一種同時制備高純人凝血因子viii及人纖維蛋白原的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物制藥領域，涉及一種血液制品的制備，具體講是涉及一種同時制備 高純人凝血因子VIII及人纖維蛋白原的方法。
【背景技術】
[0002] 人凝血因子VIII (FVIII)是在肝臟中合成的人體凝血因子之一，有2332個氨 基酸殘基，由兩條肽鏈所組成，重鏈分子量為90~200kDa ;輕鏈分子量為80kDa，二條 肽鏈間由Ca2+連接。在人體內的半衰期8~12小時，血漿中的含量僅為0. 05~0. lmg/ 升。FVIII缺乏會導致甲型血友病發(fā)生，該病是一種遺傳性疾病，患者多為男性，發(fā)病率約 1/10000~1/5000,患者出血部位集中于關節(jié)、肌肉和內臟。其中，關節(jié)反復出血導致骨骼變 形，肌肉萎縮；而內臟和顱內出血則會危及生命。甲型血友病因屬遺傳性疾病，目前尚無根 治的方法，只能通過輸注F W制劑進行替代性治療，只要定期輸注F W制劑，甲型血友病患 者完全可以像正常人一樣生活。
[0003] 人纖維蛋白原（human fibrinogen，簡稱Fg),是一種含2964個氨基酸、具有凝血 功能的蛋白質，由肝臟合成，它是人體所有凝血因子中含量最大的一種，血漿中含量2~4 克/升，分子量340KD，半衰期4~6日，等電點5. 10-5. 50,沉降系數(shù)7. 70-7.90。Fg由α、 β、γ三對不同多肽鏈所組成，多肽鏈間以二硫鍵相連。人體凝血的最后階段是在凝血酶作 用下，F(xiàn)g的α鏈與β鏈分別釋放出Α肽與Β肽，生成纖維蛋白單體，進一步在Ca2+與活化 的XIII因子作用下，單體之間以共價鍵相連，變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊，從而完成 凝血過程。Fg缺乏會導致各類凝血方面的疾病，常見的包括：先天性纖維蛋白原減少或缺 乏癥，以及因肝損傷、肝硬化、彌散性血管內凝血、外傷、產后大出血、大手術、內出血等導 致的后天性纖維蛋白原缺少癥。因先天因素引起的Fg減少或缺乏癥，補充Fg是目前唯一 可靠的治療方法，而對于后天因素引起的Fg減少或缺乏，根據(jù)病因的不同，也需輸注不 同劑量的Fg。Fg除直接參與凝血過程外，還可介導血小板聚集，影響血液粘度，是心、 腦血管病發(fā)病的重要危險因素，在動脈粥樣硬化的形成及腫瘤血行轉移等病理過程中也起 重要作用。
[0004] 近年來，一種具有高效止血功能的外科用血液制品一一人纖維蛋白粘合劑在臨床 上的應用越來越廣泛，也使得作為該藥配伍之一的高濃度人纖維蛋白原的需求量大增.人 纖維蛋白粘合劑所用的Fg與常規(guī)靜脈輸注的Fg很大的不同，主要體現(xiàn)在前者具有很高的 蛋白濃度，至少是后者(一般為2. 5%)的二倍或者更高。
[0005] Fg制品最大的問題在于凍干粉復溶時間長且溶解時需在30_37°C的水浴中進行， 另一個問題是容易產生蛋白析出及蛋白顆粒懸浮，這給臨床使用帶來了不便，譬如必須提 前從冰箱里取出置于水浴中，靜脈輸注時需配備過濾裝置。低濃度人纖維蛋白原尚且如此， 高濃度人纖維蛋白原的復溶就更困難了。因此用常規(guī)的人纖維蛋白原生產工藝很難制備出 合格的高濃度纖維蛋白原產品。
[0006] 目前，國內血制品公司供應市場的F VID產品數(shù)量十分有限，患者經常面臨無藥可 用的情況，嚴重危害患者的健康和生命安全。國內目前血制品廠家的FVIII制備工藝得率 普遍較低，一般不高于10萬IU/噸血漿（FVIII含量一般為70~80萬IU/噸血漿)，同時產 品純度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外產品的外觀欠佳，凍干粉不成餅狀，復溶后乳光 較重，有的還有蛋白析出。
[0007] 目前我國也僅有少數(shù)幾家血制品公司具有人纖維蛋白原的生產能力，但產量均不 大，有的公司生產斷斷續(xù)續(xù)，基本處于停頓狀態(tài)，因而纖維蛋白原在臨床上也處于供應不足 的狀態(tài)，作為人纖維蛋白粘合劑配伍的高濃度人纖維蛋白原，由于技術難度較高，國內僅 個別廠家有能力生產。
[0008] 傳統(tǒng)的生產工藝，大都是用冷沉淀生產人凝血因子VIII，用組分I生產人纖維蛋 白原，這種工藝的缺點在于，冷沉淀中含有的人纖維蛋白原（約占血漿Fg的20%)被當作生 產廢料扔掉了；同樣地，組分I中含有的大量FVIII也未回收利用而白白損失。
[0009] 鑒于此，本發(fā)明開發(fā)了一種冷沉淀與組分I沉淀混合投料，同時制備高純FVIII 與人纖維蛋白原的新工藝，降低了勞動強度，縮短了生產周期，大大提高了 FVIII與Fg的得 率與純度，明顯改善了人纖維蛋白原的品質，使得高濃度纖維蛋白原的外觀得到明顯改善， 復溶時間大大縮短，可以大規(guī)模進行生產。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種工藝穩(wěn)定、產品質量好、得率高、生產成本 低及生產效率高的同時制備人凝血因子VIII及纖維蛋白原的方法。
[0011] 1. -種同時制備高純人凝血因子VIII及人纖維蛋白原的方法，其特征在于：生產 流程包括如下步驟： (1) 冷沉淀與組分I沉淀制取 將新鮮冰凍血漿融化，保持血漿溫度在1-3°C，離心得到冷沉淀，保持0-5°C，暫存；在 去冷沉淀血漿中加入-20°C以下的低溫95%乙醇，使血漿中乙醇含量約7-9%，調節(jié)PH值至 6. 80-7. 00,在-1~-3°C下離心得到組分I沉淀；然后立即將冷沉淀與組分I沉淀合并在一 起，切成碎塊； (2) 冷沉淀與組分I沉淀共溶解并壓濾 按1 :10~20的重量比，將切成碎塊的新鮮冷沉淀及組分I沉淀一起投入預先配制的溶 解緩沖液1中，溫度控制在15_30°C，攪拌2. 5-5小時，使其充分溶解；然后用PALL公司生 產的Supradur 50P濾板串聯(lián)0. 45Mm濾芯壓濾，收集澄清濾液；過濾前用溶解緩沖液1預洗 濾板及濾芯； (3) DEAE Sephadex A-50凝膠吸附并過濾 在步驟（2)收集的濾液中加入預先用65°C以上的熱注射用水溶脹后用25°C以下的冷 注射用水冷卻再用步驟（2)所述溶解緩沖液1平衡的DEAE Sephadex A-50凝膠，按凝膠 溶脹前的重量(干重)計，凝膠的加入量為0. 5-1. 5克/kg溶解緩沖液1 ;凝膠加入到濾液后 緩慢攪拌45-75分鐘，后靜置5-10分鐘；然后過濾，收集濾液； (4) S/D病毒滅活 在步驟（3)收集的濾液中加入Tween80至1.0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0.3% (wt%)，攪勻后升溫至24-26°C，后保溫6-8小時，然后用0. 45Mm濾芯過濾，收集濾液； (5)陰離子交換柱層析 步驟（4)收集的濾液上陰離子交換柱進行層析，柱子預先用平衡緩沖液1充分平衡；上 柱過程中，收集穿透液，上柱結束后，用平衡緩沖液1沖洗柱子，將沖洗液并入穿透液中；后 用洗滌緩沖液1洗滌柱子，再用洗脫緩沖液1洗脫柱子，收集洗脫液即為純化的FVIII溶 液，及時用〇.45μπι濾芯進行過濾，收集濾液；洗脫液的濾液按照以下6A-11A步驟進行，而 流穿液按6B-11B步驟進行； (6A)疏水柱層析；以上洗脫液濾液中加入氯化鈉至1. 8M-2. 5M,然后上疏水柱，柱子 預先用平衡緩沖液2充分平衡；上柱結束后用平衡緩沖液2沖洗柱子，后用洗滌緩沖液2洗 滌柱子，再用洗脫緩沖液2洗脫，收集洗脫液即為高純FVIII溶液；用0. 45Mm或0. 22Mm濾 芯過濾，收集濾液； (7A)用10K~30K的超濾膜濃縮以上濾液，然后恒體積透析4-6倍，再濃縮至凝血FVIII 活力高于35IU/ml;后移出超濾膜包并后洗膜包； (8A)調節(jié)FVIII含量至所需值(一般規(guī)格為20-30IU/ml)，加入穩(wěn)定劑，后調PH值至 6. 50-7. 50 ； (9A)用0. lMm濾芯串聯(lián)15-20納米濾芯進行除病毒過濾 (IOA) 用0. 22Mm濾芯對廣品進彳丁除囷過濾并分裝； (IIA) 凍干； (12A)干熱病毒滅活 將人凝血因子VIII凍干制劑在100°C沸水浴中保溫30分鐘，進行干熱病毒滅活； (6B)將流穿液溫度降至-2~0°C時，緩慢加入-20°C以下的低溫95%乙醇溶液至濃度為 7-9% (V/V)，調解PH值至6. 80-7. 20,保持溫度-3. 0-0°C，均勻攪拌1. 5-3小時后離心，得 到第一次Fg沉淀，立即切碎； (7B)按1 :10-20的稀釋比，將以上切碎的新鮮Fg沉淀投入預先配制的溶解緩沖液2 中溶解，在20-30°C下均勻攪拌2-3小時；用30SP深層濾芯（3M公司CUNO濾芯）串聯(lián)一只 1. OMffl的濾芯過濾懸浮液；用上述溶解緩沖液2后洗濾芯，收集濾液； (8B)將濾液降溫至-1°C左右，緩慢加入低溫乙醇(不高于_20°C )至7-9% ;攪拌2-3小 時，低溫（-2-0°C )離心，得到第二次Fg沉淀，立即切碎； (9B)根據(jù)終產品的蛋白濃度要求(一般為2. 5-6. 0%)，將以上切碎的新鮮沉淀投入預先 配制的溶解緩沖液3中，在20-30°C下攪拌0. 5-2小時，后調節(jié)蛋白濃度至所需值，調PH值 至6. 50-7. 50,用0. 45Mm的濾芯過濾并用溶解緩沖液3后洗濾芯，收集濾液； (IOB) 除菌過濾并分裝； (IIB) 凍干； (12B)干熱病毒滅活 將人纖維蛋白原凍干制劑在l〇〇°C沸水浴中保溫30分鐘，進行干熱病毒滅活。
[0012] 2.根據(jù)權利要求1所述的一種同時制備高純人凝血因子VIII及人纖維蛋白原的 方法，其特征在于：步驟（2)所述的溶解緩沖液1的組成為0. 01