專利名稱：哮喘和氣管疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療慢性和急性氣管炎癥包括哮喘病的方法。本發(fā)明還涉及用于上述治療中的甾體或甾體類(lèi)似物，以及包含這些化合物作為活性成分的藥物組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，活性成分抑制氣管壁中的炎癥以及平滑肌細(xì)胞的增殖。它還可具有至少一種選自抗血管生成、抗氧化和破壞微管形成中的其他活性。發(fā)明背景在治療哮喘中目前有兩類(lèi)截然不同的藥物。使用支氣管舒張劑可提供對(duì)癥緩解，所述支氣管舒張劑包括β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑如舒喘寧(salbutamol)和沙美特羅(salmeterol)。其他具有支氣管舒張劑性質(zhì)的藥物包括毒覃堿受體拮抗劑、異丙托溴銨、和磷酸二酯酶抑制劑如茶堿(theophylline)。
第二類(lèi)藥物是預(yù)防性的，包括糖皮質(zhì)激素如氯地米松二丙酸鹽。也可使用色甘酸二鈉和萘多羅米(nedocromil)鈉，但是這些藥物比糖皮質(zhì)激素的效用低。
然而，以上藥物中沒(méi)有一個(gè)可以完全反轉(zhuǎn)氣管的高應(yīng)答性或者防止所有病人的哮喘災(zāi)害性致命和致死期。這些病癥普遍存在而且有時(shí)是致死原因的事實(shí)說(shuō)明以上藥物的作用并不是最佳的。
現(xiàn)在認(rèn)為哮喘是一種慢性氣管炎癥疾病，其特征是嗜曙紅性支氣管炎(Frigas等人，1991)。與其他慢性炎癥疾病一樣，哮喘中的炎癥也誘發(fā)組織改變，這已被記載于氣管的尸體解剖研究(Dunnill等人，1969)中以及活供體的支氣管活體解剖(Brewster等人，1990；Bai和Pare,1995)中。該組織改變包括上皮脫落；嗜曙紅細(xì)胞明顯過(guò)濾至粘膜中；肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活化；粘液腺的增大；外傷型膠原立即沉降至上皮的真基膜以下并存在與粘膜中；以及肌成纖細(xì)胞(myofibroblast)數(shù)量的增加。另外，在哮喘氣管中血管的體積和數(shù)量也增加，這表明該組織改變中還伴隨著血管生成(Kuwano等人，1993)。氣管壁的總體積隨著氣管平滑肌體積的增加也增加(Kuwano等人，1993)，這是肥大性和增生性應(yīng)答的結(jié)果(Ebina等人，1993)。
氣管高應(yīng)答性(AHR)是哮喘患者對(duì)各種刺激產(chǎn)生過(guò)度的支氣管縮肌應(yīng)答。氣管壁增厚是AHR發(fā)展的中心這一概念在最近10年已被接受。氣管增厚已用放大平滑肌縮短之后果的數(shù)學(xué)模型研究來(lái)表現(xiàn)，即計(jì)算一定量的平滑肌縮短以與健康受試者相比在哮喘病患者中產(chǎn)生更大的氣管阻力(例如40％縮短在健康受試者中產(chǎn)生15倍的增加，但在哮喘患者中產(chǎn)生290倍的增加)(James等人，1989)。氣管壁面積增加50-250％，在更大的氣管中可觀察到更多的增加(James等人，1989)。肌肉體積增加2-3倍，而且其增加的幅度與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)(Kuwano等人，1993)。變化的本質(zhì)尚未進(jìn)行廣泛的研究，但其包括增生和肥大(Ebina等人，1993)。過(guò)敏性哮喘患者中延長(zhǎng)對(duì)過(guò)敏原的回避，證明氣管中的應(yīng)答性降低至在健康受試者中所觀察到的水平，而且伴隨著癥狀的緩解(Platts-Mills等人，1987)。以上這些研究與哮喘氣管中結(jié)構(gòu)的改變也是可逆的這一概念是相一致的。
哮喘氣管中此等長(zhǎng)期變化為治療性介入提供了新目標(biāo)(Stewart等人，1993)。因此，主要的興趣集中在鑒別出該氣管壁組織變化應(yīng)答的機(jī)理以及現(xiàn)存的抗哮喘藥物對(duì)這些過(guò)程的影響。許多因子已被確認(rèn)為各種來(lái)源包括人的經(jīng)培養(yǎng)的平滑肌的有絲分裂因子(參考Stewart等人，1995a)。正如所希望的，屬于生長(zhǎng)因子族的刺激，包括基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGFBB)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，是最有效的增殖劑(Hirst等人，1992；Stewart等人，1995a)。凝血酶也是有效的生長(zhǎng)因子(Tomlinson等人，1994)，其中如內(nèi)皮素-1和血栓烷A2模擬物、U46619的支氣管收縮劑，其活性較弱，而且一些其他收縮劑如組胺和神經(jīng)激肽是完全無(wú)活性的(Stewart等人，1995a)。
在經(jīng)培養(yǎng)的人氣管平滑肌中，連續(xù)地暴露在β-腎上腺素受體激動(dòng)劑可降低對(duì)寬范圍之有絲分裂因子的增殖性應(yīng)答，所述有絲分裂因子包括凝血酶、EGF和血栓烷A2類(lèi)似物、U46619(Tomlinson等人，1994；1995)。而且，地塞米松和其他抗炎甾體藥物也具有抗經(jīng)培養(yǎng)之氣管平滑肌增殖的作用(Stewart等人，1995b)，但是抑制作用的幅度取決于首先刺激增殖作用的有絲分裂因子。還應(yīng)注意的是，通過(guò)吸入抗炎甾體藥物進(jìn)行的長(zhǎng)期治療僅中等程度地降低AHR(Sotomayor等人，1984；Lungren等人，1988)，其中據(jù)報(bào)道β2-激動(dòng)劑既沒(méi)有作用也不能增加AHR(Wahedna等人，1993)。因此，兩類(lèi)最經(jīng)常使用而且最有效的治療哮喘的藥物對(duì)AHR具有亞最佳作用，而且因此不可能有效地調(diào)節(jié)與氣管組織改變有關(guān)的結(jié)構(gòu)變化，所述氣管組織改變對(duì)病癥的前進(jìn)和發(fā)展有作用。
我們已研究了使組織改變過(guò)程停止或者調(diào)節(jié)該過(guò)程的潛在方式，并已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)適用于該目的的甾體及其類(lèi)似物。發(fā)明簡(jiǎn)述2-甲氧基雌二醇是人生理雌激素——17β-雌二醇的天然代謝物。
該物質(zhì)是分兩步產(chǎn)生的，其涉及雌激素的羥基化，產(chǎn)生兒茶酚雌激素，然后通過(guò)可誘導(dǎo)的細(xì)胞色素p450通路進(jìn)行甲氧基化，產(chǎn)生相應(yīng)的甲氧基雌激素(Spink等人，1994)。目前認(rèn)為是無(wú)生理活性的(Rosner等人，1991)，但在細(xì)胞培養(yǎng)研究中已確認(rèn)2-甲氧基雌二醇抑制某些變形細(xì)胞系的增殖作用(Lottering等人，1992)，并抑制活動(dòng)性內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活性增殖(Fotsis等人，1994)。Fotsis等人還表明給藥2-甲氧基雌二醇可通過(guò)抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但它并不是直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有人提出該化合物可減少基膜損壞，因此可防止細(xì)胞遷移至細(xì)胞外基質(zhì)中，并使其具有潛在的抗血管生成藥物的作用，用于治療實(shí)體瘤或血管生成疾病。在Klauber等人，1997中證實(shí)了對(duì)腫瘤新血管形成的抑制作用。
2-甲氧基雌二醇對(duì)經(jīng)培養(yǎng)之兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的抗增殖作用(Nishigaki等人，1995)也表明該化合物可用于防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，該疾病中的細(xì)胞變化與哮喘和AHR中的不同。
抗增殖作用的機(jī)理尚未確定。Lottering等人(1992)提出環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)的升高可解釋2-甲氧基雌二醇對(duì)DNA合成的抑制作用，其中在有絲分裂的紡錘體形成期間對(duì)微血管形成的抑制作用可用于解釋對(duì)細(xì)胞分裂的抑制作用(Fotsis等人，1994)。2-甲氧基雌二醇的其他生理作用沒(méi)有被廣泛表征。在豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)物中，2-甲氧基雌二醇抑制PGF2α的合成(Zhang和Davis,1992)。2-甲氧基雌二醇的非基因組作用包括通過(guò)在秋水仙素位點(diǎn)處與微管素的結(jié)合產(chǎn)生的微管破裂作用(D′Amato等人，1994；Aizu-Yokota等人，1995)以及血管平滑肌的松弛作用(Goyache等人，1995)。
在國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)WO 95/04535中，描述了通過(guò)抑制微管素在體外的聚合作用而具有抗有絲分裂作用的雌二醇衍生物。在該體外研究中可推導(dǎo)出，所述化合物抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
本發(fā)明涉及2-甲氧基雌二醇的作用以及對(duì)炎性細(xì)胞活化的抑制。其特別是涉及對(duì)如哮喘的氣管疾病進(jìn)行治療或預(yù)防。
沒(méi)有一份文獻(xiàn)提到上述設(shè)想或公開(kāi)了本發(fā)明。例如，在氣管中抑制平滑肌細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞的活化并不能經(jīng)由WO 95/04535的體外觀察而被預(yù)測(cè)到，而且這些活性的機(jī)理似乎與對(duì)微管形成的作用無(wú)關(guān)。
2-甲氧基雌二醇對(duì)兔血管平滑肌的抗增殖作用(Nishigaki等人，同上)也不能外推至氣管平滑肌，這是因?yàn)檫@兩種來(lái)源的細(xì)胞的應(yīng)答性不同。
一些增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖的藥物如肝素，實(shí)際上抑制氣管平滑肌細(xì)胞的增殖。因此，2-甲氧基雌二醇在內(nèi)皮細(xì)胞中的抗增殖作用(Fotsis等人，WO 95/04535，同上)不能說(shuō)明平滑肌以相同的方式進(jìn)行應(yīng)答。
我們發(fā)現(xiàn)2-甲氧基雌二醇抑制髓過(guò)氧化酶從人外周血之多形核白細(xì)胞中的釋放以及對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞吞噬活性。在這些細(xì)胞中降低細(xì)胞吞噬活性可證明其抗炎性質(zhì)。這是非常令人驚奇的，特別是因?yàn)橐阎?-甲氧基雌二醇對(duì)糖皮質(zhì)激素或者雌激素受體沒(méi)有明顯的親和性(Merriam等人，1980)。
這些性質(zhì)使2-甲氧基雌二醇以及相關(guān)化合物有利于治療包括但不限于哮喘、慢性阻塞性氣管疾病和其他以炎癥為特征的氣管疾病。適合于本發(fā)明方法治療的其他疾病包括例如肺氣腫、肺炎或以增殖性和炎性病癥如中性白細(xì)胞過(guò)濾為特征的氣管疾病、或者其癥狀或后遺癥導(dǎo)致殘留炎性細(xì)胞活化的肺感染疾病。
還可治療如過(guò)敏性鼻炎的病癥，這是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)2-甲氧基雌二醇抑制與肥大細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞系——RBL2H3的脫粒。2-甲氧基雌二醇的抑制作用對(duì)抗原刺激的釋放是選擇性的，因?yàn)閷?duì)蛋白激酶C刺激劑、PMA以及對(duì)鈣離子載體A23187的應(yīng)答不受影響。因此，對(duì)抗原釋放的作用不是由于對(duì)微管依賴性的顆粒擠壓作用產(chǎn)生非特異性作用的結(jié)果。我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明2-甲氧基雌二醇和具有這些活性的相關(guān)甾體可用于治療過(guò)敏性疾病，該疾病包括但不限于鼻炎和特異反應(yīng)性的皮膚疾病。不希望受限于任何具體的作用機(jī)理，這些數(shù)據(jù)表明與涉及受體的特異性信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理有關(guān)，而且該機(jī)理對(duì)抑制氣管炎癥是有作用的。
我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)2-甲氧基雌二醇抑制DNA合成以及用寬范圍之包括FCS和bFGF的生長(zhǎng)因子刺激的氣管平滑肌中的細(xì)胞分裂。另外，血清素刺激的蛋白合成速率增加被2-甲氧基雌二醇抑制，除抑制細(xì)胞增殖外，還提高了抗肥大作用的可能性。與2-甲氧基雌二醇的抗血管生成活性一起，我們的觀察表明該化合物及其相關(guān)化合物在治療以炎癥為特征的上述氣管疾病中有治療價(jià)值，特別是治療慢性哮喘，其對(duì)氣管壁組織改變有特別的作用并因而對(duì)氣管高應(yīng)答性產(chǎn)生影響。還測(cè)試了2-甲氧基雌二醇的類(lèi)似物抑制DNA合成的作用，其結(jié)果表明這些化合物也是有治療價(jià)值的。
在第一方面中，本發(fā)明提供治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要此等治療的哺乳動(dòng)物給藥具有調(diào)節(jié)氣管組織改變之活性的甾體或甾體類(lèi)似物。優(yōu)選的是，所述哺乳動(dòng)物是人、貓、馬或牛，更優(yōu)選的是人。甾體2-甲氧基雌二醇特別優(yōu)選用于本發(fā)明方法中。在本發(fā)明所用劑量水平時(shí)沒(méi)有有效糖皮質(zhì)激素活性的甾體或其類(lèi)似物是特別希望的。
在第二方面中，本發(fā)明提供治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要此等治療的哺乳動(dòng)物給藥甾體或甾體類(lèi)似物，其中，所述甾體或類(lèi)似物抑制多形核白細(xì)胞的細(xì)胞吞噬作用。優(yōu)選的是，髓過(guò)氧化酶從白細(xì)胞中的釋放也被抑制。還抑制巨噬細(xì)胞的活化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)一步通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和炎癥來(lái)調(diào)節(jié)氣管壁的組織改變。所述組織改變進(jìn)一步通過(guò)抑制以下一種或多種活性來(lái)調(diào)節(jié)氣管壁中血管生成、氧化劑的形成和微管功能的形成。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于治療以下疾病哮喘、氣管高應(yīng)答性、支氣管收縮、肺氣腫、肺炎、特異反應(yīng)性疾病如過(guò)敏性鼻炎和肺感染。
在第三方面中，本發(fā)明提供通過(guò)抑制氣管壁的炎癥來(lái)調(diào)節(jié)氣管組織改變的甾體或甾體類(lèi)似物。優(yōu)選的是，所述化合物還具有抑制氣管平滑肌細(xì)胞增殖的活性、特別是應(yīng)答有絲分裂因子刺激的活性。
在第四方面中，本發(fā)明涉及通過(guò)抑制細(xì)胞吞噬活性來(lái)調(diào)節(jié)氣管組織改變的甾體或甾體類(lèi)似物，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用2-甲氧基雌二醇抑制多形核白細(xì)胞的細(xì)胞吞噬活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還抑制髓過(guò)氧化酶從多形核白細(xì)胞中的釋放。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述甾體或甾體類(lèi)似物不具有糖皮質(zhì)激素活性。
在第五方面中，本發(fā)明提供的上述甾體或甾體類(lèi)似物進(jìn)一步具有抗血管生成活性和/或抗氧化活性。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的甾體或甾體類(lèi)似物還具有破裂氣管壁中的微管的活性。
在第六方面中，本發(fā)明提供包括上述甾體或甾體類(lèi)似物、任選一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑的組合物。所述載體和賦形劑的例子包括但不限于干燥的微粉化粉末和乳糖或者最近研制出的氫氟烷烴。本發(fā)明的組合物可成型為通過(guò)在治療氣管疾病或哮喘中所用的常規(guī)途徑例如局部、口服、鼻腔給藥或吸入給藥的制劑。這些制劑可為任何常規(guī)的劑型，如膠囊劑、扁囊劑、片劑、氣霧劑、粉末顆粒劑、微粉化顆粒劑或溶液劑。任選地，所述甾體或甾體類(lèi)似物可與環(huán)糊精復(fù)合，也可為與藥物學(xué)上可接受的酸形成酯的形式，所述酸例如是硫酸、乙酸、苯甲酸等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可參考標(biāo)準(zhǔn)教材，如Remington′s Pharmaceutical Sciences 17th版，來(lái)確定制劑所采用的劑型以及如何給藥。
甾體或甾體類(lèi)似物的給藥劑量取決于待治療的病癥和給藥途徑，而且這對(duì)普通住院醫(yī)生或獸醫(yī)來(lái)說(shuō)這是顯而易見(jiàn)的。此類(lèi)普通技術(shù)人員可容易地確定合適的給藥劑量、方式和頻率。本發(fā)明的組合物可用于治療慢性或急性氣管炎癥，包括哮喘、氣管高應(yīng)答性(AHR)或支氣管收縮。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)給藥包含2-甲氧基雌二醇的組合物可抑制哮喘病人之氣管壁平滑肌細(xì)胞的炎癥和增殖。
雖然具體參考2-甲氧基雌二醇來(lái)描述本發(fā)明，但可理解的是也可在本發(fā)明中使用具有所需生理活性的該化合物的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物包括但不限于2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
已鑒別出許多雌二醇衍生物的化合物在其他組織中具有抗增殖和/或抗血管生成活性。例如見(jiàn)WO 95/04535，其整個(gè)內(nèi)容在此并入作為參考。
此等化合物也是適用于本發(fā)明中的候選藥物，并在本發(fā)明的甾體、甾體類(lèi)似物或甾體類(lèi)似化合物的意思范圍內(nèi)。優(yōu)選的化合物在甾體骨架的2位上具有甲氧基。
另外，可設(shè)想到目前尚未知曉的其他化合物也有可能具有與本發(fā)明之2-甲氧基甾體或甾體類(lèi)似化合物相似的結(jié)構(gòu)，并具有本發(fā)明范圍內(nèi)的生理活性。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“甾體”、“甾體類(lèi)似物”或“甾體類(lèi)似化合物”可理解為包括2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚、4-甲氧基雌二醇以及其他基于具有與本發(fā)明目的相關(guān)生理活性的甾核的化合物。其他化合物可具有與2-甲氧基雌二醇足夠的結(jié)構(gòu)和/或電(電荷分布)相似性，并具有本發(fā)明范圍內(nèi)的生理活性，而不被限制具有甾核，此等化合物可被認(rèn)為是本發(fā)明的甾體類(lèi)似物，例如WO 95/04535中的化合物。具有此等活性的化合物可容易地通過(guò)使用能夠指示本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中其他處所描述類(lèi)型的活性的試驗(yàn)來(lái)鑒別出來(lái)。例如，可通過(guò)測(cè)定氣管平滑肌細(xì)胞增殖作用來(lái)測(cè)試化合物對(duì)慢性呼吸阻塞性疾病的作用；通過(guò)確定對(duì)炎性細(xì)胞活化的抑制來(lái)測(cè)試對(duì)過(guò)敏性鼻炎和感染性疾病的作用，對(duì)鼻炎測(cè)試肥大細(xì)胞，而對(duì)感染性疾病測(cè)試中性白細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可利用其他測(cè)試，并容易地篩選出適合于本發(fā)明的化合物。本發(fā)明詳細(xì)描述現(xiàn)參考附圖并根據(jù)實(shí)施例來(lái)詳細(xì)描述本發(fā)明，圖中

圖1顯示2-甲氧基雌二醇對(duì)辣根過(guò)氧化酶介導(dǎo)的四甲基聯(lián)苯胺氧化沒(méi)有作用。
圖2顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預(yù)處理)對(duì)有絲分裂因子誘導(dǎo)的[3H]-胸甙插入經(jīng)培養(yǎng)之人氣管平滑肌細(xì)胞中的作用。測(cè)試的有絲分裂因子是0.3U/ml的凝血酶、1％的FCS、300pM的bFGF(圖2a)和10％的FCS、3nM的EGF(圖2b)。進(jìn)行與圖2a和2b相同設(shè)計(jì)的附加實(shí)驗(yàn)，并且在圖2c中顯示的是該后一個(gè)結(jié)果與圖2a和2b中的結(jié)果組合的圖。還研究了2-甲氧基雌二醇(3μM)對(duì)凝血酶(0.3U/ml)誘導(dǎo)的DNA合成隨時(shí)間的作用(圖2d)。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中[3H]-胸甙插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。
圖3顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預(yù)處理)對(duì)有絲分裂因子誘導(dǎo)的[3H]-白氨酸插入的作用。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中[3H]-白氨酸插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。
圖4顯示2-甲氧基雌二醇(0.3-10μM,30分鐘預(yù)處理)在(a)FCS(1％)或(b)bFGF(300pM)存在時(shí)對(duì)細(xì)胞數(shù)量的作用。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量增加的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。
圖5顯示甾體受體拮抗劑——RU486(1μM)對(duì)2-甲氧基雌二醇(3μM)抑制FCS(1％)誘導(dǎo)DNA合成的作用。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中[3H]-胸甙插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。RU 486在2-甲氧基雌二醇前30分鐘加入，而2-甲氧基雌二醇在FCS前30分鐘加入。
圖6顯示17β-雌二醇和2-羥基雌二醇(0.3-1μM,30分鐘預(yù)處理)對(duì)FCS(1％)誘導(dǎo)的[3H]-胸甙插入的作用。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中[3H]-胸甙插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。有關(guān)2-甲氧基雌二醇的數(shù)據(jù)從圖1中復(fù)制以易于對(duì)比。
圖7顯示2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇(0.3-10μM,30分鐘預(yù)處理)對(duì)凝血酶(0.3U/ml)誘導(dǎo)[3H]-胸甙插入的作用。數(shù)據(jù)以3個(gè)不同培養(yǎng)基中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并以在未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞中[3H]-胸甙插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。有關(guān)2-甲氧基雌二醇的數(shù)據(jù)從圖2a中復(fù)制以易于對(duì)比。
圖8顯示2-甲氧基雌二醇對(duì)豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞中超氧化物陰離子釋放的作用。該化合物完全阻斷巨噬細(xì)胞對(duì)酵母多糖的超氧化物陰離子應(yīng)答，并降低對(duì)fMLP的應(yīng)答。
圖9顯示2-甲氧基雌二醇對(duì)豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞中前列環(huán)素釋放的作用。結(jié)果表明該雌二醇完全阻斷對(duì)fMLP的巨噬細(xì)胞應(yīng)答，并抑制對(duì)PMA的應(yīng)答50％。
圖10是顯示各種濃度的卵白蛋白(DNP-OA)對(duì)肥大細(xì)胞(RBL2H3)脫粒的作用、以及2-甲氧基雌二醇的抑制作用的圖。
圖11顯示2-甲氧基雌二醇降低卵白蛋白(DNP-OA)刺激的[3H]-5HT從豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞中的釋放，但對(duì)PMA的應(yīng)答沒(méi)有作用?？s寫(xiě)本發(fā)明所用縮寫(xiě)如下AHR氣管高應(yīng)答性bFGF基本成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子DNP-OA經(jīng)二硝基-苯酚處理的卵白蛋白EGF表皮生長(zhǎng)因子fMLP甲?；琢虬滨Ａ涟滨１奖彼酨DGF血小板衍生的生長(zhǎng)因子PMA佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽5HT血清素常規(guī)方法細(xì)胞培養(yǎng)從Alfred醫(yī)院(Melbourne)的肺移植供體或受體的宏觀正常肺切除樣品中得到人支氣管平滑肌。按以前所述具體制備培養(yǎng)物(Tomlinson等人，1994)。簡(jiǎn)言之，在37℃下將組織部分消化在包含3mg/ml膠原酶的Dulbecoo改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(補(bǔ)充有2mM L-谷酰胺、100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素G、2μg/ml兩性霉素B、和0.25w/v％牛血清白蛋白(BSA))中30分鐘，然后在0.5mg/ml彈性蛋白酶中溫育2小時(shí)進(jìn)一步消化約0.5g平滑肌，接著于37C在膠原酶(3mg/ml)中溫育18小時(shí)。離心細(xì)胞懸浮液(10分鐘，100×g,25℃)，在經(jīng)補(bǔ)充的DMEM中洗滌三次，重新懸浮在25ml包含10％(v/v)經(jīng)熱滅活的胎牛血清(FCS)的DMEM中，接種在25cm2Falcon培養(yǎng)燒瓶中，并溫育(37℃,5％CO2)7-10天，直至達(dá)到單層融合。通過(guò)10分鐘接觸0.5％肝素和1mM EDTA來(lái)每周收集細(xì)胞，并按1∶3分流比在75cm2Falcon培養(yǎng)燒瓶中傳代。在實(shí)驗(yàn)中使用第3-15代的細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)將細(xì)胞次代培養(yǎng)在8孔室式組織培養(yǎng)玻片(Labtek)中，并在DMEM(10％FCS)中培養(yǎng)至100％融合。在冰冷丙酮中固定20秒前，在PBS中洗滌三次玻片，在染色前于4℃下儲(chǔ)存最多至4周。在PBS/BSA(0.25％)中再水化20分鐘，然后在0.5％Triton X-100(于PBS)中溫育，由此使細(xì)胞滲透，接著在22℃下與原發(fā)抗體溫育至少60分鐘。用0.25％BSA之PBS溶液洗滌3次，由此除去原發(fā)抗體，然后于22℃使細(xì)胞與次生抗體接觸至少60分鐘(辣根過(guò)氧化酶(HRP)-綴合的羊抗鼠；Ig F(ab′)2片段或羊抗兔IgG)。用PBS/BSA(0.25％)代替原發(fā)抗體，由此制備對(duì)照溶液。用光顯微鏡(連接在VideoPro 32影象分析系統(tǒng)上的Olympus BH2,Faulding Imaging,Clayton,Victoria)分析經(jīng)固定細(xì)胞的染色。用于在培養(yǎng)基中鑒別平滑肌的抗體的特征建立在天然氣管壁樣品上。所用的抗體可對(duì)抗α-肌動(dòng)蛋白、肌凝蛋白、calponin(對(duì)平滑肌都是特異性的)、細(xì)胞發(fā)育素(cytokeratin)(上皮細(xì)胞)和PECAM-1(CD31，其是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)。
在所有用于本研究的培養(yǎng)基中都觀察到平滑肌α-肌動(dòng)蛋白、肌凝蛋白和calponin的表達(dá)。這些培養(yǎng)基沒(méi)有表達(dá)可檢測(cè)到的PECAM-1染色，而且少于5％的細(xì)胞對(duì)于用抗細(xì)胞發(fā)育素的單克隆抗體的染色是陽(yáng)性的。用于產(chǎn)生培養(yǎng)物的氣管附近的包埋石蠟的氣管部分正性染色僅在氣管平滑肌和血管束中的平滑肌α-肌動(dòng)蛋白以及肌凝蛋白。抗PECAM-1的抗體染色血管內(nèi)皮，而抗細(xì)胞發(fā)育素的抗體僅染色上皮，這證明這些抗體對(duì)靶抗原的特異性。DNA和蛋白質(zhì)的合成按1∶3的比例將細(xì)胞次代培養(yǎng)在24孔板中，并在37℃下于5％CO2的大氣環(huán)境下培養(yǎng)72-96小時(shí)至單層融合。用無(wú)血清的DMEM替換含血清的培養(yǎng)基24小時(shí)，產(chǎn)生生長(zhǎng)停止。在某些實(shí)驗(yàn)中，在添加有絲分裂因子前用2-甲氧基雌二醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理30分鐘。在適當(dāng)?shù)目字屑尤氪碳?有絲分裂因子)以及包含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒(Monomed A,1％v/v)的補(bǔ)充液。加入Monomed A是為了提供前進(jìn)因子，這些因子對(duì)如凝血酶、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和基本成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bGF)的生長(zhǎng)因子的有絲分裂活性是最基本的(Stewart等人，1995a)。在添加時(shí)使有絲分裂因子和抑制劑與細(xì)胞相接觸，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，除非另有說(shuō)明。根據(jù)以前的研究(Stewart等人，1995)，在用[3H]-胸甙(1μCi/ml,4小時(shí))脈沖以測(cè)定放射標(biāo)記插入新合成之DNA前，溫育細(xì)胞24小時(shí)(37℃,5％CO2)。放射活性的插入通過(guò)在脈沖-標(biāo)記階段結(jié)束時(shí)的過(guò)濾來(lái)確定。抽出包含放射活性的培養(yǎng)基，通過(guò)添加200μl的0.1M NaOH使細(xì)胞溶解。在結(jié)合收集器(PackardFiltermate 196)中于玻璃纖維過(guò)濾器(Packard，標(biāo)準(zhǔn))上進(jìn)行過(guò)濾，由此固定DNA，用3×3ml體積的蒸餾水和單次1ml體積的100％乙醇洗滌該過(guò)濾器。經(jīng)干燥的過(guò)濾器在Packard Topcount液體閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。蛋白質(zhì)合成速率在與上述實(shí)驗(yàn)類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中確定，但是在4小時(shí)的脈沖溫育中[3H]-白氨酸代替[3H]-胸甙。而且，在確定有絲分裂因子和2-甲氧基雌二醇對(duì)蛋白質(zhì)合成速率的作用的實(shí)驗(yàn)中，與有絲分裂因子的溫育進(jìn)行48小時(shí)。這些實(shí)驗(yàn)需要持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間，以便有足夠的時(shí)間使細(xì)胞分裂發(fā)生。細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量與上述DNA合成類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞數(shù)量的變化，由此確定氣管平滑肌細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞循環(huán)至有絲分裂的前進(jìn)過(guò)程，不同的是繼續(xù)與有絲分裂因子溫育48小時(shí)。曝露在200μl的0.5％胰蛋白酶之PBS溶液中30-45分鐘，該P(yáng)BS包含1Mm EDTA，以確保細(xì)胞完全地相互分開(kāi)，并與培養(yǎng)板分開(kāi)，以便能夠進(jìn)行精確的計(jì)數(shù)，由此將細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)所用的6孔培養(yǎng)板的各孔中移出。在該時(shí)間段終止后，進(jìn)一步添加200μl的PBS(20％FCS)，以防止細(xì)胞被胰蛋白酶溶解，然后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中直接計(jì)數(shù)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)于DNA和蛋白質(zhì)合成實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)處理重復(fù)4次。各實(shí)驗(yàn)至少在從3個(gè)不同的個(gè)體中得到的3個(gè)不同培養(yǎng)基中進(jìn)行。在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，在3個(gè)培養(yǎng)基中進(jìn)行單獨(dú)的溫育。結(jié)果以從多個(gè)培養(yǎng)基中得到的分組數(shù)據(jù)表示，然后以n個(gè)培養(yǎng)基的平均值±SE來(lái)表示。經(jīng)處理細(xì)胞的應(yīng)答除以在相同24孔板上的對(duì)照的應(yīng)答，由此計(jì)算出增加度。在對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化進(jìn)行回歸后，通過(guò)成對(duì)t-檢驗(yàn)來(lái)分析分組數(shù)據(jù)。在必要時(shí)使用多重比較的Bonferroni調(diào)節(jié)。如果p＜0.05，則認(rèn)為差異顯著。材料所用的化學(xué)品都是分析級(jí)的或者更高級(jí)別的。所用的化合物及其來(lái)源如下2-甲氧基雌二醇(1,3,5-[10]-雌三烯-2,3,17-三醇2-甲基醚，商品編號(hào)83H4065)；17β-雌二醇(1,3,5[10]-雌三烯-3,17β-二醇，商品編號(hào)E8876)；2-甲氧基雌三醇(1,3,5-雌三烯-2,3,16α,17β-四醇，商品編號(hào)26F 4038)；2-甲氧基雌酮(2,3-二羥基-1,3,5[10]-雌三烯-17-酮，商品編號(hào)110F4003)；2-羥基雌二醇(1,3,5[10]-雌三烯-2,3,17β-三醇商品編號(hào)75H0853)；L-谷酰胺、基本上無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白部分V(BSA)、凝血酶(牛血漿)，得自于Sigma公司，美國(guó)；兩性霉素B(Fungizone)、人重組基本FGF(bFGF)，得自于Promega公司，美國(guó)；CLS l型膠原酶、彈性蛋白酶，得自于Worthington Biochemical公司，美國(guó)；Dulbecco ‘A’磷酸鹽緩沖鹽水(RBS)，得自于Oxoid公司，英國(guó)；胰蛋白酶、依地酸、青霉素-G、鏈霉素、Monomed A,得自于CSL，澳大利亞；胎牛血清(FCS)，得自于Flow Laboratories，澳大利亞；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，得自于FlowLaboratories，蘇格蘭。[6-3H]-胸甙(185 GBq/mmol,5Ci/mmol),得自于Amersham，英國(guó)；Microscint-O閃爍體，得自于Canberra-Packard，澳大利亞。用于免疫細(xì)胞化學(xué)中的抗體是抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(鼠單克隆)(Dako M851)、單克隆鼠抗PECAM-1(DAKO-CD31,JC/70A)(Dako M823)，得自于Dako公司，美國(guó)；抗細(xì)胞發(fā)育素(鼠單克隆CY90,Sigma，美國(guó))抗鼠IgF(ab′)2片段FITC-綴合物(宿主羊)、羊抗兔Ig HRP-綴合物(Silenus DDAF)，得自于Silenus公司，澳大利亞，以及抗平滑肌myosin(兔多克隆)，由M Sparrow教授(Perth,WA)提供。實(shí)施例12-甲氧基雌二醇對(duì)白細(xì)胞活性的作用白細(xì)胞激活是哮喘病理學(xué)的一個(gè)特征。2-甲氧基雌二醇與微管素上的秋水仙素結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合產(chǎn)生該化合物干擾白細(xì)胞功能如細(xì)胞吞噬作用和移動(dòng)作用的可能性。
2-甲氧基雌二醇的功能作用在由人外周血中得到的多形核白細(xì)胞(PMN)和粘性單核細(xì)胞上進(jìn)行檢查。超氧化物陰離子的產(chǎn)生通過(guò)超氧化物歧化酶敏感性還原細(xì)胞色素C來(lái)確定(Stewart和Harris,1992)。髓過(guò)氧化酶的釋放通過(guò)四甲基-聯(lián)苯胺的氧化反應(yīng)來(lái)確定(Menegazzi等人，1992)。細(xì)胞吞噬作用通過(guò)酵母多糖顆粒的放射性碘化來(lái)確定(Shelton和Hosking,1975)。
根據(jù)我們以前的研究收集并培養(yǎng)豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞(Stewart和Phillips,1989)。細(xì)胞與刺激劑在有或沒(méi)有2-甲氧基雌二醇(10μM)存在時(shí)溫育30分鐘，所述刺激劑包括向化性的三肽、甲?；琢虬滨Ａ涟滨１奖彼?fMLP,100nM)、酵母多糖(400μg/ml)或佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽(PMA,100nm)，而2-甲氧基雌二醇在刺激劑前15分鐘加入。通過(guò)超氧化物歧化酶敏感的細(xì)胞色素C還原來(lái)確定超氧化物陰離子(Stewart和Harris,1992)，而前列環(huán)素的穩(wěn)定代謝物——6-氧-PGF1通過(guò)放射性免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定(Stewart和Phillips,1989)。所有的單獨(dú)培養(yǎng)重復(fù)進(jìn)行兩次，并在來(lái)自于5只豚鼠的巨噬細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
RBL2H3細(xì)胞在包含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在24孔板中傳代用于實(shí)驗(yàn)。與從分泌抗DNP卵白蛋白抗體的淋巴細(xì)胞系中得到的50％(v/v)調(diào)理的培養(yǎng)基一起溫育48小時(shí)，由此致敏化細(xì)胞。在該溫育的最后24小時(shí)中，在各孔中加入[3H]-5HT(1μCi/ml)，以標(biāo)記粒狀胺儲(chǔ)存。在溫育結(jié)束后，抽出培養(yǎng)基，在RPMI 1640中洗滌兩次細(xì)胞，在有或沒(méi)有2-甲氧基雌二醇存在下在RPMI 1640(0.25％BSA)中培養(yǎng)15分鐘，然后用經(jīng)DNP處理的卵白蛋白、A23187或PMA刺激30分鐘，此時(shí)收集上清液，離心上清液(100×g,4℃,5分鐘)，并取樣以確定[3H]-5HT的釋放量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。
結(jié)果表明，如表1所示，2-甲氧基雌二醇(3μM)降低用酵母多糖(400μg/ml)或fMLP刺激的白細(xì)胞中四甲基-聯(lián)苯胺的氧化。通過(guò)四甲基-聯(lián)苯胺氧化反應(yīng)測(cè)定出，從經(jīng)fMLP刺激的白細(xì)胞中得到的無(wú)細(xì)胞的上清液仍包含髓超氧化酶活性。但是該活性僅被最高濃度的2-甲氧基雌二醇(10μM)降低。另外，用經(jīng)純化的辣根過(guò)氧化酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以檢查2-甲氧基雌二醇對(duì)四甲基聯(lián)苯胺的氧化反應(yīng)是否有直接作用。2-甲氧基雌二醇(10μM)在該測(cè)定中沒(méi)有作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。表1人多形核白細(xì)胞的四甲基聯(lián)苯胺氧化反應(yīng)
數(shù)據(jù)以吸收值的變化來(lái)表示。測(cè)定使用2×106PMN在0.5ml緩沖液中進(jìn)行。
在PMN中，最高至10μM的2-甲氧基雌二醇沒(méi)有降低在fMLP(100nm)或酵母多糖(400μg/ml)應(yīng)答中超氧化物陰離子的產(chǎn)生。在細(xì)胞吞噬作用試驗(yàn)中，2-甲氧基雌二醇降低了以PNM對(duì)酵母多糖顆粒的放射性碘化，在3和10μM時(shí)都觀察到顯著的作用，見(jiàn)表2。表2人多形核白細(xì)胞對(duì)125I的吸收
*PHS=儲(chǔ)存的人血清數(shù)據(jù)以在可玻璃纖維過(guò)濾的材料中125I插入的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。測(cè)定使用1×106PMN來(lái)進(jìn)行。
在粘性單核細(xì)胞中，10μM的2-甲氧基雌二醇對(duì)相應(yīng)于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸鹽(1μM)PMA或酵母多糖(400μg/ml)的應(yīng)答的四甲基-聯(lián)苯胺氧化反應(yīng)沒(méi)有作用。而且，該細(xì)胞類(lèi)型中在對(duì)PMA應(yīng)答中超氧化物陰離子的產(chǎn)生沒(méi)有作用。但是，在至少某些供體的單核細(xì)胞中，酵母多糖刺激的超氧化物陰離子產(chǎn)生明顯被2-甲氧基雌二醇(10μM)抑制。
如圖8所示，豚鼠巨噬細(xì)胞對(duì)酵母多糖或fMLP的超氧化物陰離子應(yīng)答被2-甲氧基雌二醇降低。但是，對(duì)PMA(100nM)的應(yīng)答未被影響。另外，fMLP(100nM)誘導(dǎo)的6-氧-PGF1α產(chǎn)生增加完全被2-甲氧基雌二醇阻斷，而對(duì)PMA的誘導(dǎo)僅被降低50％，而且如圖9所示，酵母多糖沒(méi)有刺激前列環(huán)素代謝物水平的增加。
卵白蛋白(DNP-OA)誘導(dǎo)濃度依賴性的[3H]-HT釋放，如圖10所示，該釋放可被10μM的2-甲氧基雌二醇降低。但是，如圖11所示，[3H]-HT的基線釋放以及應(yīng)答PMA(100nM)或鈣離子載體A23187(10μM)中的釋放未被2-甲氧基雌二醇影響。
2-甲氧基雌二醇對(duì)PMN髓過(guò)氧化酶釋放和活性的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞吞噬作用的降低表明，該化合物具有體內(nèi)抗炎作用。對(duì)經(jīng)酵母多糖刺激的超氧化物陰離子產(chǎn)生的選擇性抑制作用說(shuō)明對(duì)該吞噬刺激物的特異性作用。這些現(xiàn)象和我們說(shuō)明對(duì)巨噬細(xì)胞功能的抑制作用的試驗(yàn)都提供了有益于哮喘和其他慢性阻塞性氣管疾病、特別是那些明顯有PMN參與的氣管疾病的抗炎作用的證據(jù)。實(shí)施例22-甲氧基雌二醇對(duì)DNA合成的作用在添加有絲分裂因子前使經(jīng)培養(yǎng)的人氣管平滑肌細(xì)胞于0.3-10μM的2-甲氧基雌二醇溫育30分鐘，并如圖2a所示，在剩余的28小時(shí)實(shí)驗(yàn)期間使凝血酶刺激的[3H]-胸甙插入產(chǎn)生濃度依賴性的降低。在2-甲氧基雌二醇的最高濃度(10μM)時(shí)，對(duì)凝血酶的應(yīng)答被降低至大約為對(duì)照水平的10％。2-甲氧基雌二醇對(duì)DNA合成的抑制作用不限于凝血酶的存在，因?yàn)樵贒NA合成被胎牛血清(FCS,1％v/v)或基本成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF,300pM)刺激的細(xì)胞中(圖2a和2b)，觀察到了2-甲氧基雌二醇類(lèi)似的濃度相關(guān)性抑制作用。但是，EGF(3nM)或10％FCS存在時(shí)的DNA合成被顯著抑制，其程度更甚于對(duì)凝血酶、bFGF或更低濃度的FCS的應(yīng)答(圖2c)。10％FCS應(yīng)答中的DNA合成(比未經(jīng)刺激的[3H]-胸甙插入水平高27.2±7.8倍)顯著大于(p＜0.05，成對(duì)Student′t-檢驗(yàn))對(duì)0.3U/ml凝血酶(8.4±3.1倍)、3nm EGF(4.5±0.7)或1％FCS(12.7±0.4)的應(yīng)答，但是與對(duì)300pM的bFGF(22.5±0.4)的應(yīng)答沒(méi)有顯著差異。
還進(jìn)行了隨時(shí)間的研究，以確定在與有絲分裂因子接觸后添加2-甲氧基雌二醇是否仍抑制DNA的合成。當(dāng)在凝血酶后最多4小時(shí)添加2-甲氧基雌二醇(3μM)時(shí)，凝血酶(0.3U/ml)刺激的DNA合成被抑制，在添加凝血酶后2小時(shí)觀察到最大抑制作用。在凝血酶后4-14小時(shí)之間添加2-甲氧基雌二醇產(chǎn)生較小的抑制作用(約20％)，而如圖2d所示，在18小時(shí)或更后的添加對(duì)該有絲分裂因子存在時(shí)的DNA合成沒(méi)有作用。隨后檢查另外的時(shí)間點(diǎn)，這些研究表明在凝血酶的同時(shí)或在其后1小時(shí)添加2-甲氧基雌二醇時(shí)可觀察到最高水平的活性，但是顯著的抑制作用可持續(xù)至凝血酶添加后的6小時(shí)(圖2d)。實(shí)施例32-甲氧基雌二醇對(duì)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞數(shù)量的作用為確定對(duì)DNA合成的抑制作用是否也導(dǎo)致細(xì)胞循環(huán)發(fā)展的停止以及對(duì)有絲分裂的抑制，在與有絲分裂因子溫育48小時(shí)后進(jìn)行蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定。在凝血酶(0.3U/ml)、FCS(1％v/v)或bFGF(300pM)存在時(shí)，抑制[3H]-白氨酸插入的閾濃度是1μM，而且與抑制[3H]-胸甙插入的結(jié)果類(lèi)似。大約30％應(yīng)答時(shí)的最大百分降低低于DNA合成時(shí)觀察到的值，并發(fā)生在3μM。在10μM時(shí)，如圖3所示，在凝血酶或bFGF存在時(shí)，沒(méi)有顯著的抑制作用。2-甲氧基雌二醇單獨(dú)在0.3μM時(shí)對(duì)[3H]-白氨酸插入產(chǎn)生小的刺激作用。更高的濃度(1和3μM)具有小的抑制作用，而在10μM時(shí)沒(méi)有作用。這些結(jié)果見(jiàn)表3。相反地，應(yīng)答FCS(1％,v/v)或bFGF(300pM)時(shí)細(xì)胞數(shù)量的增加對(duì)2-甲氧基雌二醇的抑制作用更敏感，超過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)或DNA合成的作用，如圖4a和4b所示，在3μM觀察到增殖應(yīng)答被完全抑制。表3:2-甲氧基雌二醇對(duì)未經(jīng)刺激的平滑肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成速率的作用
>*p＜0.05成對(duì)Student′st-檢驗(yàn)，與100％相比(無(wú)預(yù)處理)實(shí)施例4血清素刺激的[3H]-白氨酸在平滑肌細(xì)胞中的插入濃度為0.1nM-10μM的血清素(5HT)對(duì)[3H]-胸甙的插入沒(méi)有作用，但是10nM的5HT可增加[3H]-白氨酸的插入。與0.3-10μM的2-甲氧基雌二醇預(yù)先溫育可按照濃度依賴性方式降低5HT(10nM)刺激的蛋白合成的增加，結(jié)果見(jiàn)表4。表4:2-甲氧基雌二醇對(duì)經(jīng)5HT刺激的平滑肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成速率的作用
*p＜0.05成對(duì)Student′s t-檢驗(yàn)，與100％相比(無(wú)預(yù)處理)實(shí)施例52-甲氧基雌二醇的形態(tài)學(xué)作用濃度為3和10μM的2-甲氧基雌二醇可觀察到包括顯示正常紡錘形細(xì)胞的圓形外觀的形態(tài)學(xué)變化。形狀變化在開(kāi)始時(shí)相對(duì)較快，在6小時(shí)內(nèi)即可觀察到，而且在溫育期間都保持。這些形狀變化與用微管解聚劑——秋水仙素(0.1-10μM)溫育細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)的形狀變化類(lèi)似。甾體受體拮抗劑——RU 486(Stewart等人，1995b)降低應(yīng)答秋水仙素或2-甲氧基雌二醇時(shí)產(chǎn)生的形狀變化，但是對(duì)2-甲氧基雌二醇抑制DNA合成沒(méi)有作用。這些結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例62-甲氧基雌二醇類(lèi)似物的作用檢查幾種與2-甲氧基雌二醇有關(guān)的化合物對(duì)經(jīng)FCS(1％,v/v)刺激的DNA合成的抑制作用，包括母體化合物——17β-雌二醇和立即的前體化合物——2-羥基雌二醇。如圖6所示，較低濃度的這些化合物都可增加經(jīng)FCS(1％)刺激的DNA合成。在更高濃度時(shí)，增加作用被反轉(zhuǎn)，并在10μM的這些化合物濃度時(shí)觀察到抑制作用。2-羥基雌二醇(10μM)的抑制作用等于2-甲氧基雌二醇(10μM)。用包括2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇的類(lèi)似物觀察到雙相作用，這些化合物在最高至3μM的濃度時(shí)增加經(jīng)凝血酶刺激的DNA合成，但是在10μM時(shí)增加水平下降，參見(jiàn)圖7。17β-雌二醇和2-羥基雌二醇對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用見(jiàn)表5。表5:2-甲氧基雌二醇對(duì)未經(jīng)刺激的平滑肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成速率的作用
*p＜0.05成對(duì)Student′s t-檢驗(yàn)，與100％相比(無(wú)預(yù)處理)我們發(fā)現(xiàn)2-甲氧基雌二醇具有抗炎活性并抑制DNA合成和隨后的從人支氣管培養(yǎng)出來(lái)的氣管平滑肌細(xì)胞的分裂，2-甲氧基雌二醇是17β-雌二醇的天然代謝物，而以前認(rèn)為17β-雌二醇是無(wú)活性的。
抗炎活性使該化合物及其類(lèi)似物可用于炎性疾病的治療，如哮喘和其他慢性阻塞性氣管疾病、特別是具有明顯PMN參與的那些疾病的治療。
對(duì)DNA合成的抑制作用不是細(xì)胞毒性的結(jié)果，這是因?yàn)榧?xì)胞與最高濃度的2-甲氧基雌二醇(10μM)一起溫育時(shí)蛋白質(zhì)合成速率沒(méi)有被改變，而且在該濃度時(shí)沒(méi)有觀察到細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落。不希望使觀察到的優(yōu)點(diǎn)囿于任何機(jī)理的限制，可能的情況是，甾體在細(xì)胞循環(huán)的G1階段(有絲分裂因子后2小時(shí))即早期抑制細(xì)胞，產(chǎn)生最大的DNA合成抑制作用。尚未確定有絲分裂因子后添加2-甲氧基雌二醇是否仍可維持其抗增殖作用。2-甲氧基雌二醇以相同的效力抑制對(duì)bFGF、凝血酶和FCS(1％)的應(yīng)答，這說(shuō)明對(duì)任何有絲分裂因子沒(méi)有特異性抑制作用。該觀察的結(jié)果暗示2-甲氧基雌二醇作用在使用各有絲分裂因子的早期分子內(nèi)發(fā)送信號(hào)步驟中。然而，對(duì)DNA合成的抑制作用是可克服的，用2-甲氧基雌二醇預(yù)先溫育，較高濃度的FCS(10％)被明顯地較少抑制。該耐受性可用對(duì)高濃度FCS的更大應(yīng)答來(lái)解釋，但是當(dāng)有絲分裂因子是EGF時(shí)，類(lèi)似的理由不能用于對(duì)抑制作用的耐受，因?yàn)樵揈GF誘導(dǎo)小的應(yīng)答，低于凝血酶、FCS 1％或bFGF誘導(dǎo)的應(yīng)答。但是，EGF和10％FCS的增殖作用可被2-甲氧基雌二醇抑制。我們尚未發(fā)現(xiàn)任何將對(duì)DNA合成的抑制作用與對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用聯(lián)系在一起的證據(jù)。然而，在較低濃度的2-甲氧基雌二醇時(shí)觀察到的后期作用說(shuō)明2-甲氧基雌二醇除對(duì)DNA合成的抑制作用外的其他作用對(duì)抗增殖作用也是有貢獻(xiàn)的。
檢查了幾種2-甲氧基雌二醇的類(lèi)似物，以確定它們是否具有相同的抗增殖作用。母體化合物17β-雌二醇和立即的前體化合物2-羥基雌二醇在較低濃度時(shí)增加應(yīng)答FCS(1％)的DNA合成，但在3和10μM時(shí)抑制DNA合成。尚未確定DNA合成中的這些變化是否導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞增殖的變化。2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌三醇對(duì)經(jīng)凝血酶刺激的DNA合成的增加顯示出鈴形的濃度應(yīng)答曲線，在較高濃度時(shí)具有較低的作用?？偠灾覀冇^察的結(jié)果表明2-甲氧基雌二醇是所有已檢查化合物中效力最高的，這與以前對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖應(yīng)答的觀察結(jié)果一致(Fotsis等人，1994)。
還有可能的是與誘導(dǎo)代謝至活性化合物的藥物一起給藥母體化合物17β-雌二醇。例如，可使用p450細(xì)胞色素以及兒茶胺甲基轉(zhuǎn)移酶的誘導(dǎo)劑。芳基硫酸酯酶的抑制劑也可考慮。
2-甲氧基雌二醇的抗增殖作用及其降低5HT誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成增加表明其同時(shí)具有抗增生和抗肥大的作用。在哮喘氣管中有許多增生和肥大現(xiàn)象(Ebina等人，1993)，它們是AHR現(xiàn)象的主要部分(James等人，1989)。降低AHR與完全緩解某些哮喘病患者中的癥狀有關(guān)(Platts-Mills等人，1987)。而且，在所有哮喘氣管壁組織改變應(yīng)答時(shí)的結(jié)構(gòu)變化中，氣管平滑肌的增加是最重要的(Pare和Bai,1995)。如2-甲氧基雌二醇的化合物可防止氣管平滑肌的生長(zhǎng)應(yīng)答，因此可降低AHR并緩解哮喘癥狀。另外，2-甲氧基雌二醇的抗血管生成活性(Fotsis等人，1994)也有可能限制氣管組織改變應(yīng)答，這是因?yàn)橐呀?jīng)確定在組織改變中有血管生成發(fā)生(Kuwano等人，1993)。看來(lái)需要用血管生成作用來(lái)支持組織質(zhì)量增加的代謝需求。因此，防止血管生成作用可使組織改變應(yīng)答停止，這與2-甲氧基雌二醇對(duì)平滑肌和其他細(xì)胞類(lèi)型的任何直接抑制作用是不相關(guān)的。
2-甲氧基雌二醇的許多其他性質(zhì)對(duì)于治療哮喘也是有益的，這包括其已知的破壞微管形成的作用(D′Amato等人，1994)，該作用可降低炎性介質(zhì)從肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞中的細(xì)胞排粒性釋放。
我們的數(shù)據(jù)表明2-甲氧基雌二醇抑制抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫粒作用。該活性支持在更廣范圍的過(guò)敏性疾病中使用2-甲氧基雌二醇，所述過(guò)敏性疾病包括過(guò)敏性鼻炎和特異反應(yīng)性皮膚疾病。fMLP對(duì)豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞活化的抑制作用表明2-甲氧基雌二醇的作用可增加至與肌肉骨架有關(guān)的情況中，這是因?yàn)閒MLP活化與G-蛋白質(zhì)有關(guān)的受體，而不是細(xì)胞吞噬作用。
另外，2-甲氧基雌二醇的抗氧化活性也是有益的，因?yàn)樵跉夤苎装Y中涉及的三種關(guān)鍵的炎性細(xì)胞類(lèi)型都具有產(chǎn)生大量氧自由基的能力，而且與氧化氮一起可導(dǎo)致明顯的氧化劑損壞。這些活性還支持2-甲氧基雌二醇在治療慢性阻塞性氣管疾病中的應(yīng)用，在該疾病中已確定了氧自由基的主要作用而且有氣管壁組織改變的證據(jù)(Kuwano等人，1993)。最后，幾個(gè)研究表明2-甲氧基雌二醇和相關(guān)化合物可減少鈣向平滑肌中的流入(Goyache等人，1995)，如果該現(xiàn)象也在氣管平滑肌中得到證實(shí)，這將對(duì)抗哮喘中的支氣管痙攣。
雖然為清除和理解的目的已具體地描述了一些實(shí)施例，但它們僅是指導(dǎo)性的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下還可對(duì)在此描述的實(shí)施方案進(jìn)行各種的改進(jìn)和變化。
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pig endometrium treated withcatecholestrogens,methoxyestrogens and progesterone),Prostaglandins,44,53-64。
權(quán)利要求
1.治療以慢性或急性氣管炎癥為特征的疾病的方法，其包括向需要如此治療的哺乳動(dòng)物給藥有效量的甾體或甾體類(lèi)似物，所述甾體或甾體類(lèi)似物通過(guò)抑制氣管壁的炎癥和/或抑制平滑肌細(xì)胞的增殖作用來(lái)調(diào)節(jié)氣管組織改變。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物抑制白細(xì)胞的細(xì)胞吞噬作用。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物抑制髓過(guò)氧化酶從白細(xì)胞中的釋放。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物抑制巨噬細(xì)胞的活化。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物不具有糖皮質(zhì)素活性。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其中，通過(guò)抑制以下活性的一種或多種來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)氣管的組織改變，所述活性選自氣管壁中血管生成、氧化劑以及微管功能的形成。
7.如權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物選自2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌酮、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述甾體是2-甲氧基雌二醇。
9.如權(quán)利要求1-8之一所述的方法，其中，所述待治療的疾病選自哮喘、氣管高應(yīng)答性、支氣管收縮、肺氣腫、肺炎、特異反應(yīng)性疾病和肺感染。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述特異反應(yīng)性疾病是過(guò)敏性鼻炎。
11.一種通過(guò)抑制氣管壁的炎癥和/或抑制平滑肌細(xì)胞的增殖作用來(lái)調(diào)節(jié)氣管組織改變的甾體或甾體類(lèi)似物。
12.如權(quán)利要求11所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其抑制多形核白細(xì)胞的細(xì)胞吞噬作用。
13.如權(quán)利要求12所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其抑制髓過(guò)氧化酶從白細(xì)胞中的釋放。
14.如權(quán)利要求11-13之一所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物抑制巨噬細(xì)胞的活化。
15.如權(quán)利要求11-14之一所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其中，所述甾體或甾體類(lèi)似物沒(méi)有糖皮質(zhì)激素的活性。
16.如權(quán)利要求11-15之一所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其進(jìn)一步具有以下活性抗血管生成活性、抗氧化活性以及抑制微管功能。
17.如權(quán)利要求11-16之一所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其選自2-甲氧基雌二醇、2-羥基雌二醇、2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚和4-甲氧基雌二醇。
18.如權(quán)利要求17所述的甾體或甾體類(lèi)似物，其包括2-甲氧基雌二醇。
19.一種組合物，其包括如權(quán)利要求11-18之一的甾體或甾體類(lèi)似物以及藥物學(xué)上可接受的載體。
20.如權(quán)利要求19的組合物，其通過(guò)吸入給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及載體或載體類(lèi)似物在治療慢性和急性氣管炎癥、特別是哮喘中的應(yīng)用。還涉及調(diào)節(jié)氣管組織改變的化合物和組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中,所述甾體是2－甲氧基雌二醇。
文檔編號(hào)A61K31/565GK1218401SQ97194505
公開(kāi)日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年5月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月9日
發(fā)明者阿拉斯泰爾·喬治·斯圖加特 申請(qǐng)人:阿姆瑞德手術(shù)有限公司