專利名稱：含有西洋參莖葉總皂甙的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及西洋參莖葉總皂甙及其藥物組合物，特別是涉及以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物，其制備方法以及在預(yù)防和治療人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件中的應(yīng)用。
西洋參(Panax quinguefolium Linn.)和人參在植物分類學(xué)上同屬于五加科人參屬植物。雖然人參特別是人參根作為一種可藥用植物部分，在中國已有近千年的臨床應(yīng)用歷史，但將西洋參引入中國只有近200年的時間。歷史上，長期以來在中國境內(nèi)使用的西洋參幾乎全是由北美州原產(chǎn)地進(jìn)口的。自五十年代以來，中國開始引進(jìn)西洋參種子并在適于種植人參的東北長白山地區(qū)進(jìn)行種植西洋參的試驗(yàn)。到本世紀(jì)七十年代，中國長白山地地區(qū)實(shí)現(xiàn)了西洋參的大面積種植，從而為在中國開發(fā)利用這一天然藥用植物提供了必要的原料來源。大量的實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，中國境內(nèi)，特別是吉林省長白山地區(qū)引種的西洋參與原產(chǎn)于美國部分州和加拿大魁北克及蒙特利爾地區(qū)的西洋參實(shí)質(zhì)上沒有明顯差別。
在過去的二十年里，許多實(shí)驗(yàn)室都已對西洋參，特別是西洋參根的化學(xué)成分和其分離純化方法，以及可藥用部分特別是根中的有效成分的藥理學(xué)活性進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究。研究顯示，雖然西洋參作為一種藥用植物，其含有皂甙、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、多糖以及微量元素等許多化學(xué)活性成分，但迄今一直認(rèn)為皂甙是西洋參中最主要的活性成分。
八十年代初，Staba和Chen等人(Planta Medica，42406-411，1981)，以及田中等人先后從西洋參葉中分離出了人參皂甙Rd、Re和Rg，以及Rb3和F11等人參皂甙單體化合物。自九十年代以來，本發(fā)明人投入大量研究經(jīng)費(fèi)，全面系統(tǒng)地研究了西洋參莖葉這一過去被當(dāng)作植物廢棄部分中的有效活性成分，首次發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉中人參二醇組(b組)皂甙的含量顯著高于人參莖葉中的原人參二醇組皂甙。相反，人參莖葉中原人參三醇組(g組)皂甙則明顯高于西洋參莖葉中的原人參三醇組皂甙。
為了充分開發(fā)和利用西洋參地上部分這一重要的天然資源，本發(fā)明人基于以前對人參二醇組分離純化與組分分析和相類藥理學(xué)活成研究的長期經(jīng)驗(yàn)，對中國吉林省集安地區(qū)引種栽培的西洋參特別是其莖葉部分中活性成分的分離提取、理化性質(zhì)鑒定以及藥理學(xué)活性進(jìn)行了廣泛深入的實(shí)驗(yàn)室研究。我們進(jìn)一步改進(jìn)了西洋參莖葉總皂甙的提取方法，從所說的總皂甙中分離并純化和鑒定了至少八種人參皂甙單體化合物。特別是我們使用多種實(shí)驗(yàn)動物模型，對人參莖葉總皂甙的一般藥理學(xué)和藥效學(xué)進(jìn)行了廣泛的研究，從而為將西洋參莖葉總皂甙開發(fā)成一種可在臨床上應(yīng)用的藥物提供了必要的實(shí)驗(yàn)室工作基礎(chǔ)。
雖然以前曾發(fā)表過一些有關(guān)西洋參莖葉皂甙基礎(chǔ)研究的出版物，但迄今尚沒有關(guān)于將西洋參莖葉總皂甙開發(fā)成藥物的報導(dǎo)。我們在以前的大量實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，第一次成功地制備了完全符合臨床應(yīng)用要求的，以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的，用于治療和預(yù)防因心臟和腦動脈血管硬化和/或栓塞引起的心肌和腦組織缺血、缺氧及氧化脂質(zhì)升高等病理?xiàng)l件的藥物組合物，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分，并含有一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的藥物組合物中的基本活性成分西洋參莖葉總皂甙的含量至少為50％(w/w)。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的藥物組合物中的基本活性成分西洋參莖葉總皂甙至少由人參皂甙Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、F2、RT5及擬人參皂甙F11八種單體組成。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的藥物組合物中還含有一種或多種天然或化學(xué)合成的、與基本活性成分西洋參莖葉總皂甙有輔助或協(xié)同作用的其他活性成分。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物的方法，該方法包括(1)提供西洋參莖葉總皂甙；(2)將步驟(1)得到西洋參總皂甙與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的藥物組合物中還可另外加入一種或多種天然或化學(xué)合成的、與基本活性成分西洋參莖葉總皂甙有輔助或協(xié)同作用的其他活性成分。
本發(fā)明的再一個目的是提供以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物在預(yù)防和治療人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件包括心臟或腦血管供血不足、腦栓塞、動脈粥樣硬化及心肌梗塞。
本發(fā)明涉及以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物，其制備方法及在預(yù)防和治療心肌和腦組織缺血、缺氧相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
八十年代初，Staba和Chen等人(S.E.Chen et al.，planta Medica，42406-411，1981)，以及田中等人先后從西洋參葉中分離出了人參皂甙Rd、Re和Rg、以及Rb3、Rd和F11等人參皂甙單體化合物。為了充分開發(fā)和利用西洋參地上資源，本發(fā)明人同時對中國吉林省引種栽培的西洋參莖葉所含人參皂甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入的研究和分析，分離并鑒定了人參皂甙Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、F2，擬人參皂甙F11及RT5等八種人參皂甙單體。
在化學(xué)研究和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上，我們對西洋參莖葉總皂甙的特殊藥理學(xué)作用、效量關(guān)系、藥態(tài)動力學(xué)及使用安全性進(jìn)行了深入的實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)研究，從而為將西洋參莖葉總皂甙開發(fā)成可在臨床應(yīng)用的藥物組合物提供了必要的實(shí)驗(yàn)室工作基礎(chǔ)。此外，我們還進(jìn)一步改進(jìn)并簡化了西洋參莖葉總皂甙的分離純化手段，并使之更適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)要求。
本發(fā)明提供了以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的西洋參莖葉總皂甙占所說的藥物組合物的75％(w/w)以上，并且所說的西洋參莖葉總皂甙基本上是由人參皂甙Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、F2，以及擬人參皂甙F11和RT5組成的。
可按已知方法制備用作本發(fā)明藥物組合物基本活性成分的西洋參莖葉總皂甙。簡單地說，以干燥的西洋參莖葉為原料，經(jīng)反復(fù)水煎煮后，收集濾液并將濾液過大孔吸附樹脂(例如D4042)柱，用乙醇洗脫后即得到西洋參莖葉總皂甙。
將所得總皂甙溶解于水中后，用有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯萃取。然后用堿溶液例如1％NaOH溶液處理乙酸乙酯層，減壓回收溶劑后得到低極性皂甙。以常規(guī)薄層層析法分離所說的低極性皂甙，經(jīng)用不同的洗脫劑洗脫后得到3種單性皂甙皂甙VI、VII、VIII。另外，用飽和正丁醇萃取乙酸乙酯提取后形成的水層，減壓蒸餾除去溶劑后得到高極性皂甙。同樣以薄層層析法分離所說的高極性皂甙，以不同的展層溶劑洗脫后得到5種單體皂甙皂甙I、II、III、IV和V。
經(jīng)紅外光譜(IR)分析，以及薄層層析和核磁共振光譜(NMR)分析，上述8種皂甙單體I-VIII分別被鑒定為人參皂甙Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、F2，擬人參皂甙F11和人參皂甙RT5。我們發(fā)現(xiàn)，西洋參莖葉中人參皂甙Rb3含量相對較高，特別是我們還首次在西洋參莖葉中分離得到了人參皂甙RT5。
如前所述，將預(yù)處理的西洋參莖葉加水煎煮三次并過濾收集濾液后，將所得水提取物用大孔樹脂(例如D 4020樹脂)吸附，用水洗至無色后再用95-98％乙醇洗脫。然后收集洗脫物并于減壓下濃縮成浸膏狀。用95-98％乙醇重新溶解后，過濾除去沉淀物并回收濾液。減壓回收乙醇后得到所需的西洋參莖葉總皂甙。化學(xué)分析表明，所得終產(chǎn)物中西洋參莖葉總皂甙含量大約為75％。
由此可見，以西洋參莖葉這一長期以來一直被視為廢棄物的西洋參植物地上部分為原料，用相對比較簡單的提取工藝，可以按制藥工業(yè)上已知的技術(shù)很容易地生產(chǎn)出至少含有50％(w/w)西洋參莖葉總皂甙的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中除含有至少75％(w/w)的西洋參總皂甙外，還可含有在西洋參莖葉皂甙分離純化過程中殘留的西洋參植物本身的少量蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、多糖，以及微量元素和揮發(fā)油。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，這些雜質(zhì)成分基本上不會給本發(fā)明藥物組合物中西洋參莖葉總皂甙的藥理學(xué)活性帶來不利影響，相反，在某些情況下甚至可以與總皂甙發(fā)揮協(xié)同或輔助作用，并且其中還可能存在新的，目前尚不清楚的相關(guān)活性成分。
另外，應(yīng)特別指出的是，可根據(jù)需要在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種天然或合成的其他與西洋參莖葉總皂甙具有協(xié)同或輔助作用的活性成分。這些可能被加入的天然或合成的輔助活性成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和可以想到的。這些天然或合成的輔助活性成分包括但不止限于人參二醇組皂甙和吡啶并嘧啶酮類化合物。
可以將西洋參莖葉總皂甙與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑按適當(dāng)比例混合，制成適于臨床上使用的不同劑型的藥物組合物。例如可將所說的組合物配制成可供靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、腦脊髓腔內(nèi)和眼內(nèi)注射給藥的注射液，或者制成適于口服給藥的片劑、粉末劑、丸劑、膠囊劑和懸浮劑，以及適于局部給藥的噴霧劑、霜劑、軟膏、酏劑和栓劑。
為了制備適于胃腸道外途徑藥的溶液劑，例如可使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液或葡萄糖溶液，或者低濃度(例如1-100mM)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為載體或賦形劑?？梢栽谶@些胃腸道外給藥的制劑中加入一種或多種其他輔助成分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉或尼泊金甲酯作為防腐劑，使用二甲基亞砜作為吸收促進(jìn)劑。
為了制備適于口服給藥的片劑、粉末劑、懸浮劑或膠囊劑，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明膠、脂質(zhì)、微晶纖維素、滑石粉等作為載體或賦形劑。在這些適于口服給藥的制劑中，還可含有其他適當(dāng)?shù)奶砑觿?，例如增溶劑、崩解劑、潤滑劑、吸收促進(jìn)劑、分散劑、表面活性劑、香味劑或著色劑等。
最好將本發(fā)明的藥物組合物制成各種適于口服給藥的劑型，例如片劑、粉末劑、膠囊劑，或口服液或乳劑。這些口服制劑的單位劑量一般包含50-200mg西洋參莖葉總皂甙。例如用于治療缺血性心腦疾病時，通常60公斤體重成年人的用藥量為每天100-500mg，分三次給藥。本發(fā)明藥物組合物的另一個優(yōu)選給藥途徑是靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射適于這些給藥途徑的注射液。例如對于某些急性心肌梗塞或腦栓塞恢復(fù)期的病人，或心絞痛頻繁發(fā)作的病人，可將本發(fā)明藥物組合物的注射液制劑加在等滲葡萄糖溶液或等滲氯化鈉溶液中，持續(xù)地滴注給藥。靜脈內(nèi)給藥的劑量一般為每天50-300mg。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所說的含有西洋參莖葉總皂甙的藥物組合物在治療或預(yù)防全身或局部組織，特別是心肌組織缺血、缺氧及相關(guān)病理?xiàng)l件中的應(yīng)用。
大量的一般藥理學(xué)和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的藥物組合物對動物(小鼠、大鼠和犬)的活動和行為沒有明顯影響。靜脈內(nèi)注射西洋參莖葉總皂甙(25mg/kg)后，動物的血壓、心率和心電圖均基本正常，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)上有意義的變化。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，本發(fā)明的藥物組合物對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞和異丙基腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌缺血具有顯著的保護(hù)作用。例如，給實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞家免靜脈內(nèi)注射本發(fā)明的藥物組合物(25mg/kg)，可明顯地減輕胸前多導(dǎo)聯(lián)心電圖的缺血性改變(p＜0.05)。對異丙基腎上腺素誘發(fā)心肌缺血的大鼠經(jīng)胃內(nèi)灌注本發(fā)明的藥物組合物(100mg/kg)后，可見動物的血清磷酸肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性降低，并因而推測本發(fā)明藥物組合物對心肌損傷的保護(hù)作用可能與其降低缺血心肌組織中的游離脂肪酸及過氧化脂質(zhì)有關(guān)。同時，我們還觀察到本發(fā)明的藥物組合物可顯著地延長異丙基腎上腺素造成的常壓下缺氧小鼠的存活時間，表明該組合物可增加心肌耐受缺氧的能力。
另外，我們還觀察了本發(fā)明的藥物組合物對實(shí)驗(yàn)動物(犬)的冠狀動脈循環(huán)和心肌氧代謝的影響。結(jié)果表明，本發(fā)明的藥物組合物可明顯地增加動物心肌的血流量并降低冠狀動脈阻力。雖然未見該組合物對心肌的氧利用率有明顯影響，但發(fā)現(xiàn)其可顯著地降低心肌耗氧量和心肌耗氧指數(shù)。
一般說來，冠狀血管除通過毛細(xì)血管為心肌提供營養(yǎng)血流外，還可通過動一靜脈吻合支將血流輸入靜脈血管，兩者共同構(gòu)成冠狀血管的總血流量。因此，測定心肌營養(yǎng)性血流量比檢測冠狀血管的總血流量更為客觀和有意義。另外，已知放射性同位素86Rb對心肌組織具有很強(qiáng)的親和力。所以，一般說來，組織對86Rb的攝取能力足以反映組織血流量的大小(兩者成正比例關(guān)系)。在使用86Rb進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，我們的結(jié)果顯示，不同劑量(50，100和200mg/kg)的本發(fā)明藥物組合物可明顯地增加動物的86Rb攝取率(數(shù)據(jù)未示出)，表明該組合物可不同程度地增加心肌營養(yǎng)性血流量。
再者，在檢測用藥后心臟功能和血液動力學(xué)的動物實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物對麻醉下開胸動物的心臟功能和血流動力學(xué)主要表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的藥物組合物除了具有明顯的持續(xù)性的降壓作用外，還具有降低開胸犬左心室內(nèi)壓和降低左心室內(nèi)壓最大升高速率的作用。然而，本發(fā)明的藥物組合物對反映心臟泵功能的心輸出量和心搏指數(shù)則沒有明顯影響，提示在所使用的劑量(25和50mg/kg)下，組合物對心肌收縮性沒有明顯的抑制作用。另外，按照相似方法對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞犬進(jìn)行的心功能和血液動力學(xué)觀察顯示，本發(fā)明的藥物組合物可有效地延緩心肌梗塞后循環(huán)功能的衰退速度，并可有效地維持梗塞后心肌的舒縮功能。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1西洋參莖葉總皂甙的制備在不銹鋼容量內(nèi)將預(yù)先清洗并干燥的西洋參(中國吉林省集安市第一參場生產(chǎn))莖葉1kg加適量的水反復(fù)加熱煮沸(三次，每次40分鐘)。收集并合并所得的水浸提物，并用G3漏斗過濾。將濾液加于預(yù)先用酸和堿處理的大孔徑吸附樹脂D4020(中國天津南開大學(xué)化學(xué)試劑二廠生產(chǎn))柱上，用去離子水洗柱直到洗出液無顏色后用95％乙醇(約500ml)洗脫。收集流出的洗脫物并于減壓下回流濃縮之。將所得濃縮物置于空真干燥器內(nèi)MgSO4上方干燥后得到淡黃色粉末狀總皂甙68g(收率6.8％)。實(shí)施例2西洋參莖葉總皂甙的組份分析將按實(shí)施例1所述方法提取的西洋參莖葉總皂甙50.0g溶解于1000ml蒸餾水中。用乙酸乙酯反復(fù)萃取5次(每次100ml)。收集并合并所得到的乙酸乙酯提取液，然后加入1％(w/v)氫氧化鈉水溶液，反復(fù)攪拌混合10分鐘。減壓下回流該混合物以除去有機(jī)溶劑(乙酸乙酯)，得到低極性西洋參皂甙(組份I)。
按已知方法(邵春杰和徐景達(dá)，中草藥13(2)19，1982)使用吸附劑硅膠G(中國青島海洋化工廠生產(chǎn))制備硅膠薄層(厚0.25mm)層析板，并將上述低極性皂甙組份I(10μl)點(diǎn)樣于該板上，同時用人參皂甙Re、Rb3和擬人參皂甙F11標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/ml甲醇溶液)作為對照。用溶劑A氯仿/甲醇/乙酸乙酯/水(2∶2∶4∶1，v/v，下層)洗脫后得到組份Ia、Ib和Ic。
用同樣硅膠板層析分離組份Ia，并用上述溶劑A洗脫得到皂甙IV和V(0.06％)。用同樣硅膠板層析分離組分Ib和Ic，并用溶劑B甲苯/四氯化碳/二氯乙烷/甲醇(2∶48∶25∶25，v/v)洗脫，得到皂甙VI(0.5％)、VII(0.05％)、VIII(0.05％)。
另外，加水飽和上述用乙酸乙酯萃取后得到的水層，并用正丁醇萃取，減壓下回流除去正丁醇后得到高極性西洋參莖葉皂甙約30g。按上述方法對此高極性皂甙進(jìn)行硅膠薄層層析，并依次用溶劑C氯仿/甲醇/水(65∶35∶10，下層)、溶劑D正丁醇/乙酸乙酯/水(4∶1∶2，上層)，和上述溶劑A展層洗脫，分別得到西洋參皂甙I(0.09％)、II(0.4％)、III(0.1％)、IV(0.1％)、V(0.08％)。
對西洋參莖葉總皂甙各組份的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下皂甙I呈白色粉末狀。[α]D20+12.3°(C＝0.92，MeoH)。IR(HBr)cm-13400(OH)；1620(C＝C)。該組份在稀鹽酸(0.1N)存在下加熱水解后，所得甙元被鑒定為人參二醇組皂甙，其糖部被鑒定為葡萄糖和阿拉伯糖。薄層層析、1H-NRR和13C-NMR光譜分析結(jié)果證實(shí)，西洋參皂甙I即為人參皂甙Rb2。
皂甙II呈白色粉末狀。[α]D20+19.4°(C＝100，MeOH)。IR(HBr)cm-13400(OH)，1620(C＝O)。該組份在加熱下用稀鹽酸(0.1N)水解后，所得甙元被鑒定為人參二醇化合物，糖部分為葡萄糖和木糖。硅膠薄層層析、1H-NMR和13C-NMR光譜分析證明組份為人參皂甙Rb3。
皂甙III白色粉末。[α]D20+19.2°(C＝0.4MeOH)。IR(HBr)cm-13400(OH)，1630(C＝C)。在稀硫酸存在下加熱分解后，甙元被鑒定為人參三醇，糖部分被證實(shí)為葡萄糖。薄層層析、1H-NMR和13C-NMR分析結(jié)果表明該組份與人參皂甙Rd完全一致。
皂甙IV為白色粉末。[α]D20+1.5°(C＝0.52，MeOH)。IR(HBr)cm-13400(OH)，1630(C＝C)。分離產(chǎn)物經(jīng)稀硫酸(0.1N)加熱水解，證明甙元為人參二醇組分，糖部分為葡萄糖和鼠李糖。該組分的硅膠薄層層析，以及1H-NMR和13C-NMR光譜曲線與人參皂甙Re標(biāo)準(zhǔn)對照品完全相同。
皂甙V為白色粉末。[α]D20-1.5°(C＝0.25，MeOH)。IR(HBr)cm-13400(OH)，1640(C＝C)。加熱條件下經(jīng)稀硫酸水解后，證明甙元部分為人參三醇，糖部分為葡萄糖。經(jīng)薄層層析，1H-NMR和13C-NMR光譜分析證明該組份為人參皂甙Rg1。
皂甙VI為白色粉末。[α]D20+20.0°(C＝0.5，MeOH)。加熱下經(jīng)稀硫酸水解后，皂甙元部分被鑒定為人參二醇，糖部分被鑒定為葡萄糖。薄層層析，1H-NMR和13C-NMR光譜分析數(shù)據(jù)恰好與人參皂甙F2相對照，故證明其為人參皂甙F2。
皂甙VII白色粉末。[α]D20-13.0°(C＝1.0，MeOH)。于稀硫酸存在下加熱水解后，所得糖部被鑒定的葡萄糖和鼠李糖。經(jīng)薄層層析后，1H-NMR和13C-NMR光譜分析證明該組份為擬人參皂甙F11(Pseudoginsenoside F11)。
皂甙VIII無色針狀結(jié)晶體(MeOH-H2O)，m.p.247-249℃。[α]D20+13.5°(C＝0.5，MeOH)。于稀硫酸存在下加熱水解后，所得糖部分被鑒定為葡萄糖。經(jīng)薄層層析后，1H-NMR和13C-NMR光譜分析數(shù)據(jù)證明該組份為有人參皂甙RT5。實(shí)施例3西洋參莖葉總皂甙對動物實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞的保護(hù)作用本實(shí)施例舉例說明作為本發(fā)明以西洋參莖葉總皂甙為基本活性成分的藥物組合物(以下簡稱西洋參莖葉總皂甙組合物)對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞家兔心電圖、血清和心肌過氧化脂質(zhì)(LPO)水平及心肌梗塞面積的影響。
將體重為2.0至2.5kg的雄性和雌性白色大耳家兔32只隨機(jī)分成四組大劑量給藥組(西洋參莖葉總皂甙組合物75ml/kg)、小劑量給藥組(西洋參莖葉總皂甙組合物25mg/kg)、陽性對照組(β受體阻滯劑普萘洛爾(propranolol)1mg/kg)和陰性對照(生理鹽水2mg/kg)。每組各8只動物。
動物經(jīng)靜脈內(nèi)注射戊巴比妥納(30mg/kg)麻醉后，按方云祥等人(湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報5(3)229，1980)所述的方法高位雙重結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)，造成急性心肌梗塞(AMI)動物模型。造成AMI后，各組動物立即經(jīng)耳靜脈注射大劑量或小劑量實(shí)驗(yàn)藥物(西洋參莖葉總皂甙組合物，集安制藥廠生產(chǎn))，或普萘洛爾(北京制藥廠生產(chǎn))或生理鹽水。
背位固定動物，分別于造成心肌梗塞前，造成心肌梗塞后即刻及2、4、24小時，以胸前多導(dǎo)聯(lián)檢測并記錄動物的心電圖(ECG)變化。依據(jù)檢測結(jié)果計算24小時內(nèi)ST段≥2mm導(dǎo)聯(lián)數(shù)(NST)、ST段偏移總電壓(mV)數(shù)(∑ST)、病理性Q波導(dǎo)聯(lián)數(shù)(NQ)及病理性Q波總電壓(mV)數(shù)(∑Q)。
四組動物分別于造成心肌梗塞前和梗塞后2、4及24小時經(jīng)耳緣靜脈采血(1ml)，以3.000rpm離心10分鐘后收集動物血清，按周翔等人(白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，11(4)358，1985)所述的方法測定血清LPO水平。梗塞后24小時處死動物，分離心臟并分別從梗塞區(qū)和非梗塞區(qū)切取心肌組織約100mg，向組織塊內(nèi)加入適量的0.85％NaCl溶液并制成10％組織勻漿，然后按照大石誠子等人(最新醫(yī)學(xué)，33(4)660，1978)的方法測定心肌組織LPO含量。
為了研究西洋參莖葉總皂甙組合物對動物實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞面積的影響，于造成心肌梗塞模型后24小時再次按前述方法麻醉動物，手術(shù)打開胸腔并分離心臟。用生理鹽水清洗心腔內(nèi)血液，然后沿著心臟長軸自上而下橫向依次切出厚度約4-5mm的組織薄片，并對這些薄片進(jìn)行N-BT染色(參見Brody，C.et al.，Arch.Pathol.，84312，1967)。染色后，對肉眼可見的壞死心肌組織進(jìn)行稱重并計算壞死的心肌占全心室組織濕重的百分比。
上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別如下列表1至表3中所示。表中所示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以每組八只動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。表1西洋參莖葉總皂甙組合物對AMI家兔梗塞后24小時胸前多導(dǎo)聯(lián)ECG的影響
>*統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果顯示P＜0.05。
表1顯示了動物心肌梗塞后24小時胸前多導(dǎo)聯(lián)心電圖相關(guān)檢測指標(biāo)的檢測結(jié)果。作為監(jiān)測心肌梗塞發(fā)生和其嚴(yán)重程度，以及評價梗塞面積大小的粗略定量指標(biāo)，胸前多導(dǎo)聯(lián)ECG中的NST可大致反映心肌梗塞面積，∑ST大致反映心肌梗塞程度，∑Q大致反映心肌壞死程度，NQ則大致反映左心室收縮能力降低程度。從表1中所示的數(shù)據(jù)可以看出，心肌梗塞后靜脈內(nèi)投用大劑量(75mg/ml)西洋參莖葉總皂甙組合物，可顯著地減小胸前多導(dǎo)聯(lián)ECG缺血性改變(P＜0.05)。大體心肌組織標(biāo)本的N-BT染色結(jié)果表明，投用西洋參莖葉總皂甙組合物可明顯地減小心肌梗塞面積(數(shù)據(jù)未示出)，這一直觀結(jié)果與ECG檢測結(jié)果完全相符。
表2西洋參莖葉總皂甙組合物對家兔AMI后24小時血清和心肌組織LPO含量的影響
與陰性對照組相比較，P＜0.05。
已知在組織缺氧的情況下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致生物膜過氧化，進(jìn)而發(fā)生一系列細(xì)胞功能紊亂(例如參見Kuller JE.et al.，Circulation 571，1978)。表2所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，空白對照組動物心肌梗塞后24小時血清LPO水平明顯高于心肌梗塞前，另外，梗塞區(qū)域心肌組織中的LPO水平明顯高于非梗塞區(qū)域。然而，投用大劑量西洋參莖葉總皂甙組合物可使心肌梗塞后血清LPO水平和心肌梗塞區(qū)心肌組織中的LPO水平均明顯降低(P＜0.05)。這些結(jié)果從一個方面進(jìn)一步闡明了西洋參莖葉總皂甙組合物的抗心肌梗塞作用原理。實(shí)施例4西洋參莖葉總皂甙組合物對抗異丙腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌缺血的作用本實(shí)施例舉例說明在皮下注射異丙腎上腺素造成心肌缺血的情況下，預(yù)先經(jīng)口服投用不同劑量的西洋參莖葉總皂甙組合物對動物心肌缺血后血清磷酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)總活性水平的影響。
將50只體重198±14g的健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成5組。每組10只動物。除空白對照組外，其他各組動物經(jīng)口灌服生理鹽水(0.2ml/mg)(病變對照組)、普荼洛爾(30mg/kg)(陽性藥物對照組)、西洋參莖葉總皂甙組合物(50mg/kg或100mg/kg)(總皂甙I組和II組)。連續(xù)給藥七天后，皮下注射異丙腎上腺素(2mg/kg)造成動物心肌缺血。24小時后麻醉下采集動物血液并分離血清。使用COBAS FARA型自動生化分析儀測定心清CPK和LDH活性水平，并按照一次提取比色法(參見上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所，臨床生化檢驗(yàn)(上冊)，第168-170頁，上?？萍汲霭嫔?，1979)檢測血清游離脂肪酸(FFA)含量。然后處死動物，分離心臟組織并制備10％心肌組織勻漿，并使用TBA顯色法(Ohkama H，et al.，Anal.Biochem.95351，1979)測定心肌組織LPO水平。
結(jié)果下列表3中所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以每組10只動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。表3西洋參莖葉總皂甙組合物對大鼠實(shí)驗(yàn)心肌缺血后心肌梗傷相關(guān)酶活性和代謝產(chǎn)物含量的影響
*t檢驗(yàn)結(jié)果表明與空白對照組差異性顯著，P＜0.05；**t檢驗(yàn)結(jié)果表明與缺血病變對照組差異性十分顯著，P＜0.01。
當(dāng)心肌缺血缺氧時，胞漿膜通透性增大，致使胞內(nèi)酶釋入血流并因而使血清CPK和LDH總活性增加。從表3中所示的結(jié)果可以看出，皮下注射異丙腎上腺導(dǎo)致心肌缺血性損傷的缺血對照組動物的血清CPK和LDH總活性顯著高于空白對照組(P＜0.05)。經(jīng)口投用β受體阻滯劑普萘洛爾或西洋參莖葉總皂甙組合物后可使血清CPK和LDH總活性的增加受到顯著抑制，表明西洋參莖葉總皂甙組合物與已知的抗心肌損傷藥物普荼洛爾具有幾乎完全相同的保護(hù)功能。另外，從表3所示的結(jié)果還可以看出，西洋參莖葉總皂甙組合物同樣可以抑制作為心肌缺血性損傷指征的心肌LPO水平及FFA水平的增加。實(shí)施例5西洋參莖葉總皂甙組合物對動物心肌血流量和氧代謝的影響本實(shí)施例舉例說明以西洋參莖葉總皂甙作為基本活性成分的藥物組合物(以下簡稱西洋參莖葉總皂甙組合物)對麻醉下開胸動物的心肌血流量、冠狀動脈阻力及心肌氧利用率和心肌耗氧指數(shù)的影響，借以評價所說的藥物組合物對動物心肌血流水平和氧代謝的促進(jìn)效果。
將10只體重11.9±1.6kg的雜種犬隨機(jī)分成兩組。靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉動物后，氣管插管進(jìn)行人工呼吸。于左第4肋間切開動物胸腔并分離冠狀動脈左旋支，然后將電磁流量計(MF-2F型)探頭置于左旋支根部。經(jīng)股動脈插管后，使用接有波幅放大裝置的血流壓力傳感器記錄股動脈血壓，同時借助內(nèi)植電極記錄動物的標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。手術(shù)后30分鐘使用八道生理記錄儀記錄上述各參數(shù)作為給藥前數(shù)據(jù)。按每公斤動物體重25mg或50mg劑量經(jīng)股靜脈插管注射投用西洋參莖葉總皂甙組合物水溶液(1ml/kg)，給藥后20、30和60分鐘再次記錄上述數(shù)據(jù)。另外于給藥前和給藥后30、60分鐘自冠狀靜脈窒和股動脈同時采血，并用CORNING 178型血?dú)夥治鰞x監(jiān)測血氧濃度。按下列公式計算各參數(shù)
心肌耗氧量(ml/100g心肌/分)＝(股動脈血氧冠狀靜脈窒血氧冠脈血流量)
心肌耗氧指數(shù)＝心率×血壓×10-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下列表4所示。所有數(shù)據(jù)均以每組5只動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以t檢驗(yàn)法比較給藥前后各對應(yīng)參數(shù)間的差異顯著性(p值)。
表4西洋參莖葉總皂甙組合物對動物(犬)心肌血流量及心肌氧代謝能力的影響
*與給藥前相比較p＜0.05；**與給藥前相比較p＜0.01。
從表4所示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，靜脈注射西洋參莖葉總皂甙組合物50mg/kg體重，給藥后5-60分鐘內(nèi)心肌血流量和冠血管阻力比給藥前明顯增加(p＜0.05或0.01)。靜脈注射西洋參莖葉總皂甙組合物50mg/kg體重，給藥后60分鐘可見心肌耗氧量比給藥前明顯降低(p＜0.05)。雖然給藥后未見藥物對心肌氧利用率有明顯影響，但給藥后30和60分鐘時可見心肌耗氧指數(shù)較給藥前明顯降低(p＜0.05)。投用相對較小劑量(25mg/kg體重)的西洋參莖葉總皂甙組合物時，對心肌血流量和上述心肌氧代謝參數(shù)未見有明顯的影響。
因此，本研究的結(jié)論是，以靜脈內(nèi)途徑投用較大劑量(50mg/kg體重)的西洋參莖葉總皂甙組合物可顯著地增加動物的心肌血流量，并降低冠狀動脈循環(huán)阻力。兩者作用時程基本一致。另外，盡管本發(fā)明的西洋參莖葉總皂甙組合物對心肌氧利用率無明顯影響，但其可顯著地降低心肌耗量率和耗氧指數(shù)(表4)。
實(shí)施例6西洋參莖葉總皂甙組合物對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞動物心臟功能和血流動力學(xué)的影響本實(shí)施例舉例說明以西洋參莖葉總皂甙作為基本活性成分的藥物組合物(以下簡稱西洋參莖葉總皂甙)對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞動物心臟指數(shù)、心搏指數(shù)和左心室作功指數(shù)等的影響，借以評價所說的藥物組合物對動物心臟功能的增強(qiáng)活性。
將18只體重大約12至16kg的雜種犬隨機(jī)分成三組鹽水對照組、低劑量藥物組(西洋參莖葉總皂甙組合物25mg/kg)、高劑量藥物組(西洋參莖葉總皂甙組合物50mg/kg)。每組6只動物。靜脈內(nèi)注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉動物后，氣管插管進(jìn)行正壓人工呼吸(12-16次/分)。手術(shù)開胸后結(jié)扎心臟冠狀動脈左回旋支的鈍緣支和左前降支的第一與第二分支，以及與純緣支相連的各個側(cè)支和吻合支。為了盡可能地保證動物間心肌梗塞范圍的一致性，規(guī)定預(yù)缺血區(qū)應(yīng)相當(dāng)于左心室前壁的1/2面積，并依此確定結(jié)扎冠狀血管的部位和數(shù)目。分兩次結(jié)扎血管第一次結(jié)扎(使用止血鉗)5分鐘后，放開5分鐘，然后給各組動物分別靜脈內(nèi)投用生理鹽水或不同劑量的西洋參莖葉總皂甙組合物；給藥后5分鐘進(jìn)行第二次結(jié)扎。于給藥前和給藥后5、20、40和90分鐘檢測并記錄下列參數(shù)以肢體II導(dǎo)聯(lián)記錄心電圖(ECG)和心率(HR)，經(jīng)頸總動脈插管用壓力換能器測定動脈血壓(mAP)(Kpa)，用電磁流量計測定的心輸出量(CO)(ml/分)，用壓力換能器記錄的左心室內(nèi)壓(LVP)(Kpa)，依據(jù)LVP曲線測量左心室內(nèi)壓峰值(LVSP)(Kpa)以及左心室終末縮張壓(LVEDP)(Kpa)。將LVP電信號輸入微分器描記dp/dt曲線，并從dp/dt曲線測得左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dt max)(Kpa/秒)。按下列公式計算各相關(guān)參數(shù)
檢測結(jié)果如下列表5所示。所有數(shù)據(jù)均以每組6只動物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以t檢驗(yàn)法比較實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞動物中的生理鹽水處理組(對照組)和不同劑量(25mg/kg和50mg/kg)西洋參莖葉總皂甙組合物處理組(實(shí)驗(yàn)組)間的差異顯著性。
表5西洋參莖葉總皂甙組合物對實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞動物(犬)的心臟功能和血流動力學(xué)的影響
從上列表5中所示的數(shù)據(jù)可以看出，在經(jīng)結(jié)扎冠狀動脈造成動物實(shí)驗(yàn)性心肌梗塞模型后的40小時觀察時間內(nèi)，只注射生量鹽水的對照組動物動脈血壓(mAP)下降達(dá)22％以上，而投用低或高劑量西洋參莖葉總皂甙組合物的實(shí)驗(yàn)組動物則分別下降3.8％和14.2％。另一方面，在造成心肌梗塞后的90分鐘時間內(nèi)，與只投用生理鹽水的對照組相比，投用西洋參莖葉總皂甙組合物的動物L(fēng)VAP、LVEDP、dp/dt max、以及由這些和其他測定值計算的心臟指數(shù)(CI)、心搏指數(shù)(SI)和左心室作功指數(shù)(LVWI)等心功能和心臟血流動力學(xué)參數(shù)均有顯著地改善。因此可以認(rèn)為，西洋參莖葉總皂甙組合物能夠顯著地減輕或延緩心肌梗塞導(dǎo)致的循環(huán)功能衰減，并可改善心肌舒縮能力和心室作功能力，從而保護(hù)心臟，延緩心功能衰竭的發(fā)生或發(fā)展。從藥物效量關(guān)系角度看，高劑量組與低劑量組之間似乎沒有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種以西洋參莖葉總皂甙組合物為基本活性成分，并含有一種或多種醫(yī)學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的作為基本活性成分的西洋參莖葉總皂甙組合物含量至少為50％(w/w)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所說的作為基本活性成分的西洋參莖葉總皂甙組合物至少由人參皂甙Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、F2、RT5及擬人參皂甙F11八種單體組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中還可含有一種或多種天然或化學(xué)合成的，與基本活性成分西洋參莖葉總皂甙組合物有輔助或協(xié)同作用的其他活性成分。
5.生產(chǎn)以西洋參莖葉總皂甙組合物為基本活性成分的藥物組合物的方法，該方法包括1)提供權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所限定的西洋參莖葉總皂甙；2)將步驟1)得到的西洋參莖葉總皂甙組合物與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說的藥物組合物還可加有一種或多種天然合成的，與基本活性成分西洋參莖葉總皂甙組合物有輔助或協(xié)同作用的其他活性成分。
7.根據(jù)權(quán)處要求1至4中任何一項(xiàng)的藥物組合物在治療和預(yù)防人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所說的人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件包括心臟或腦血管供血不足、腦栓塞、動脈粥樣硬化和心肌梗塞。
全文摘要
本發(fā)明涉及西洋參莖葉總皂甙組合物及其藥物組合物,特別是涉及以西洋參莖葉總皂甙組合物為基本活性成分的藥物組合物,其制備方法以及在預(yù)防和治療人或動物心肌或腦組織缺血、缺氧相關(guān)病理?xiàng)l件中的應(yīng)用。
文檔編號A61P9/10GK1231198SQ9812614
公開日1999年10月13日 申請日期1998年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月25日
發(fā)明者徐景達(dá), 劉建明, 呂忠智, 馬興元, 尹立簽, 陳燕萍 申請人:吉林省集安制藥有限公司