlOmm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸餾水各自清洗15分鐘。60°C干燥。利用鉑箔作為電化學(xué)電池的陰極，鈦箔作為電化學(xué)電池的陽極。所述電化學(xué)電池的電解溶液為溶解有氟化銨的水/甘油混合物，其中:水和甘油的體積比為1:1，氟化銨濃度為0.27M。在20V恒定電壓的條件下，電解60分鐘。將電解后的鈦箔在450°C條件下煅燒2小時(shí)，得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的銳鈦礦型二氧化鈦納米管。最后，在每片含納米管樣品中裝載200 μ g的抗菌短肽-天蠶肽B。
[0011]優(yōu)選的，步驟b是利用酰胺反應(yīng)在透明質(zhì)酸鈉(SH)多糖鏈上接枝天蠶肽B (CecB)。具體步驟是:首先，將10?50mg的透明質(zhì)酸鈉和10?35mg的1- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HC1)溶解于25mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，調(diào)節(jié)其溶液為pH為4.5?6.5，在磁力攪拌條件下反應(yīng)10?60分鐘。再在以上混合物溶液中加入I?1mg的CecB蛋白質(zhì)，磁力攪拌12?24小時(shí)。所獲得的產(chǎn)物(SH-CecB)用分子量為5000D的透析袋透析3天，凍干燥并收集產(chǎn)物。
[0012]更優(yōu)選的，步驟b是利用酰胺反應(yīng)在透明質(zhì)酸鈉(SH)多糖鏈上接枝天蠶肽B(CecB)。具體步驟是:首先，將25mg的透明質(zhì)酸鈉和18mg的1_(3_二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)溶解于25mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，調(diào)節(jié)其溶液為pH為5.5，在磁力攪拌條件下反應(yīng)30分鐘。再在以上混合物溶液中加入5mg的CecB蛋白質(zhì)，磁力攪拌24小時(shí)。所獲得的產(chǎn)物(SH-CecB)用分子量為5000D的透析袋透析3天，凍干燥并收集產(chǎn)物。
[0013]優(yōu)選的，步驟c是利用層層自組裝方法(旋涂法)，在載藥納米管表面構(gòu)建殼聚糖/透明質(zhì)酸-天蠶肽(Chi/SH-CecB)多層膜。
[0014]具體步驟為:
[0015]用蒸館?水制備SH-CecB溶液；SH_CecB濃度0.5?2mg/mL。
[0016]用0.1% (v/v)的醋酸制備殼聚糖溶液(Chi)，殼聚糖濃度為I?10mg/mL，回調(diào)pH 為 5.5。
[0017]將旋涂?jī)x(spin-coater)設(shè)置參數(shù)為:
[0018]1、100 ?400rpm/min，5 ?10s，或 I1、2000-4000rpm/min，20 ?60s。
[0019]Chi溶液和SH-CecB溶液交替旋涂5次，最終得到的薄膜系統(tǒng)為(Chi/SH-CecB) 5。
[0020]更優(yōu)選的，用蒸飽水制備SH-CecB溶液(0.8mg/mL)，用0.1 % (v/v)的醋酸制備殼聚糖溶液(4mg/mL，回調(diào) pH 為 5.5)。將 spin-coater (旋涂?jī)x)設(shè)置為 150rpm/min (8s)，2500rpm/min (40s)。Chi和SH-CecB交替旋涂5次，最終得到的薄膜系統(tǒng)為(Chi/SH-CecB) 5。[0021 ] 本發(fā)明還包括基于上述制備方法的材料制備，即針對(duì)透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌的細(xì)菌響應(yīng)性鈦基抗菌植入材料制備。
[0022]值得說明的是，為了克服此類研宄的缺點(diǎn)(【背景技術(shù)】所提到的)，在本專利中，我們利用具有緩釋作用的TNT、低毒性的抗菌短肽CecB及透明質(zhì)酸酶敏感性的Chi/SH-CecB涂層共同制備了具有細(xì)菌響應(yīng)性的鈦基抗菌植入材料。Chi/SH-CecB涂層覆蓋的載藥納米管在沒有細(xì)菌感染時(shí)會(huì)緩慢的釋放其內(nèi)裝載的CecB(l周左右)。但當(dāng)透明質(zhì)酸酶分泌型的細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌)感染發(fā)生時(shí)，涂層的降解速率會(huì)大大提高，從而短時(shí)間內(nèi)釋放大量抗菌肽，以達(dá)到快速殺滅細(xì)菌的目的。研宄還發(fā)現(xiàn)，修飾后的SH-CecB在保持了其抗菌性能的同時(shí)大大提高了其表面蛋白及細(xì)胞的粘附能力，進(jìn)而使得所制備材料(TNT-CecB-LBLc)具有較好的細(xì)胞相容性。因此，本專利中所制備的細(xì)菌響應(yīng)性鈦基體不僅具有良好的生物相容性，還具有較強(qiáng)的響應(yīng)性抗菌性能，其在臨床醫(yī)療過程中具有較好的應(yīng)用前景。
[0023]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:該制備方法不需要特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)。利用該方法構(gòu)建的功能化鈦材界面具有良好的生物相容性以及抗菌活性，在骨移植技術(shù)中有重要的研宄價(jià)值和臨床意義。
【附圖說明】
[0024]圖1:純鈦(Ti)、二氧化鈦納米管(TNT)、(0^/5!1)5鋪膜樣品(TNT-CecB-LBL)和(Chi/SH-CecB) 5鋪膜后樣品(TNT-CecB-LBLc)的表面掃描電鏡圖。
[0025]圖2A:透明質(zhì)酸鈉(a)、天蠶肽B(b)和透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B (c)的紅外圖譜。B:透明質(zhì)酸鈉(a)和透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B (b)的核磁共振圖譜。
[0026]圖3A:有/無透明質(zhì)酸酶(HAase)條件下TNT-CecB-LBL和TNT-CecB-LBLc樣品中天蠶肽B釋放量的曲線圖。B:有/無金黃色葡萄球菌(S.Aureus)條件下不同培養(yǎng)時(shí)間(4,12和24小時(shí))后TNT-CecB-LBLc樣品表面多層膜的熒光圖片(FM)。
[0027]圖4A:不同修飾樣品表面金黃色葡萄球菌培養(yǎng)4小時(shí)后的掃描電鏡(SEM)和共聚焦顯微鏡(CLSM)圖片。B:不同修飾樣品表面金黃色葡萄球菌培養(yǎng)4、24和72小時(shí)后的細(xì)菌活性，η = 6，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01。C:不同修飾樣品培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)4、24和72小時(shí)后的細(xì)菌活性，