包含至少兩個不同靶向?qū)嶓w的定制選擇性和多特異性治療分子的方法及其用途
【專利摘要】本文報(bào)道了用于確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合的方法，其包括以下步驟(i)確定大群雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/或體內(nèi)半衰期，通過組合第一大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員與第二大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員，以及在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員的接頭來制備所述雙特異性抗體，由此第一大群特異性結(jié)合第一個細(xì)胞表面分子并且第二大群特異性結(jié)合第二個細(xì)胞表面分子，和(ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/或體內(nèi)半衰期的雙特異性抗體并由此確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合。
【專利說明】包含至少兩個不同祀向?qū)嶓w的定制選擇性和多特異性治療 分子的方法及其用途
[0001] 本文報(bào)道了用于選擇和產(chǎn)生由多膚-多核巧酸-復(fù)合體制備的多特異性治療分子 的方法，其中根據(jù)治療祀標(biāo)的表型選擇所述治療分子的特異性。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在過去的幾年里，已經(jīng)開發(fā)并臨床測試了多種腫瘤特異性治療蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞 表面受體的抗體、抗體片段和配體。已經(jīng)將該些治療蛋白質(zhì)綴合到若干種類的治療毒素上， 如小分子藥物、酶、放射性同位素、蛋白毒素和用于向患者特定遞送的其他毒素。
[0004] 向疾病位點(diǎn)有效遞送是任何治療分子高效和低毒的前提。例如，抗體可W參與到 該背景中。如果抗體本身不是治療性的，那么藥物綴合到抗體上使得可W實(shí)現(xiàn)藥物在人體 內(nèi)想要位點(diǎn)上完美定位。該增加了該祀?yún)^(qū)域內(nèi)有效藥物的濃度，由此優(yōu)化治療劑的治療效 果。此外，利用祀向遞送，臨床醫(yī)師能夠降低治療劑的劑量-如果藥物有效負(fù)荷具有相關(guān)毒 性或如果待用于治療慢性狀況，該是特別相關(guān)的事情（參見例如McCarron，P.A.，等，Mol. Interventions 5 (2005)368-380)〇
[0005] 例如在WO 2004/081051中報(bào)道了雙特異性抗體的產(chǎn)生。已經(jīng)設(shè)計(jì)并開發(fā) 了廣譜的雙特異性抗體形式（參見例如Fischer, N.和Leger，0.，化thobiology 74(2007)3-14)。馨合的重組抗體（CRAbs)最初由 Neri，D.，等（Neri，D.，等，J. Mol. Biol. 246 (1995) 367-373)報(bào)道。Wri曲和 Deonarain，M.P. (Mole州lar Immunology 44(2007)2860 - 2869)報(bào)道了用于產(chǎn)生馨合重組抗體的瞻菌體展示文庫。
[000引用于碑1向藥物遞送的分子載體由Backer, M. V.，等，Biocon化gate 化em. 13(2002)462-467報(bào)道。WO 2010/118169報(bào)道了具有受控的血清藥物動力學(xué)的人蛋 白質(zhì)支架。在W0 2009/105671中報(bào)道了與具有C末端元件的膚和蛋白質(zhì)相關(guān)的方法和組 合物。在W0 2007/038658中，報(bào)道了抗體-藥物綴合物和使用方法。在W0 2004/062602 中報(bào)道了用于祀向生物遞送分子載體的組合物和方法。在W0 2002/072141中報(bào)道了祀向 配體。
[0007] 在W0 2009/037659中報(bào)道了小實(shí)體的磁力檢測。在W0 2006/137932中報(bào)道了同 質(zhì)分析物檢測。在US 2008/0044834中報(bào)道了用于檢測大分子和其他分析物的H組分生物 傳感器。在W0 95/05399中報(bào)道了雙特異性試劑的設(shè)計(jì)和合成。
[0008] 在US 2002/051986中報(bào)道了通過核酸報(bào)告物檢測分析物的方法。在W0 95/05399 中報(bào)道了通過使用雙鏈DNA作為化學(xué)和空間限定的交聯(lián)劑設(shè)計(jì)并合成雙特異性試劑。
[0009] Gos址e, H.，等報(bào)道了 kDNA作為分子標(biāo)簽的應(yīng)用（Nucl. Acids Symp. Ser. 49 (200巧 261-262。兩親性螺旋（amphi地atic helices)在大腸桿菌巧.coli) 中產(chǎn)生具有高親合力的功能性柔性連接的二聚Fv片段的用途由化ck，P.，等 (Biochem. 31 (1992) 1579-1584)報(bào)道。Kostelny，S. A.，等報(bào)道了通過使用亮氨酸拉鏈形成 雙特異性抗體（J. Immunol. 148(1992) 1547-1553)。組合兩種特異性的具有親合力的二聚雙 特異性微抗體由 Muller, K.M.，等（陽BS Lett. 432(1998)45-49)報(bào)道。Goldenberg，D.M.， 等報(bào)道了通過用于改善的癌成像的dock-and-lock方法和通過預(yù)先祀向的療法產(chǎn)生多功 能性抗體（J. Nuc. Med. 49 (2008) 158-163)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本文報(bào)道了提供定制的高度特異的多特異性治療分子用于在需要治療的患者中 治療疾病，如癌癥的方法，由此所述治療分子適合患者的疾病特征和/或患者的基因型/表 型。
[0012] 通過考慮患者攜帶疾病/受影響細(xì)胞的基因型/表型制備定制分子實(shí)現(xiàn)該種適 合。
[0013] 在第一步中，確定旨在利用治療分子祀向的細(xì)胞的基因型/表型（疾病特異性細(xì) 胞表面抗原的存在和數(shù)目/數(shù)量）。該例如通過細(xì)胞成像技術(shù)，如使用英光標(biāo)記的單特異性 (治療性或診斷性）抗體對來自例如血液和/或活組織檢查材料的患者細(xì)胞免疫組織化學(xué) 染色（IHC，免疫組織化學(xué)）來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可W在利用標(biāo)記的治療或診斷抗體染色后使用基 于FACS的方法分析細(xì)胞的基因型/表型。體內(nèi)成像技術(shù)，包括光學(xué)成像、分子成像、英光成 像、生物發(fā)光成像、MRI、陽T、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查也可W用于確定患者的疾病相關(guān) 細(xì)胞的基因型/表型。根據(jù)患者的疾病相關(guān)細(xì)胞確定的基因型/表型，祀向/結(jié)合實(shí)體的 定制組合可W是/被選擇并且組合在治療分子中。該治療分子可W是例如雙特異性抗體。
[0014] 此類定制的治療分子i)將是高度特異的，ii)將具有好的功效，并且iii)與常規(guī) 選擇的治療劑相比將誘導(dǎo)較少的副作用。該可W通過提供具有改善的祀向和/或改善的定 制遞送性質(zhì)，例如對其預(yù)期的作用位點(diǎn)上的治療有效負(fù)荷的治療分子來實(shí)現(xiàn)。
[0015] 可W通過祀向治療分子與常規(guī)選擇的治療分子相比較高的/增加的選擇性和/或 特異性來實(shí)現(xiàn)向其作用位點(diǎn)，如例如癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)改善遞送治療分子。治療分子包含至少兩 個實(shí)體，其特異性結(jié)合不同的抗原（例如兩個不同的表面標(biāo)志物）或同一抗原上的不同表 位（例如同一表面標(biāo)志物上的兩個不同的表位）。
[0016] 可W通過兩個祀向?qū)嶓w同時(shí)結(jié)合其各自的祀標(biāo)/表位實(shí)現(xiàn)定制治療分子的增加 的選擇性和/或特異性，即通過親合力作用來實(shí)現(xiàn)。尤其適合的是對其各自的祀標(biāo)/表位 具有低親和力到中等親和力的兩個結(jié)合實(shí)體的組合。此外，脫祀結(jié)合被極大地減少或甚至 可W被完全消除。
[0017] 結(jié)合特異性可W由形成多特異性治療分子的初始組分分別提供。因此，可W簡單 地通過確定細(xì)胞，例如癌細(xì)胞上存在的表面標(biāo)志物，將特異性結(jié)合該些表面標(biāo)志物的各結(jié) 合實(shí)體，如抗體片段綴合到核酸上并通過接頭核巧酸將該些連接起來，來定制多特異性治 療分子，如雙特異性抗體。
[0018] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了祀向遞送效應(yīng)部分，包含多膚和多核巧酸組分的復(fù)合體尤其有用。 復(fù)合體的效應(yīng)部分、多膚組分和多核巧酸接頭彼此非共價(jià)結(jié)合。該允許模塊產(chǎn)生復(fù)合體的 各組分。由于復(fù)合體的模塊結(jié)構(gòu)，可W在不需要改變復(fù)合體的其他組分的情況下改變各個 組分。該允許容易且有效地裝配大量復(fù)合體變體，例如用于提供該樣的文庫，基于所述文庫 可W選擇定制的高度特異的多特異性治療分子。
[0019] 如本文報(bào)道的一方面是用于從結(jié)合實(shí)體的集合/文庫中選擇至少兩個結(jié)合實(shí)體 用作治療劑的方法，通過溫育W下物質(zhì)在單個多特異性結(jié)合分子中裝配所述結(jié)合實(shí)體：(a) 各自包含或綴合第一個結(jié)合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由 此F油片段或scFv特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物或第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物的第一個 表位，（b)各自包含或綴合第二個結(jié)合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗 體片段，由此Fab片段或scFv抗體片段特異性結(jié)合第二種細(xì)胞表面標(biāo)志物或第一種細(xì)胞表 面標(biāo)志物的第二個表位，和（C)在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第二個成員并在各自另 一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員的接頭。該物質(zhì)具有改善的祀向/遞送性質(zhì)。
[0020] 如本文報(bào)道的一個方面是用于產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子的方法，其包括W下步驟：
[0021] (i)確定在含有細(xì)胞的樣品中存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物和i)選擇其至少第一種細(xì) 胞表面標(biāo)志物和任選地第二種細(xì)胞表面標(biāo)志物，或ii)選擇其對應(yīng)于多特異性結(jié)合分子的 許多結(jié)合特異性的大量細(xì)胞表面標(biāo)志物，
[002引扣）溫育（a)各自包含結(jié)合對的第一個配偶體或成員的大量結(jié)合實(shí)體，由此每個 結(jié)合實(shí)體特異性結(jié)合不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物或其配體或同一細(xì)胞表面標(biāo)志物的表位，由此 結(jié)合對的各自第一個配偶體或成員僅結(jié)合其對應(yīng)的第二個配偶體或成員而不結(jié)合結(jié)合對 的任何其他第二個配偶體或成員，和化）包含結(jié)合對的對應(yīng)第二個成員的接頭，
[0023] 并由此產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子。
[0024] 如本文報(bào)道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，其包括W下步驟：
[00巧](i)確定樣品中細(xì)胞表面上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物并選擇其第一種表面標(biāo)志物和 第二種表面標(biāo)志物，
[0026] (ii)溫育（a)包含或綴合第一個結(jié)合對的第一個配偶體或成員的抗體F油片段 或scFv抗體，由此F油片段或scFv特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物，化）包含或綴合第 二個結(jié)合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此Fab片段或scFv 抗體片段特異性結(jié)合第二種細(xì)胞表面標(biāo)志物，和（C)在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第 二個成員并在各自另一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員的接頭，
[0027] 并由此產(chǎn)生雙特異性抗體.
[0028] 如本文報(bào)道的一個方面是用于確定多特異性結(jié)合分子的結(jié)合實(shí)體的組合的方法， 其包括W下步驟
[0029] (i)確定大量多特異性結(jié)合分子的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或 效應(yīng)功能和/或體內(nèi)半衰期，由此在大量多特異性結(jié)合分子中包含結(jié)合實(shí)體的每個（可能） 組合，
[0030] 和
[0031] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/ 或體內(nèi)半衰期的多特異性結(jié)合分子并由此確定抗原結(jié)合實(shí)體的組合。
[0032] 如本文報(bào)道的一個方面是用于確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合的方法，其包括W下步 驟：
[0033] (i)確定大量雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應(yīng) 功能和/或體內(nèi)半衰期，通過組合包含或綴合第一個結(jié)合對的第一個成員的第一大群抗體 Fab片段或scFv抗體片段的每個成員與包含或綴合第二個結(jié)合對的第一個成員的第二大 群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員W及在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第二 個成員并在各自另一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員的接頭來制備所述雙特異性抗 體，
[0034] 由此第一大群特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物并且第二大群特異性結(jié)合第二 種細(xì)胞表面標(biāo)志物，
[00巧]和
[0036] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/ 或體內(nèi)半衰期的雙特異性抗體并由此確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合。
[0037] 如本文報(bào)道的一個方面是雙特異性抗體，其包含
[0038] a)第一個F油片段或scFv抗體片段
[003引 U其特異性結(jié)合第一種表面標(biāo)志物，并且
[0040] ii)其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員，
[0041] b)第二個F油片段或scFv抗體片段
[0042] i)其特異性結(jié)合第二種表面標(biāo)志物，并且
[0043] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，和
[0044] C)對映體DNA多核巧酸接頭
[0045] i)其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員，并且
[0046] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第二個成員，
[0047] 由此第一個和第二個F油片段或scFv抗體片段形成非共價(jià)復(fù)合體。
[0048] W下是如本文報(bào)道的所有方面的實(shí)施方案。因此指出，每個實(shí)施方案可W與每個 方面組合并且還可W與如本文給出的所有其他各實(shí)施方案組合。
[0049] 在一個實(shí)施方案中，結(jié)合實(shí)體彼此獨(dú)立地選自基于da巧in結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基 于anticalin結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、T細(xì)胞受體片段像基于scTCR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于駱 駝VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于第十個纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于結(jié)合膊糖蛋白結(jié) 構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于巧粘蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于ICAM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于肌 聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于GCSF-R結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合實(shí)體、基于糖巧酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體、基于超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實(shí)體或 抗體片段（F油或scFv片段）。
[0050] 在所有方面的一個實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子是雙特異性抗體，或第一個和 第二個結(jié)合實(shí)體彼此獨(dú)立地是抗體片段。
[0051] 在一個實(shí)施方案中，抗體片段選自F油、F油'、F油'-SH、F(油'）2、雙抗體、線性抗 體、scFv、scF油S 和 dsFvSo
[0052] 在一個實(shí)施方案中，包含效應(yīng)部分、結(jié)合特異性和多核巧酸接頭的雙特異性抗體 的至少兩個組分彼此非共價(jià)結(jié)合。
[0053] 在一個實(shí)施方案中，結(jié)合實(shí)體選自抗體、抗體片段、受體、受體配體和祀標(biāo)結(jié)合支 架，條件是所述受體配體不是腸促膜島素受體配體多膚。
[0054] 在一個實(shí)施方案中，抗體片段選自F油、F油'、F油'-SH、F (油'）2、雙抗體、線性抗 體、scFv、scF油S 和 dsFvSo
[0055] 在一個實(shí)施方案中，祀標(biāo)結(jié)合支架選自da巧ins、血紅素蛋白樣分子和 anticalins。
[0056] 在一個實(shí)施方案中，受體選自T細(xì)胞受體片段和scTCR。
[0057] 在一個實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合分子是復(fù)合體，其包含
[0058] a)第一個結(jié)合實(shí)體
[0059] i)其特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物或其配體，并且
[0060] ii)其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員，
[0061] a)第二個結(jié)合實(shí)體
[0062] i)其特異性結(jié)合第二種細(xì)胞表面標(biāo)志物或其配體，并且
[0063] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，和
[0064] C)多核巧酸接頭
[0065] i)其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員，并且
[0066] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第二個成員。
[0067] 在一個實(shí)施方案中，雙特異性抗體是復(fù)合體，其包含
[0068] a)第一個F油片段或scFv抗體片段
[006引 U其特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物，并且
[0070] ii)其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員，
[0071] b)第二個F油片段或scFv抗體片段
[0072] i)其特異性結(jié)合第二種細(xì)胞表面標(biāo)志物，并且
[0073] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，和
[0074] C)多核巧酸接頭
[00巧]i)其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員，并且
[0076] ii)其綴合第二個結(jié)合對的第二個成員。
[0077] 在一個實(shí)施方案中，復(fù)合體是非共價(jià)復(fù)合體。
[0078] 在一個實(shí)施方案中，復(fù)合體還包含其他多膚i)其特異性結(jié)合第二個祀標(biāo)，并且 ii)其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，并且多核巧酸接頭綴合第二個結(jié)合對的第二個成 員。
[0079] 在一個實(shí)施方案中，復(fù)合體還包含效應(yīng)部分，其綴合與多核巧酸接頭的至少一部 分互補(bǔ)的多核巧酸。
[0080] 在一個實(shí)施方案中，復(fù)合體還包含綴合多核巧酸的效應(yīng)部分，所述多核巧酸i)與 綴合第一個或第二個結(jié)合實(shí)體或Fab片段或scFv抗體片段的多核巧酸的至少一部分互補(bǔ) 并且ii)不與多核巧酸接頭互補(bǔ)。
[0081] 在一個實(shí)施方案中，第一個和第二個結(jié)合實(shí)體或F油片段或scFv抗體片段結(jié)合同 一個祀標(biāo)和其上的非重疊表位。
[0082] 在一個實(shí)施方案中，多核巧酸接頭包含8、10、15、20、25、50、100個核巧酸。在一個 實(shí)施方案中，多核巧酸接頭包含高達(dá)500、750、1000或2000個核巧酸。在一個實(shí)施方案中， 多核巧酸接頭包含10-500個核巧酸。
[0083] 在一個實(shí)施方案中，多核巧酸接頭是對映體DNA。在一個實(shí)施方案中，對映體DNA 是kDNA。在一個實(shí)施方案中，kDNA是單鏈kDNA (ssA-DNA)。
[0084] 在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)部分選自結(jié)合部分、標(biāo)記部分和生物活性部分。
[0085] 在一個實(shí)施方案中，多核巧酸接頭在其第一個或第二個末端綴合結(jié)合實(shí)體、Fab片 段或scFv抗體片段。
[0086] 在一個實(shí)施方案中，多核巧酸接頭綴合兩個結(jié)合對的兩個第二個成員，由此第一 個結(jié)合對的第二個成員綴合多核巧酸接頭的第一個末端并且第二個結(jié)合對的第二個成員 綴合多核巧酸接頭的第二個末端。
[0087] 在一個實(shí)施方案中，第一個結(jié)合對的第一個和第二個成員分別包含SEQ ID NO:05 和SEQ ID NO:08的核酸序列。
[0088] 在一個實(shí)施方案中，第二個結(jié)合對的第一個和第二個成員分別包含SEQ ID NO:06 和SEQ ID NO:07的核酸序列。
[0089] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0090] a)合成第一個結(jié)合實(shí)體或Fab片段或scFv抗體片段，其特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表 面標(biāo)志物或其配體并且其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員，
[0091] b)合成第二個結(jié)合實(shí)體或Fab片段或scFv抗體片段，其特異性結(jié)合第二種細(xì)胞表 面標(biāo)志物或其配體并且其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，
[0092] C)合成多核巧酸接頭，其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員并且其綴合第二個結(jié)合 對的第二個成員，和
[0093] d)通過組合合成的組分形成復(fù)合體。
[0094] 如本文報(bào)道的另一方面是包含如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子或雙特異性抗體 和任選地藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。
[0095] 如本文報(bào)道的其他方面是如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子或雙特異性抗體用作 藥物。
[0096] 同樣，如本文報(bào)道的方面是如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子或雙特異性抗體用于 治療癌癥。
[0097] 如本文報(bào)道的另一方面是如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子或雙特異性抗體在制 造藥物中的用途。
[0098] 在一個實(shí)施方案中，藥物用于治療癌癥。
[0099] 如本文報(bào)道的方面是治療患有癌癥的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量 的如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子或雙特異性抗體。
[0100] 發(fā)明詳述
[0101] I.定義
[0102] 冠詞"a"和"an"在本文中用于指冠詞的語法對象之一或多于一個（即至少一個）。 例如，"抗體"表示一個抗體或多于一個抗體。
[0103] "受體人構(gòu)架"是包含來自如下文定義的人免疫球蛋白構(gòu)架或人共有構(gòu)架的輕鏈 可變域（VU構(gòu)架或重鏈可變域（VH)構(gòu)架的氨基酸序列的構(gòu)架。"來自"人免疫球蛋白構(gòu) 架或人共有構(gòu)架的受體人構(gòu)架可W包含相同的氨基酸序列，或者它可W含有氨基酸序列變 化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或 更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中，化受體人構(gòu)架與化 人免疫球蛋白構(gòu)架序列或人共有構(gòu)架序列在序列上相同。
[0104] 術(shù)語"親和力"表示分子（例如多膚或抗體）的單個結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體（例 如祀標(biāo)或抗原）之間非共價(jià)相互作用的總強(qiáng)度。除非另有說明，如本文所用，"結(jié)合親和力" 指內(nèi)在結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對的成員之間（例如多膚-多核巧酸-復(fù)合體中，或多膚與 其祀標(biāo)之間，或抗體與其抗原之間）的1 ;1相互作用。一般可W通過解離常數(shù)化的代表分 子X對其配偶體Y的親和力?？蒞通過本領(lǐng)域已知的常用方法，如表面等離振子共振，也包 括本文報(bào)道的那些方法測定親和力。
[0105] "親和力成熟的"抗體指在一個或多個高變區(qū)（HVRs)中具有一個或多個改變的抗 體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力改善。
[0106] 術(shù)語"籠住的"表示效應(yīng)物被在血清和體液中具有受控的半衰期的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。 可W通過內(nèi)源酶酶促切割保護(hù)基團(tuán)?？蒞由通過注射外部施用或經(jīng)口腔給藥的第二個效應(yīng) 物，如抗壞血酸去除、切割、降解、酶促消化或代謝保護(hù)基團(tuán)。可W通過體液中天然存在的酶 激活籠住的效應(yīng)分子?？蒞通過體液中同樣存在的還原劑，如抗壞血酸激活籠住的效應(yīng)部 分。
[0107] 術(shù)語"效應(yīng)部分"表示任何分子或分子組合，期望所述分子的活性向細(xì)胞遞送和/ 或定位在細(xì)胞中。效應(yīng)部分包括，但不限于標(biāo)記、細(xì)胞毒素（例如假單胞菌外毒素、籬麻蛋 白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等）、酶、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、藥物、放射性核素、配體、抗體、抗 體化區(qū)、脂質(zhì)體、毫微粒、病毒顆粒、細(xì)胞因子等。
[010引本文中的術(shù)語"抗體最廣義使用，并且包括多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克 隆抗體和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出想要的抗原結(jié)合活性。
[0109] 術(shù)語"抗體片段"表示完整或全長抗體的片段，其保留特異性結(jié)合抗原的能 力。抗體片段的實(shí)例包括但不限于Fv、FAB、FAB'、FAB' -SH、F(油'）2 ;雙抗體；線性抗 體；單鏈抗體分子（例如scFv)。對于某些抗體片段的綜述，參見化dson，P. J.，等，化t. Med. 9 (2003) 129-134。更詳細(xì)地，術(shù)語"抗體片段"包括的是（i) FAB片段，即由化、VHXL和 CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)抗體片段（對于包含挽救受體結(jié)合表位殘基并具有增加的體內(nèi)半衰 期的FAB和F(ab'）2片段的討論，參見US 5,869,046)，（U)F(ab'）2片段，即包含在較鏈區(qū) 通過二硫鍵連接的兩個FAB片段的二價(jià)片段，（iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段，（iv) 由抗體單條臂的化和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段（參見例如Plueckthun，The化armacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore (編牽茸），（Springer-Verlag, 爬訊￥〇'10，（1994)第 269-315 頁，胖0 93/16185、口5 5,571，894、口55,587,458)，（￥)(^6片段 (參見例如Ward, E.S.，等，化Uire 341 (1989) 544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成，和（vi)分離 的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域化和VH由分別的基因編碼，但是可 W使用重組方法通過使得它們能夠被制備成單條蛋白質(zhì)鏈（其中化和VH區(qū)配對形成單價(jià) 分子，稱為單鏈 Fv (scFv)，參見例如 Bird,化 E.，等，Science 242 (1988) 423-426 ;Huston, J.S.，等，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883)的合成接頭將它們連接起來?？?W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得該些抗體片段并且可與完整抗體相同的 方式篩選其結(jié)合性質(zhì)。
[0110] 與參照抗體"結(jié)合相同表位的抗體"指該樣的抗體，其在競爭測定中阻斷參照抗體 結(jié)合其抗原50%或更多，并且反過來，參照抗體在競爭測定中阻斷抗體結(jié)合其抗原50%或 更多。
[0111] 術(shù)語"嵌合"抗體指其中重鏈和/或輕鏈的部分來自特定的來源或物種，而重鏈和 /或輕鏈的剩余部分來自不同來源或物種的抗體。
[0112] 抗體的"種類"指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型。有5大類抗體；IgA、I曲、 I班、IgG和IgM，并且該些中的幾種可W進(jìn)一步分成亞類（同種型），例如，IgGi、IgG2、IgGs、 IgG4、IgAi和IgA2。對應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為a、5、e、y和y。
[0113] "化學(xué)治療劑"是用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例包括焼化 齊U，如喔替派和環(huán)磯醜胺（CYTOXAN?);焼基賴酸鹽，如白消安、二丙胺賴醋和脈泊舒 凡；氮丙巧類，如benzodopa、卡波釀、me1:uredopa和uredopa ;己帰亞胺類和甲基戊胺 類，包括六甲蜜胺、H亞胺嗦、H亞己基磯醜胺、H亞己基硫化磯醜胺和H甲基H聚氯胺 (trimethylomelamine);氮芥，如苯下酸氮芥、蔡氮芥、氯磯醜胺、雌氮芥、異環(huán)磯醜胺、 氮芥、氧氮芥氨氯化物、美法倉、新氮芥、膽留醇對苯己酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磯胺、尿 嚼巧氮芥；硝基脈，如卡莫司汀、氯脈菌素、福莫司汀、環(huán)己亞硝脈、尼莫司汀、雷莫司汀； 抗生素，如阿克拉霉素、放線菌素、奧萊霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素、加利車 霉素、car油icin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地巧比星、6-重氮 基-5-氧-心正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉 酷酸、諾加霉素、橄攬霉素、培來霉素、potfiromycin、嘿嶺霉素、H鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑 霉素、鏈脈菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代謝物，如氨甲噪嶺和 5-氣尿嚼巧巧-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸、氨甲噪嶺、蝶羅嶺、曲美沙特；嘿嶺類似物， 如氣達(dá)拉濱、6-琉基嘿嶺、硫咪嘿嶺、硫鳥嘿嶺；嚼巧類似物，如環(huán)胞巧、阿扎胞巧、6-阿扎 尿巧、卡莫?dú)狻⑻前?、二脫氧尿巧、去氧氣尿巧、依諾他濱、氣尿巧、5-FU;雄激素，卡普睪 麗、丙酸甲雄焼麗、環(huán)硫雄醇、美雄焼、睪內(nèi)醋；抗腎上腺素，如氨魯米特、米巧坦、曲洛司坦； 葉酸補(bǔ)充劑，如亞葉酸；醋葡酵內(nèi)醋；酵磯醜胺糖巧；氨基麗戊酸；胺苯嚇巧；bestrabucil ; 必桑郡；伊達(dá)曲殺；defofamine ;地美可辛；地嚇釀；elfornithine ;依利醋饋；依巧格魯； 硝酸嫁；輕基脈；香茹多糖；氯尼達(dá)明；米巧脈蹤；米巧意釀；單脈潘生下；硝氨丙嚇巧；噴 司他下通氨氮芥；化喃阿霉素；鬼日酸己脫；2-己基醜脫；甲基予脫；PSK?;丙亞胺巧 佐喃；錯螺胺；替奴佐酸；H亞胺釀；2, 2'，2"-H氯H己胺；烏拉坦；長春地辛；氮帰咪胺； 甘露莫司??；二漠甘露醇；二漠衛(wèi)矛醇；脈泊漠焼；gawtosine ;阿糖胞巧廣Ara-C");環(huán)磯 醜胺；喔替派；紫杉焼類，例如紫杉醇（TAXOL⑥，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton'NJ)和多西他賽（TAXOTERE?,Mi6ne-Poulenc Rorer,Antony,Rrance); 苯下酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘿嶺；琉嘿嶺；氨甲噪嶺；笛類似物，如順笛和碳笛；長春 堿；笛；依巧泊巧（VP-16);異環(huán)磯醜胺；絲裂霉素 C ;米巧意釀；長春新堿；長春帰堿；諾維 本；諾消靈；替尼泊巧；道諾霉素；氨基蝶嶺；希羅達(dá)；伊班麟酸鹽；CPT-II ;35拓?fù)洚悩?gòu)酶 抑制劑RFS 2000 ;二氣甲基鳥氨酸值MF0);視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；和上述任何藥 學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括抗激素劑，其作用于調(diào)節(jié)或抑制激素在腫瘤 上的作用，如抗雌激素，包括例如H苯氧胺、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4 (5)-咪哇類、4-輕H 苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奧那司麗和巧瑞米芬（法樂通）；和抗雄激素，如氣 他胺、尼魯米特、比卡魯胺、己酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何藥學(xué)上可接受的鹽、酸或 衍生物。
[0114] "抗血管發(fā)生劑"指在一定程度上阻斷或干擾血管發(fā)育的化合物?？寡馨l(fā)生劑例 如可W是小分子或抗體，其結(jié)合參與促進(jìn)血管發(fā)生的生長因子或生長因子受體。在一個實(shí) 施方案中，抗血管發(fā)生因子是結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的抗體。
[0115] 術(shù)語"細(xì)胞因子"是用于由作為細(xì)胞間介導(dǎo)物作用于另一細(xì)胞上的一個細(xì)胞群體 釋放的蛋白質(zhì)的總稱。此類細(xì)胞因子的實(shí)例是淋己因子、單核因子和常規(guī)的多膚激素。細(xì) 胞因子中包括的是生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨醜基人生長激素和牛生長激素；甲 狀旁腺激素；甲狀腺素；膜島素；膜島素原；恥骨松弛激素；恥骨松弛激素原；糖蛋白激素， 如促卵胞激素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)和促黃體生成激素（LH);肝生長因子；成纖維細(xì) 胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-P ;mullerian抑制物質(zhì)；小鼠絨 促性素相關(guān)膚；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素（TPO);神經(jīng) 生長因子，如NGF-P ;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子（TGFs)，如TGF-a和TGF-P ;膜島素樣 生長因子-I和-II ;促紅細(xì)胞生成素巧P0);骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-a、-P和-y ;集 落刺激因子（CSFs)，如集落刺激因子-CSF (M-CS巧；粒細(xì)胞-巨瞻細(xì)胞-CSF佑M-CS巧；和粒 細(xì)胞-CSF佑CS巧；白細(xì)胞介素（ILs)，如比-1、比-la、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、 比-8、比-9、比-10、比-II、比-12 ;腫瘤壞死因子，如TNF-a或TNF-P ;和其他多膚因子，包 括LIF和kit配體化L)。如本文所用，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培 養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物。
[0116] 術(shù)語"fMLP"表示由N-甲醜甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸組成的H膚。在一個實(shí) 施方案中，效應(yīng)部分是fMLP或其衍生物。
[0117] 術(shù)語"患者的表型"表示來自患者的一種細(xì)胞中的細(xì)胞表面受體的組合物。所述 組合物可W是定性的W及定量的組合物。為其確定/給出基因型的細(xì)胞可W是單細(xì)胞或包 含細(xì)胞的樣品。
[0118] 術(shù)語"前體藥物"指與親本藥物相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較少并且能夠被酶促 激活或轉(zhuǎn)化成更活躍的親本形式的藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式。參見例如Wilman， "Prodrugs in Cancer Chemotherapy"Biochemical Society Transactions,第14卷，615th Meeting Belfast(1986)第 375-382 頁和Stella,等，"Pro 化 ugs:A Qiemical Approach to Targeted Drug Delivery"，Directed Drug DeliveiT'Borchar化，等，（編輯），第 247-267 頁，Humana Press(1985)。可W用作效應(yīng)部分的前體藥物包括，但不限于含磯酸鹽的前體藥 物、含硫代磯酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含膚的前體藥物、D-氨基酸修飾的前 體藥物、糖基化的前體藥物、含b-內(nèi)醜胺的前體藥物，任選地取代的含苯氧己醜胺的前體 藥物或任選地取代的含苯己醜胺的前體藥物、5-氣胞嚼巧和可W轉(zhuǎn)化成更具活性的細(xì)胞毒 性游離藥物的其他5-氣脈嚼巧前體藥物?？蒞衍生成用于本發(fā)明的前體藥物形式的細(xì)胞 毒素藥物的實(shí)例包括，但不限于本文所述的那些化學(xué)治療劑。
[0119] 術(shù)語"細(xì)胞毒性部分"指抑制或防止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。 細(xì)胞毒性劑包括，但不限于放射性同位素（例如，At 2ii、I"i、li25、YW、Rei86、Rei88、Smi 53、Bi2i2、 P32、Pb2i2和Lu的放射性同位素）；化學(xué)治療劑或藥物（例如氨甲噪嶺、a化iamicin、長春花 生物堿（長春新堿、長春堿、依巧泊巧）、阿霉素、美法侖、絲裂霉素 C、苯下酸氮芥、柔紅霉素 或其他嵌入劑）；生長抑制劑；酶及其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或細(xì)菌、 真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及本文公開的多種抗腫瘤或 抗癌劑。
[0120] 物質(zhì)（例如藥物制劑）的"有效量"指在必需的劑量和時(shí)段上有效實(shí)現(xiàn)想要的治 療或預(yù)防結(jié)果的量。
[0121] 術(shù)語'卞C區(qū)"在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)，其含有恒定區(qū)的至少 一部分。所述術(shù)語包括天然序列化區(qū)和變體化區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人IgG重鏈化區(qū) 從切s226或從Pro230延伸至重鏈的駿基末端。然而，化區(qū)的C末端賴氨酸（Lys447)可 W存在或缺失。除非本文另有規(guī)定，化區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號根據(jù)抓編號系統(tǒng)， 也稱為抓索弓I，女口 Kabat,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, ^tional Institutes of Health, Bethesda，MD(1991)中所 述。
[0122] 術(shù)語"構(gòu)架"或"FR"指除高變區(qū)（HVR)殘基W外的可變域殘基?？勺冇虻腇R - 般由四個FR結(jié)構(gòu)域組成；FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般 W W下順序出現(xiàn)；FR1-H1 (L1) -FR2-肥（L2) -FR3-冊（L3) -FR4。
[0123] 術(shù)語"全長抗體"、"完整抗體"和"全抗體"在本文中可互換使用，指與天然抗體結(jié) 構(gòu)具有基本上類似的結(jié)構(gòu)或具有含有如本文中定義的化區(qū)的重鏈的抗體。該抗體一般包 含兩條重鏈和兩條輕鏈。
[0124] "人抗體"是擁有該樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞 產(chǎn)生的或來自利用人抗體所有組成成分或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基 酸序列。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[01巧]"人源化"抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌 合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其 中所有或基本上所有HVR (例如CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應(yīng) 于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可W包含來自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？?體，例如非人抗體的"人源化形式"指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。
[0126] 如本文所用的術(shù)語"高變區(qū)"或"HVR"指抗體可變域中在序列上高變的和/或形 成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)（"高變環(huán)"）的每個區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR;H個在 VH中化1、H2、H3)，且H個在化中（L1、12、13)。HVR -般包含來自高變環(huán)和/或來自 "互補(bǔ)決定區(qū)"(CDR)的氨基酸殘基，后一種具有最高序列變異性和/或參與抗原識別。示例 性高變環(huán)存在于氨基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (肥）和 96-101化3)上（參見 Chothia，C.和 Lesk，A.M.，J. Mol. Biol. 196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-肥和 CDR-冊）存在于 LI 的氨基酸殘基 24-34、 L2 的 50-56、L3 的 89-97、HI 的 31-35B、肥的 50-65 和冊的 95-102 上（參見 K油at,等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 片反 Public Health Service, P^Jational Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH 中的 CDRl 夕h, CDR -般 包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含"特異性決定殘基"或"SDR",其是接觸抗原的殘 基。SDR包含在稱為縮短的CDR或CDR的CDR的區(qū)內(nèi)。示例性a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、 3--〔01?-1^3、3-〔01?-化、3-〔01?-肥和3-〔01?-冊）存在于1^的氨基酸殘基31-34、1^2的 50-55、 L3 的 89-96、Hl 的 31-35B、肥的 50-58 和冊的 95-102 上（參見 Almagro, J. C.和化ansson, J.，化ont.Biosci. 13(2008) 1619-1633)。除非另有說明，可變域中的HVR殘基和其他殘基 (例如，F(xiàn)R殘基）在本文中根據(jù)K油at等，上文編號。
[0127] "免疫綴合物"是綴合到一個或多個非抗體來源分子，包括但不限于結(jié)合對的成 員、核酸或效應(yīng)部分上的抗體或抗體片段。
[012引"個體"或"受試者"是哺乳動物。哺乳動物包括，但不限于家養(yǎng)動物（例如，奶牛、 羊、貓、狗和馬）、靈長類（例如，人和非人靈長類，如猴子）、兔和曬齒類（例如，小鼠和大 鼠）。在某些實(shí)施方案中，個體或受試者是人。
[0129] 術(shù)語"單克隆抗體"指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即包含群體的各個抗 體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了例如含有天然發(fā)生的突變或在單克隆抗體制備物的 產(chǎn)生過程中出現(xiàn)的可能的變體抗體外，此類變體一般W極小量存在。與通常包括針對不同 決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗 體針對抗原上的單一決定簇。因此，修飾語"單克隆"表示抗體自基本上同質(zhì)的抗體群體獲 得的特性，而不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來產(chǎn)生抗體。例如，可W通過多種技術(shù)制備 待在如本文報(bào)道的復(fù)合體中使用的單克隆抗體或單克隆抗體片段，包括但不限于雜交瘤方 法、重組DNA方法、瞻菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因 動物的方法，本文中描述了用于制備單克隆抗體的此類方法和其他示例性方法。
[0130] 術(shù)語"單價(jià)結(jié)合多膚"或"單價(jià)結(jié)合抗體片段"表示僅具有單個位點(diǎn)或區(qū)域用于結(jié) 合其祀標(biāo)或抗原的分子。單價(jià)結(jié)合多膚的實(shí)例是膚、膚模擬物、適體、小的有機(jī)分子（能夠 特異性結(jié)合祀標(biāo)多膚的抑制劑）、da巧ins、銷蛋白重復(fù)序列蛋白質(zhì)、Kunitz類型結(jié)構(gòu)域、單 個結(jié)構(gòu)域抗體（參見出ey，T.，等，Trends Biotechnol. 23 (2005) 514-522)、細(xì)胞表面受體 的（天然的）配體、全長抗體的單價(jià)片段等。例如，全長抗體對其祀標(biāo)具有兩個結(jié)合位點(diǎn)， 因此其是二價(jià)的，然而scFv或FAB'抗體片段對其祀標(biāo)僅具有一個結(jié)合位點(diǎn)，因此其是單價(jià) 的。如果單價(jià)抗體或抗體片段用作多膚，那么該位點(diǎn)被稱為互補(bǔ)位。
[0131] 術(shù)語"裸抗體"或"裸抗體片段"表示未與非抗體部分（例如核酸或細(xì)胞毒性部分 或放射性標(biāo)記物）綴合的抗體或抗體片段。
[0132] "天然抗體"指具有不同結(jié)構(gòu)的天然發(fā)生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體 是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈通過二硫 鍵組成。從N至C末端，每條重鏈具有一個可變區(qū)（V田，又稱作可變重域或重鏈可變域，接 著是H個恒定域（CH1、C肥和C冊）。類似地，從N至C末端，每條輕鏈具有一個可變區(qū)（VL)， 又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個恒定輕（CL)域?；谄浜愣ㄓ虻陌被嵝蛄校?抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作K和入。
[0133] 術(shù)語"藥物制劑"指該樣的制劑，其是處于該樣的形式，W允許其中含有的活性成 分的生物活性有效并且其不含有對將被施用制劑的受試者具有不可接受的毒性的額外組 分。
[0134] "藥學(xué)上可接受的載體"指藥物制劑中除活性成分W外的成分，其對受試者無毒。 藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0135] 術(shù)語"多核巧酸"或"核酸序列"表示短的，一般是單鏈的多核巧酸，其包含至少8 個核巧酸和至多約1000個核巧酸。在一個實(shí)施方案中，多核巧酸具有至少9、或10、或11、 或12、或15、或18、或21、或24、或27、或30個核巧酸的長度。在一個實(shí)施方案中，多核巧 酸具有不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或45、或40、或35、或30 個核巧酸的長度。在其他實(shí)施方案中，多核巧酸具有至少9、或10、或11、或12、或15、或18、 或21、或24、或27、或30個核巧酸和不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、 或50、或45、或40、或35、或30個核巧酸的長度。
[0136] 術(shù)語"k多核巧酸"表示包含多于50%的k核巧酸作為單體結(jié)構(gòu)單元的核酸，女口 kDNA。在一個實(shí)施方案中，k多核巧酸僅包含心核巧酸。應(yīng)理解該心多核巧酸的核巧 酸數(shù)量在一個k核巧酸到任何數(shù)量的范圍內(nèi)。然而在一個實(shí)施方案中，k核巧酸的數(shù)量 是至少10、或15、或20、或25、或30、或35、或40、或45、或50、或55、或60、或70、或80、或 90或100個核巧酸。k多核巧酸由kA、kG、kC、kU、kT及其組合組成，由此kA表示 k核糖-腺嘿嶺等。L多聚脫氧核巧酸由kdA、kdG、kdC、k加、kdT及其組合組成，由 此kdA表示k脫氧核糖-腺嘿嶺等。
[0137] 術(shù)語"多核巧酸接頭"表示將兩條核巧酸序列連接在一起的部分。在一個實(shí)施方 案中，多核巧酸接頭是多核巧酸。在一個實(shí)施方案中，多核巧酸接頭包含至少一個多核巧酸 和至少一個非多核巧酸。非多核巧酸可W是多膚、聚合物或多糖。在一個實(shí)施方案中，多核 巧酸接頭包含長度從10-30個核巧酸的多核巧酸和線性聚（己二醇）。
[0138] "多膚"是由通過膚鍵（無論是天然產(chǎn)生的還是合成產(chǎn)生的）連接的氨基酸組成的 聚合物。少于約20個氨基酸殘基的多膚可W稱為"膚"，然而由兩個或多個多膚組成的或包 含多于100個氨基酸殘基的一個多膚的分子可W稱為"蛋白質(zhì)"。多膚還可W包含非氨基酸 組分，如碳水化合物基團(tuán)、金屬離子或駿酸醋。非氨基酸組分可W由表達(dá)多膚的細(xì)胞添加， 并且可W根據(jù)細(xì)胞的類型而變化。多膚在本文中其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼它們的核酸方面 進(jìn)行定義。添加，如碳水化合物基團(tuán)一般是未指定的，但是可W存在。
[0139] "多膚表位"表示相應(yīng)的單價(jià)結(jié)合多膚結(jié)合的多膚祀標(biāo)上的結(jié)合位點(diǎn)。其一般由氨 基酸組成。結(jié)合多膚結(jié)合線性表位，即由一段5-12個連續(xù)氨基酸組成的表位，或者結(jié)合多 膚結(jié)合由多膚祀標(biāo)若干短區(qū)段的空間排列形成的H維結(jié)構(gòu)?？蒞認(rèn)為結(jié)合多膚，例如抗體 或抗體片段的抗原識別位點(diǎn)或互補(bǔ)位識別的H維表位是抗原分子的H維表面特征。該些特 征精確地適合結(jié)合多膚的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)并且由此利于結(jié)合多膚與其祀標(biāo)之間的結(jié)合。
[0140] 術(shù)語"特異性結(jié)合"表示，多膚或抗體或抗體片段W 1(T8m或更小，在一個實(shí)施方案 中為在一個實(shí)施方案中為在一個實(shí)施方案中為在一 個實(shí)施方案中為10-8M-10-"M，或在一個實(shí)施方案中為10- 9M-10-"M的解離常數(shù)（KD)結(jié)合其 祀標(biāo)。所述術(shù)語進(jìn)一步用于表示，所述多膚不特異性結(jié)合存在的其他生物分子，即其W 1(T4M 或更大，在一個實(shí)施方案中為10-4M-1M的解離常數(shù)（KD)結(jié)合其他生物分子。
[0141] 如本文所用，"治療（treatment)"(及其語法變體，如"治療（treat)"或"治療 (treating)")指嘗試改變被治療的個體的天然過程的臨床干預(yù)，并且可W為預(yù)防或在臨床 病理學(xué)過程中進(jìn)行。想要的治療效果包括，但不限于防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、消 除疾病的任何直接或間接病理學(xué)結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、降低疾病發(fā)展的速率、改善或緩和疾病狀 態(tài)，和減緩或提高預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，如本文報(bào)道的復(fù)合體用于延遲疾病的發(fā)生或減 緩疾病的進(jìn)行。
[0142] 術(shù)語"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結(jié)合其抗原的結(jié)構(gòu) 域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域（分別為VH和VL) -般具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每 個結(jié)構(gòu)域包含4個保守的構(gòu)架區(qū)（FRs)和3個高變區(qū)（HVRs)(參見例如KiiKlt，等，Kuby Immunology,第 6 版，W. H. Rreeman and Co.，第 91 頁（2007))。單個 VH 或 VL 結(jié)構(gòu)域可 W 足W賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可W分別使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或化結(jié)構(gòu)域篩 選互補(bǔ)化或VH結(jié)構(gòu)域的文庫來分離結(jié)合特定抗原的抗體（參見例如化dolano, S.，等， J. Immunol. 150 (1993) 880-887, Clarckson，T.，等，化Uire 352 (1991) 624-628)。
[0143] 如本文所用，術(shù)語"載體"指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語 包括作為自身復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體及整合到其已經(jīng)引入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。 某些載體能夠指導(dǎo)與其有效連接的核酸的表達(dá)。此類載體在本文中稱為"表達(dá)載體"。
[0144] II.定制的多特異性結(jié)合分子
[0145] 在大多數(shù)基于細(xì)胞的疾病中，通過受體分子的基于抗體的結(jié)合祀向疾病相關(guān)的細(xì) 胞是一種有前途的方法。然而，臨床相關(guān)的表面受體（=祀標(biāo)）的表達(dá)水平根據(jù)患者而不 同并且基于標(biāo)準(zhǔn)化的抗體的藥物的功效因此非常不同。該尤其應(yīng)用于二特異性和多特異性 結(jié)合分子，其作用方式是同時(shí)祀向兩個不同的表位/受體。
[0146] 一種有前途的方法是設(shè)計(jì)特別用于各患者的特定/個體情況的藥物（本文中是二 特異性或多特異性結(jié)合分子）。
[0147] 基于患者的疾病相關(guān)細(xì)胞的臨床相關(guān)表面受體的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從文庫中特異地選 擇一系列結(jié)合實(shí)體（例如Fab片段）并組合到多特異性結(jié)合分子中作為患者特異性藥物。 在各疾病相關(guān)細(xì)胞（如例如，基于例如表面受體的表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞）方面特別選擇該 些所選擇的結(jié)合分子，并因此選擇各患者的需要和表型。
[014引組合/連接結(jié)合實(shí)體的接頭長度上的變化使得能夠選擇正確的靈活性和距離，其 可能為同時(shí)結(jié)合兩個結(jié)合實(shí)體所需，并因此為選擇性和/或特異性和/或功效所需。
[0149] 此外，可W通過有效負(fù)荷與接頭的特異性雜交添加有效負(fù)荷，如效應(yīng)功能或毒素。 該可能性進(jìn)一步增加治療應(yīng)用的生命力。
[0150] 可W在多種細(xì)胞體外測定/細(xì)胞樣品中測試所選患者特異的多特異性結(jié)合分子 的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（例如最佳結(jié)合/結(jié)合配偶體，最佳接頭長度等）：
[0151] -確定磯酸酪氨酸激酶的磯酸化狀態(tài)
[0152] -確定JNK抑制
[0153] -確定分子誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡
[0154] -利用單特異性相對于多特異性結(jié)合分子進(jìn)行結(jié)合測定
[0155] -確定增殖抑制
[0156] 利用該方法，產(chǎn)生定制的并因此高度有效的治療分子是可能的。該些分子將通過 改善的祀向/遞送（例如用于腫瘤細(xì)胞的有效負(fù)荷）減少副作用并且改善的祀向祀標(biāo)細(xì)胞 基于祀向組分（包含至少兩個結(jié)合分子）更高的選擇性和特異性。
[0157] 多特異性結(jié)合分子更高的選擇性和特異性是由于減少可能的"脫祀"結(jié)合的兩個 "低親和力"結(jié)合劑的組合的同時(shí)結(jié)合（親合力）。
[0158] 來自個體的每個細(xì)胞在所表達(dá)的細(xì)胞表面分子，如受體的數(shù)量和種類方面不同。 該對于癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞尤其正確。因此，可W通過存在的細(xì)胞表面分子來表征細(xì)胞。
[0159] 可W通過基于體外和體內(nèi)的細(xì)胞成像技術(shù)完成該表征。體內(nèi)成像技術(shù)包括例如光 學(xué)成像、分子成像、英光成像、生物發(fā)光成像、MRI、陽T、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查。體外 成像技術(shù)包括例如利用例如英光標(biāo)記的抗體（識別特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物）免疫組織化學(xué) 染色患者細(xì)胞并通過顯微鏡分析英光信號。或者，可W在利用標(biāo)記的治療或診斷抗體染色 后使用基于FACS的方法分析細(xì)胞的基因型/表型。
[0160] 在一個實(shí)施方案中，通過基于FACS的方法確定患者來源細(xì)胞的基因型/表型。在 一個實(shí)施方案中，通過使用英光標(biāo)記的診斷或治療抗體確定細(xì)胞表面標(biāo)志物。在一個實(shí)施 方案中，使用英光標(biāo)記的治療抗體。
[0161] 某些疾病可W與特定細(xì)胞表面分子的數(shù)量的改變或新細(xì)胞表面分子的出現(xiàn)相關(guān)。
[0162] 受該疾病影響的個體將在某些范圍內(nèi)展示疾病和/或個體特異的細(xì)胞表面標(biāo)志 物模式。
[0163] 該必須納入考慮，W向個體提供定制的祀向治療劑。
[0164] 針對細(xì)胞表面分子及其配體的許多治療抗體是已知的，其可W用于選擇和構(gòu)建定 制的多特異性祀向?qū)嶓w，如Rituxan/MabHiera/利妥昔單抗、2H7/0crelizumab、Zevalin/ Ibrizumomab、Arzerra/Ofatumumab (CD20)、HLL2/ 依帕珠單抗、Ino1:uzomab (CD22)、賽尼脈 /達(dá)克珠單抗、Simulect/己利昔單抗（CD25)、Herceptin/曲妥珠單抗、Pertuzumab化er2/ ERBB2)、麥羅培/吉妥珠單抗（CD33)、Raptiva/依法珠單抗（Cdlla)、艾比特思/西妥昔 單抗巧GFR，表皮生長因子受體）、IMC-1121B(VEGF受體2)、Tys油ri/那他珠單抗（a4目1 和a4目7整聯(lián)蛋白的a4-亞基）、ReoPro/阿昔單抗（甜1扣-甜Ila和a V目3-整聯(lián) 蛋白）、Orthoclone 0KT3/Muromon油-CD3(CD3)、Benlysta/Belimumab(BAFF)、Tolerx/ Oteliximab 仰3)、Soliris/E州lizumab (C5 組分蛋白質(zhì)）、Actemra/Tocilizumab (IL-6R)、 Panorex/ 依決洛單抗巧pCAM，上皮細(xì)胞粘附分子）、CEA-CAM5/Ubetuzumab(CD66/CEA, 癌胚抗原）、CT-11 (PD-1，程序性死亡-IT-細(xì)胞抑制受體、CD-d279)、肥24G11 (c-Met 受體）、SAR3419 (CD19)、IMC-A12/Cixutumum 油（IGF-1R，膜島素樣生長因子 1 受體）、 MEDI-575 (PDGF-R，血小板衍生的生長因子受體）、CP-675、206/Tremelimumab (細(xì)胞毒性T 淋己細(xì)胞抗原4)、R05323441 (胎盤生長因子或PGF)、HGS1012/Mapatumum油(TRA比-R1)、 SGN-70(CD70)、Vedotin (SGN-35)/化en化ximab(CD30)和 ARH460-16-2(CD44)。
[0165] 為了確定例如患者樣品中存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物，已知有不同的方法。一種示例 性方法基于英光激活的細(xì)胞分選（FACS)，特別是特異性染色和分選細(xì)胞群體的分析。在該 方法中，通過使用針對該些標(biāo)志物的英光標(biāo)記的抗體在呈現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物方面分析個 體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)樣品（細(xì)胞群體）的表型分型，任選地包括細(xì)胞群體中表面標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)分布。 尤其適合使用已經(jīng)用英光標(biāo)記為此目的標(biāo)記的治療抗體，因?yàn)橛谑潜ＷC后者定制的多特異 性結(jié)合分子將結(jié)合與診斷抗體相同的表位。如本文報(bào)道的多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗 體可W用于制備用于治療例如腫瘤疾病、也血管疾病、傳染病、炎癥疾病、自身免疫性疾病、 代謝（例如內(nèi)分泌）疾病或神經(jīng)學(xué)（例如，神經(jīng)變性）疾病的藥物。該些疾病的示例性非 限制性實(shí)例是阿爾茨海默氏病、非霍奇金淋己瘤、B-細(xì)胞急性和慢性淋己樣白血病、伯基特 淋己瘤、霍奇金淋己瘤、毛細(xì)胞白血病、急性和慢性髓細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞淋己瘤和白血 病、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、癌（如口腔癌、胃腸道癌、結(jié) 腸癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、膀脫癌、 膜腺癌、骨癌、肝癌、膽囊癌、腎癌、皮膚癌和睪丸癌）、黑素瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤，和皮膚癌、 急性特發(fā)性血小板減少性紫薇、慢性特發(fā)性血小板減少性紫薇、皮肌炎、西登哈姆舞蹈病、 重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風(fēng)濕熱、多腺體綜合征、大瘡性類天瘡瘡、糖尿 病、亨諾-許蘭氏紫薇、鏈球菌感染后腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、化kayasu' S動脈炎、艾迪生病、類 風(fēng)性濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、肉瘤樣病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動 脈炎、強(qiáng)直性脊柱炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓性脈管炎、干燥綜合征、原發(fā)性膽汁性 肝硬化、橋本甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多發(fā)性軟 骨炎、尋常性天瘡瘡、Wegener' S肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脊髓巧、巨細(xì)胞動 脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎、牛皮癖或纖維性肺泡炎。
[0166] 許多細(xì)胞表面標(biāo)志物及其配體是已知的。例如，已經(jīng)報(bào)道癌細(xì)胞表達(dá)W下細(xì)胞 表面標(biāo)志物和或配體中的至少一個，包括但不限于碳酸酢酶IX、甲胎蛋白、a-ctinin-4、 A3 (對 A33 抗體特異的抗原）、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、Bi~E3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、 CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDl-lA、CD14、CD15、CD16、 CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、 CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CX化 12、 HIF-l-a、結(jié)腸特異的抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、 EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸鹽受體、G250 抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、 歷1.24、人體絨毛膜促性腺激素（HCG)及其亞基、肥R2/neu、HMGB-l、低氧可誘導(dǎo)的因子 (HIF-1)、HSP70-2M、HST-2 或 la、IGF-1R、IFN-y、IFN-a、IFN-目、比-2、IL-4R、比-6R、 比-13R、比-15R、比-17R、比-18R、比-6、比-8、比-12、比-15、比-17、比-18、比-25、膜島素樣 生長因子-1 (IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/即T、巨瞻細(xì)胞游走抑制因 子（MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、 MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、膜腺癌粘蛋白、 胎盤生長因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磯酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PIGF、ILGF、ILGF-IR、 比-6、比-25、RS5、RANTES、TlOl、SAGE、SlOO、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、膊糖 蛋白、TRAIL 受體、TNF-a、Tn-抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、 邸-B纖連蛋白、WT-1U7-1A-抗原、補(bǔ)體因子〔3、〔33、〔313、〔53、〔5、血管發(fā)生標(biāo)志物、6(31-2、 bd-6、Kras、cMET、致癌基因標(biāo)志物和致癌基因產(chǎn)物（參見例如，Sensi等，Clin. Cancer Res. 12(2006)5023-5032 ;Parmiani 等，J. Immunol. 178(2007) 1975-1979 ;Novellino 等， Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207)。
[0167] 因此，識別特定細(xì)胞表面受體的抗體（包括其配體）可W用于特異性地和選擇性 地祀向并結(jié)合與疾病相關(guān)的許多/大量細(xì)胞表面標(biāo)志物。細(xì)胞表面標(biāo)志物是定位在細(xì)胞 (例如疾病相關(guān)細(xì)胞）表面上的多膚，其例如與信號傳遞事件或配體結(jié)合相關(guān)。
[0168] 在一個實(shí)施方案中，為了治療癌癥/腫瘤，使用多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗 體，其祀向腫瘤相關(guān)的抗原，如在化rberman, "Immunodia即osis of Cancer"，F(xiàn)leisher 編牽茸，"The Clinical Biochemistry of Cancer",第 347 頁（American Association of (：1111^31〇161111313，1979)和口5 4，150，149;口8 4,361，544;和口5 4,444,744 中報(bào)道的那 些。
[0169] 關(guān)于腫瘤相關(guān)抗原（TAAs)的報(bào)道包括Miz址ami等，化1:腳6 Med. 11 (2005)992-997 ;Hatfield 等，Curr. Cancer Drug Targets 5(2005)229-248; Vallbo timer 等，J. Clin. On col. 23 (2005) 3536-3544;和 Ren 等，Ann. Surg. 242(2005)55-63)，各自在鑒定的TAAs方面作為參考并入本文。
[0170] 疾病涉及淋己瘤、白血病或自身免疫性疾病時(shí)，祀向抗原可W選自CD4、CD5、CD8、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、 CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUCl 或 24、HLA-DR、膊糖 蛋白、VEGF、P1GF、邸-B纖連蛋白、癌基因、癌基因產(chǎn)物（例如，c-met或PLAGL2)、CD66a-d、 壞死抗原、比-2、1'101、146、比-6、]?伴、1^比-1?1值1?4)和1^比-1?2值貼）。
[0171] 已知許多雙特異性抗體針對兩個不同的祀標(biāo)，如BCMA/CD3,肥R家族中不同抗原 的組合巧GFR、肥R2、肥R3)、CD19/CD3、IL17RA/1L7R、比-6/比-23、比-1-目 /比-8、比-6 或 比-6R/比-21或比-21R，針對選自Lewis x-、Lewis b-和Lewis廠結(jié)構(gòu)、Globo H-結(jié)構(gòu)、 KH1、Tn-抗原、TF-抗原和粘蛋白的碳水化合物結(jié)構(gòu)、CD44、糖脂類和糖巧神經(jīng)銷脂類，女口 Gg3、抓3、GD3、GD2、抓5、Gml、Gm2、sial}dtetraosylceramide 的抗原的糖表位的第一個特 異性和針對選自EGFR、肥R2、肥R3和肥R4的化bB受體酪氨酸激酶的第二個特異性、與第 二個抗原結(jié)合位點(diǎn)組合的GD2與選自W下的免疫細(xì)胞相關(guān)；T-淋己細(xì)胞、NK細(xì)胞、B-淋 己細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨瞻細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、ANG2/ VEGF、VEGF/PDGFR-目、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)受體 2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3,選自 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、化T3、C-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、肥R3、肥R4、、 16尸3、？06。1?、(3-1(口、8〇?、整聯(lián)蛋白和匪?8的抗原與選自￥66。、66。、？16。、？06。、服。和血管 生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF 受體 1/CD3、EGFR/肥R3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、 END0SIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL 17A/F、EGF 受 體1/CD3,和CD19/CD16的水溶性配體的組合。
[0172] 因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用如本文報(bào)道的模塊方法，可W提供定制的雙特異性治療 抗體。在實(shí)際上存在于需要治療的個體細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子方面或在與該細(xì)胞表面分子 相互作用的配體方面定制該些抗體。通過確定個體的細(xì)胞表面分子狀態(tài)，可W選擇治療祀 標(biāo)的定制組合。
[0173] 通過組合用于同時(shí)祀向和結(jié)合兩個不同表位的2個單一治療分子定制產(chǎn)生雙特 異性治療劑，與單一治療分子相比可W預(yù)期累加/協(xié)同效果。
[0174] 通過使用早已可用的單特異性治療結(jié)合實(shí)體，如來自治療抗體的那些，可W實(shí)現(xiàn) 快速并容易地產(chǎn)生所需的多特異性結(jié)合分子。
[0175] 該些親和力改造的結(jié)合分子/抗體可W結(jié)合單個細(xì)胞上存在的兩個或多個細(xì)胞 表面標(biāo)志物。如果所有/兩個結(jié)合實(shí)體同時(shí)結(jié)合細(xì)胞，才僅希望該結(jié)合。為此目次，中等到 高度精煉的抗體尤其合適。另一方面，該也允許在篩選過程中排除結(jié)合特異性的較不特異 的組合。
[017引"Combimatrix"方法
[0177] 希望組合第一個結(jié)合實(shí)體，如抗體F油片段與另一個特異的結(jié)合實(shí)體，如第二個 抗體Fab片段。此外，可W篩選當(dāng)將第一個結(jié)合實(shí)體連接到許多不同的其他結(jié)合實(shí)體時(shí)，第 一個結(jié)合實(shí)體是否顯示更好的性質(zhì)。使用所謂的Combimatrix方法，可容易的方式解 決結(jié)合實(shí)體的大量組合。應(yīng)該指出，第二個結(jié)合實(shí)體可W結(jié)合不同的祀標(biāo)/表位/抗原，或 可W結(jié)合相同的抗原，但是不同的表位，或可W結(jié)合相同的表位，但是單一結(jié)合實(shí)體的不同 變體（例如，人源化候選物）。
[0178] 在該方案中，自動化平臺可W執(zhí)行任務(wù)來吸取、純化并組合結(jié)合實(shí)體及其反應(yīng) 物或衍生物。使用例如96孔板或其他高通量形式的任何平臺均是合適的，如化pendorf 巧Motion 5075vac移液機(jī)器人。
[0179] 首先，進(jìn)行結(jié)合實(shí)體（如抗體F油片段）編碼構(gòu)建體的克隆。一般通過基因合 成獲得具有結(jié)合實(shí)體編碼核酸的質(zhì)粒，由此所編碼的結(jié)合實(shí)體的C-末端區(qū)域含有分選 酶-motive和化s標(biāo)簽。將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)移到多孔板的各孔中（可W裝載整個板）。然后，用切 開結(jié)合實(shí)體編碼區(qū)的限制性內(nèi)切核酸酶混合物消化質(zhì)粒。希望W僅需要一種限制性內(nèi)切核 酸酶混合物用于所有質(zhì)粒的方式設(shè)計(jì)所有的基因合成。然后，任選的清洗步驟產(chǎn)生純化的 DNA片段。該些片段連接到已經(jīng)用如上提及的同一限制性混合物從受體載體切開的質(zhì)粒骨 架中?；蛘撸蒞通過化1C介導(dǎo)的克隆步驟進(jìn)行克隆方法。連接后，自動化的平臺將所有的 連接混合物轉(zhuǎn)移到具有感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞（例如，ToplOMulti Shot, Invitrogen)的其 他多孔板中并且進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。培養(yǎng)細(xì)胞至想要的密度。從培養(yǎng)混合物的等分試樣中可W 獲得甘油原種。從培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒（例如使用質(zhì)粒分離小量試劑盒（例如NucleoSpin96 Plasmid，Macher巧&化gel))。通過用適當(dāng)?shù)南拗泼富旌衔锵确衷嚇雍蚐DS-凝膠電泳 (例如E-Gel 48, Invitrogen)檢查質(zhì)粒身份。然后，可W用質(zhì)粒的等分試樣裝載新的平板 用于進(jìn)行對照測序反應(yīng)。
[0180] 在下一步中，表達(dá)結(jié)合實(shí)體。因而，將肥K細(xì)胞接種到多孔板（例如48孔板）中 并用分離的質(zhì)粒（在適當(dāng)?shù)墓羌茌d體中含有結(jié)合實(shí)體編碼區(qū)）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的HEK細(xì) 胞培養(yǎng)若干天并收集（例如，使用真空操作臺通過1. 2 y m和0. 22 y m濾板過濾）?？蒞通 過進(jìn)行例如化ISA監(jiān)測滴度。
[0181] 可W使用分選酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)膚反應(yīng)將結(jié)合實(shí)體共價(jià)連接寡核巧酸結(jié)合對的各成員。 在多孔形式中組合結(jié)合實(shí)體和分選酶反應(yīng)混合物。在37C溫育4-16小時(shí)后，通過使用負(fù) 向His標(biāo)簽選擇方法（將混合物應(yīng)用到例如His MultiTrap HP平板上佑E Healthcare)) 收集結(jié)合實(shí)體-寡核巧酸綴合物并過濾，由此仍然具有His標(biāo)簽的所有分子結(jié)合到層析柱 上，然而在濾液中發(fā)現(xiàn)了所有其他分子，像寡核巧酸綴合物；例如應(yīng)該通過將結(jié)合實(shí)體-寡 核巧酸綴合物應(yīng)用到超濾膜上或通過使用含有對結(jié)合實(shí)體特異的親和介質(zhì)的平板，利用濾 液進(jìn)行緩沖液交換；緩沖液交換（其也去除了過量的游離寡核巧酸）后，可W連接結(jié)合實(shí) 體-寡核巧酸綴合物，W變成多特異性結(jié)合分子。
[0182] 使用Combimatrix方法制備多特異性結(jié)合分子，參見下表。
[0183]
【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，其包括以下步驟 (i) 確定樣品中細(xì)胞表面上存在的表面標(biāo)志物并選擇其第一種表面標(biāo)志物和第二種表 面標(biāo)志物， (ii) 溫育（a)綴合第一個結(jié)合對的第一個成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此 Fab片段或scFv特異性結(jié)合第一種表面標(biāo)志物，（b)綴合第二個結(jié)合對的第一個成員的抗 體Fab片段或scFv抗體片段，由此Fab片段或scFv抗體片段特異性結(jié)合第二種表面標(biāo)志 物，和（c)對映體DNA多核苷酸接頭，其在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第二個成員并在 各自另一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員， 由此產(chǎn)生雙特異性抗體。
2. 用于確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合的方法，其包括以下步驟 (i) 確定大量雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/或體內(nèi)半 衰期，通過組合各自連接第一個結(jié)合對的相同第一個成員的第一大群抗體Fab片段或scFv 抗體片段的每個成員與各自連接第二個結(jié)合對的相同第一個成員的第二大群抗體Fab片 段或scFv抗體片段的每個成員，以及在其末端之一包含第一個結(jié)合對的第二個成員并在 各自另一末端包含第二個結(jié)合對的第二個成員的對映體DNA多核苷酸接頭來制備所述雙 特異性抗體， 由此第一大群特異性結(jié)合第一種細(xì)胞表面標(biāo)志物并且第二大群特異性結(jié)合第二種細(xì) 胞表面標(biāo)志物， 和 (ii) 選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應(yīng)功能和/或體內(nèi)半衰期的雙 特異性抗體并由此確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合。
3. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述雙特異性抗體是這樣的復(fù)合體，其包 含 a) 第一個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結(jié)合第一種表面標(biāo)志物，并且 ii) 其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員， b) 第二個Fab片段或scFv抗體片段， i) 其特異性結(jié)合第二種表面標(biāo)志物，并且 ii) 其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，和 c) 對映體DNA多核苷酸接頭 i) 其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員，并且 ii) 其綴合第二個結(jié)合對的第二個成員。
4. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述復(fù)合體是非共價(jià)復(fù)合體。
5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述結(jié)合對是多核苷酸的互補(bǔ)對。
6. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述復(fù)合體進(jìn)一步包含綴合多核苷酸的效 應(yīng)部分，所述多核苷酸與接頭的至少一部分互補(bǔ)。
7. 權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述復(fù)合體包含綴合多核苷酸的第二個效應(yīng)部分， 所述多核苷酸與綴合第一個效應(yīng)部分的多核苷酸的至少一部分互補(bǔ)并且ii)不與所述多 核苷酸接頭互補(bǔ)。
8. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一個和第二個Fab片段或scFv抗體 片段結(jié)合相同靶標(biāo)和其上的非重疊表位。
9. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述多核苷酸接頭包含8-1000個核苷酸。 在一個實(shí)施方案中，所述多核苷酸接頭包含10-500個核苷酸。
10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述對映體DNA是L-DNA。
11. 權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述L-DNA是單鏈L-DNA(ss-L-DNA)。
12. 藥物制劑，其包含通過權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法獲得的雙特異性抗體和任選地 藥學(xué)上可接受的載體。
13. 通過權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法獲得的雙特異性抗體用作藥物。
14. 通過權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法獲得的雙特異性抗體在制造藥物中的用途。
15. 治療患有癌癥的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的通過權(quán)利要求1-11 任一項(xiàng)的方法獲得的雙特異性抗體。
16. 雙特異性抗體，其包含 a) 第一個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結(jié)合第一種表面標(biāo)志物，并且 ii) 其綴合第一個結(jié)合對的第一個成員， b) 第二個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結(jié)合第二種表面標(biāo)志物，并且 ii) 其綴合第二個結(jié)合對的第一個成員，和 c) 對映體DNA多核苷酸接頭 i) 其綴合第一個結(jié)合對的第二個成員，并且 ii) 其綴合第二個結(jié)合對的第二個成員， 由此第一個和第二個Fab片段或scFv抗體片段與對映體DNA多核苷酸接頭形成非共 價(jià)復(fù)合體。
【文檔編號】A61K39/395GK104395340SQ201380033855
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】D·海因德爾, P·M·許爾斯曼, B·卡魯扎, E·科佩茨基, G·尼德菲爾納, G·蒂分塔勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司