專利名稱：一種含纖維蛋白原的穩(wěn)定化混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含纖維蛋白原的混合物，特別涉及一種生物活性成分(BAC)的穩(wěn)定化溶液，分別含成分A和B的一種雙成分組織膠以及可由A與B成分的混合而得到的一種血纖蛋白凝塊。
含纖維蛋白原的樣品可用于各種應(yīng)用，例如在雙成分組織膠或血纖維膠中使用。生物活性成分(BAC)是含纖維蛋白原的蛋白質(zhì)黏液，一般每毫升含約50毫克纖維蛋白原，該溶液從冷沉淀的血漿獲得。此類BAC在94/22503中曾有描述。由于對病毒滅活和濃縮所使用的方法導(dǎo)致所述冷沉淀物中的蛋白水解增加，需要用抗蛋白水解的試劑穩(wěn)定最終產(chǎn)物。某些這種蛋白水解酶以酶原(酶的無活性前體)形式存在并通過所述冷沉淀物中存在的微量活化的酶而激發(fā)其活性。已發(fā)現(xiàn)在分離所述冷沉淀物期間施用的溫度范圍促進蛋白水解酶前體的激活。這種激活推測以一種“級聯(lián)反應(yīng)”序列發(fā)生，由此蛋白酶激活其他蛋白水解酶的前體形式，包括從前體纖溶酶原產(chǎn)生溶血纖的纖溶酶。已發(fā)現(xiàn)抑制纖溶和其他蛋白水解活性能減少VIII因子和其他凝集與黏附性蛋白質(zhì)的降解。在2-6℃存放1天，BAC可能已發(fā)生自動凝集。溫度較低時，這個過程變慢；在-18℃存放數(shù)月后，未經(jīng)進一步處理的BAC在融溶后形成固體凝塊而不能被復(fù)原。用未純化的冷沉淀物亦觀察到同樣現(xiàn)象。
在所述生產(chǎn)過程中，通過氫氧化鋁移出纖溶酶原和其他維生素K依賴性蛋白酶。然而，某些蛋白酶留在終產(chǎn)物中。
需要使包含在一種混合物中特別是一種BAC溶液中的纖維蛋白原穩(wěn)定化以確保在臨床手術(shù)應(yīng)用時，安全使用所述產(chǎn)品。
意外的是，該目的通過含纖維蛋白原，4-(氨甲基)環(huán)己基-羧酸以及精氨酸，賴氨酸或其組合物的混合物達到。這種混合物優(yōu)選作為纖維蛋白原，氨甲環(huán)酸(tranexamic acid)(4-(氨甲基)-環(huán)已烷-羧酸)以及精氨酸，賴氨酸或其組合物的溶液存在。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括一種生物活性成分(BAC)的溶液，所述溶液已用氨甲環(huán)酸及其生理鹽和精氨酸或賴氨酸或者精氨酸與賴氨酸組合物的一種組合物穩(wěn)定化。所述溶液優(yōu)選被緩沖到與生理相容的pH值。氨甲環(huán)酸是一種蛋白酶抑制劑，其科學(xué)命名是4-(氨甲基)環(huán)己烷-羧酸。按照本發(fā)明，優(yōu)選含甘氨酸的緩沖液。
按照本發(fā)明，精氨酸以及賴氨酸可采用常用鹽，例如鹽酸鹽。所述BAC優(yōu)選從EP-A-534178公開的病情檢查(being worked up)后濃縮的冷沉淀物獲得。在該文章中已描述精氨酸作為治療性蛋白質(zhì)濃縮物的穩(wěn)定劑。然而，氨甲環(huán)酸與精氨酸以及賴氨酸的組合物所提供的協(xié)同作用是出人意料的。
在BAC溶液中氨甲環(huán)酸的量優(yōu)選約為重量的1-20％。精氨酸或賴氨酸鹽酸化物的量優(yōu)選為重量的0.1-4％。更優(yōu)選形式氨甲環(huán)酸的量約為重量的5-15％，特別優(yōu)選約為重量的8-12％。一般可使用約為重量的10％。精氨酸或賴氨酸鹽酸化物的量更優(yōu)選在重量的約1-3％的范圍，特別優(yōu)選是重量的約2％。
含纖維蛋白原的樣品，特別是BAC溶液優(yōu)選從WO-A-94/22503中描述的超濾濃縮的冷沉淀物獲得。所述BAC優(yōu)選包含約15-150毫克/毫升纖維蛋白原含量，特別優(yōu)選含約20-80毫克/毫升。纖維蛋白原的量可按照Clauss的方法進行測量(Clauss，A.，“Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung desFibrinogens”，Acta.Haematol.，17，237-247，1957)。
使用從濃縮的冷沉淀物獲得的BAC是有利的，因為這種組分除了纖維蛋白原外還含有價值的血液成分，所述成分在一種蛋白水解酶如人類凝血酶與BAC溶液接觸時對血液凝集起重要作用。有價值的成分是因子VIII，因子XIII，纖連蛋白，玻連蛋白，von Willebrand因子(vWF)等。
所述成分優(yōu)選從冷沉淀物，特別是從濃縮的冷沉淀物獲得。然而，也可通過重組方法制備纖維蛋白原，因子VIII，因子XIII，纖連蛋白，von Willebrand因子(vWF)，玻連蛋白成分。此類制劑，例如因子VIII可購買到。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，氨甲環(huán)酸與精氨酸或賴氨酸的組合物對含纖維蛋白原的混合物，特別是生物活性成分BAC溶液起穩(wěn)定化作用(在2-6℃，保持至少50％的纖維蛋白原活性至少14天)。當(dāng)僅使用所述成分之一時，所述樣品就明顯不穩(wěn)定。
而且，意外的是使用氨甲環(huán)酸與精氨酸或賴氨酸的鹽酸化物對從按照本發(fā)明穩(wěn)定的BAC獲得的血凝塊的性質(zhì)沒有不利影響。例如在各個樣品在存放14天后仍保持最大拉伸率并且張力幾乎保持在同樣水平。而且，在加入氨甲環(huán)酸和精氨酸或賴氨酸時，所述BAC中因子VIII的活性沒有受到反面影響。
特別是，本發(fā)明的生物活性成分BAC的穩(wěn)定化溶液十分適合制備雙成分組織膠。本發(fā)明的組織膠被理解為在患者需要時，例如為避免外科手術(shù)中的嚴(yán)重出血可由患者使用或在患者身上使用的一種系統(tǒng)。這種組織膠還被稱為血纖蛋白膠并基本上類似于天然的血液凝集級聯(lián)反應(yīng)。在外科手術(shù)中應(yīng)用之前，所述組織膠從兩種成分獲得。一種成分含纖維蛋白原，其在接觸到纖溶酶如人類凝血酶時形成血纖蛋白，后者是形成天然血凝塊的基礎(chǔ)物質(zhì)。在外科手術(shù)期間，應(yīng)用所述兩種成分，例如通過盡可能快速混合所述兩種成分并避免阻塞供應(yīng)管線同時排空兩只注射器。本發(fā)明的溶液有利于制備一種雙成分血纖蛋白膠，因為纖維蛋白原溶液不必新配制，而可存放在-18℃冰箱中，既不失去其凝集能力又不失去其優(yōu)越的機械性質(zhì)。纖維蛋白原活性的程度可通過在所述溶液中提供較高量的纖維蛋白原來平衡為的是不妨礙含溶液(BAC)的纖維蛋白原的適當(dāng)使用。
因此，本發(fā)明的主題也是一種分別含成分A和成分B的雙成分組織膠，其中成分A含權(quán)利要求1到10中描述的實施方案的溶液，而成分B含能與纖維蛋白原反應(yīng)(或分別與BAC反應(yīng))形成血纖蛋白的蛋白水解酶溶液。
所述蛋白水解酶優(yōu)選是人類凝血酶，特別是具有約2到4,000IU/ml活性的人類凝血酶。凝血酶活性按照凝血檢測法(EuropeanPharmacopoeia)進行測試。技術(shù)人員應(yīng)能理解，血纖蛋白膠可由其血凝性蛋白質(zhì)的含量進行定義，而不是根據(jù)血凝性纖維蛋白原定義。
為提供混合成分A與B的平衡溶液，向成分B加入約同樣濃度的氨甲環(huán)酸和精氨酸可能是有利的。
成分A和B的使用方式優(yōu)選是等體積的兩種成分被混合并給患者施用在傷口側(cè)面。當(dāng)然，應(yīng)能理解，所述雙成分組織膠不僅可在手術(shù)期間使用，而且還可在其他必須止血的情況使用。兩種成分優(yōu)選以1∶1的比例施用。
下述實施例闡明氨甲環(huán)酸與精氨酸的穩(wěn)定化組合物的優(yōu)越性。這些實施例并非任何限制而是對本發(fā)明的更詳盡解釋。
實施例1檢測物質(zhì)的制備從生產(chǎn)線收到樣品后立即向800毫升樣品中加入0.8克粉末狀疊氮鈉(0.1％)，以控制細菌生長。加入抑菌劑對防止污染是必要的，因為樣品中高濃度的纖維蛋白原是難于過濾的。
通過加入所述兩種固體成分的混合物到100毫升一份的樣品中臨時準(zhǔn)備各被測濃度。隨著溫和攪拌(多點瓷性攪拌平板)在燒杯中加入氨甲環(huán)酸和鹽酸精氨酸共進行10分鐘。以相應(yīng)方式制備全部制劑并通過加入緩沖液B調(diào)其纖維蛋白原濃度到50毫克/毫升。
繼續(xù)攪拌5分鐘后，按5毫升一份裝入硅化玻璃試管中。全部試管被同時冷凍并存放在-80℃直到使用。在實驗前，將它們放置在2-6℃(“0”日為時間基線)。
每組取兩只試管保持在-80℃作為陽性對照。全部實驗以一式雙份進行并按照如下穩(wěn)定劑濃度標(biāo)記每只試管；組A無穩(wěn)定劑-試管A1到A20組B0％氨甲環(huán)酸和2％精氨酸一氫氯化物-試管B1-B20組C5％氨甲環(huán)酸和2％精氨酸一氫氯化物-試管C1-C20組D10％氨甲環(huán)酸和2％精氨酸一氫氯化物-試管D1-D20組E10％氨甲環(huán)酸和0％精氨酸一氫氯化物-試管E1-E20組F10％氨甲環(huán)酸和1％精氨酸一氫氯化物-試管F1-F20組G10％氨甲環(huán)酸和4％精氨酸一氫氯化物-試管G1-G20多出的樣品量被作為保留樣品保存并在需要時使用。
在測試前，全部-80℃冷凍試管將在37℃融溶15分鐘并放置在2-6℃(“0”日)。每組的兩只試管將在0日在室溫搖晃15分鐘并進行它們的機械性質(zhì)和生化測試與評估。同樣方法將在2日，4日，7日，9日，11日，14日和30日重復(fù)進行。
機械性質(zhì)血纖蛋白膠的伸長實驗在拉力實驗機CHATILLON MODEL TCD-200上，用1,000g的CHATILLON Force Gauge進行。數(shù)據(jù)將通過計算機程序處理。
這個儀器是發(fā)動機驅(qū)動的拉力和壓力測試儀，它被設(shè)計用于測試各種產(chǎn)品和材料的彈性，流動點和斷裂強度。
為產(chǎn)生可容易附著到拉力實驗機形式的標(biāo)準(zhǔn)固化膠凝塊，設(shè)計一種特殊的模具。它包含兩個錐形鋁塑模，每個2.5厘米高，它們被上下摞放(見

圖1)。所述膠的液體成分被注射進入模具，在其中它們被固化成12.7mm×5mm的標(biāo)準(zhǔn)凝塊。
圖1說明設(shè)計存放液體膠直到凝固的特殊模具。
然后將所述模具固定到拉力實驗機中，并通過將兩模具拉開，測量模具內(nèi)膠柱體的拉力強度與伸長。
計算機程序監(jiān)視每0.2秒鐘的拉力和伸長。測試點被繪制在兩個軸上在一給定時間，克為單位，延長與拉力對應(yīng)。
測試方法含BAC的試管在37℃溫孵15分鐘，然后在室溫搖晃15分鐘。定制設(shè)計的鋁模具(如前所述)用0.5毫升BAC和0.5毫升凝血酶(8IU/毫升)組合溶液填充。
所述模具被放置在室溫45分鐘以使膠固化，然后裝入量器并測試所得凝塊的最大延長值和拉力強度(斷裂所述凝塊所需要的拉力)。
進行生化測試通過下述方法測定下述蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性纖維蛋白原凝集活性通過Clauss的凝集方法定量測定纖維蛋白原。
實施例2各種濃度的氨甲環(huán)酸和鹽酸精氨酸對凝塊的拉力/毫米(斜度)的影響
結(jié)論冷凍時Arg或TEA均增加凝塊的斜度(凝塊比無穩(wěn)定劑而只有TEA時強度更大，TEA在4-8℃溫孵時間內(nèi)對凝塊的強度有穩(wěn)定化作用。
實施例3各種濃度的氨甲環(huán)酸和鹽酸精氨酸對可凝集纖維蛋白原含量的影響
結(jié)論TEA使可凝集纖維蛋白原穩(wěn)定化實施例4氨甲環(huán)酸與鹽酸精氨酸對因子VIII活性的影響
結(jié)論Arg.在冷凍時使FVIII穩(wěn)定化，而TEA在4-8℃溫孵期間使FVIII穩(wěn)定化。
權(quán)利要求
1.含纖維蛋白原，4(氨甲基)-環(huán)己烷-羧酸(氨甲環(huán)酸)以及精氨酸，賴氨酸或其組合物的一種混合物。
2.權(quán)利要求1的混合物，其中包含纖維蛋白原，氨甲環(huán)酸以及精氨酸，賴氨酸和(或)其組合物的溶液。
3.權(quán)利要求1和(或)2的溶液，其中包含生物活性成分(BAC)，它是一種從血漿獲得的蛋白質(zhì)溶液，其中含纖維蛋白原，氨甲環(huán)酸和精氨酸或賴氨酸或者精氨酸與賴氨酸的混合物，它們的藥用鹽以及任意的在水介質(zhì)中形成緩沖溶液的物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3任何之一的溶液，其中氨甲環(huán)酸的量約為重量的1％-20％，而精氨酸或賴氨酸鹽酸化物的量約為重量的0.1％-4％。
5.權(quán)利要求1-3任何之一的溶液，其中氨甲環(huán)酸的量約為重量的5％-15％，而精氨酸或賴氨酸鹽酸化物的量約為重量的1-3％。
6.權(quán)利要求3的溶液，其中BAC從濃縮的冷沉淀物獲得。
7.權(quán)利要求1-6任何之一的溶液，其中所述BAC包含約15到150毫克/毫升的纖維蛋白原含量。
8.權(quán)利要求1到7任何之一的溶液，其中所述BAC進一步包含因子VIII，因子XIII，纖連蛋白，von Willebrand因子(vWF)，玻連蛋白。
9.權(quán)利要求8的溶液，其中因子VIII，XIII，纖連蛋白，vonWillebrand因子(vWF)，玻連蛋白通過重組方法制備。
10.權(quán)利要求1到9任何之一的溶液，其中所述緩沖溶液是甘氨酸緩沖液。
11.分別含成分A和B的一種雙成分組織膠，其中-成分A包括權(quán)利要求1到10之一的溶液，而-成分B包含一種蛋白水解酶的溶液，當(dāng)其與纖維蛋白原反應(yīng)時能形成血纖蛋白。
12.權(quán)利要求11的雙成分組織膠，其中成分B包含人類凝血酶，其活性按照Clauss方法測量每毫升約為2-4000國際單位。
13.權(quán)利要求11或12任何之一的雙成分組織膠，其中成分B用氨甲環(huán)酸和精氨酸穩(wěn)定化。
14.通過以適當(dāng)比例，優(yōu)選1∶1混合成分A與成分B可獲得的血纖蛋白凝塊。
全文摘要
一種含樣品的纖維蛋白原穩(wěn)定化溶液,特別是一種生物活性成分(BAC)的穩(wěn)定化溶液,所述溶液是一種從血漿獲得的蛋白質(zhì)溶液,其中包含纖維蛋白原,氨甲環(huán)酸和精氨酸或賴氨酸或精氨酸與賴氨酸的混合物,它們的藥用鹽以及構(gòu)成以水為介質(zhì)的緩沖溶液的任意物質(zhì)。
文檔編號A61L24/00GK1246069SQ98802175
公開日2000年3月1日 申請日期1998年1月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月31日
發(fā)明者I·努爾, L·巴, O·利伯曼 申請人:奧姆里克斯生物化學(xué)品公司