專利名稱：哮喘治療方法
技術領域：
此申請涉及一種治療方法，通過給予對應A1和A3腺苷受體的反義寡核苷酸治療哮喘。
背景技術：
哮喘是工業(yè)化國家中最常見的疾病之一，在美國占大約1％的總衛(wèi)生費用。K.Weiss等，《新英格蘭醫(yī)學雜志》326，862-866(1992)。有報告指出在過去的十年中，哮喘的流行和死亡率都存在值得警惕的增長，哮喘-美國，1980-1990，《發(fā)病率和死亡率周報》41，733-735(1992)，并且預測在下一個十年里職業(yè)性哮喘將成為主要的職業(yè)性肺病。MChan-Yeung和J.Malo，《歐洲呼吸雜志》7，346-371(1994)。盡管在工業(yè)化國家中，哮喘死亡率的增加可能歸因于治療這種疾病時依賴β拮抗劑的增加，有關哮喘的深層原因仍知之甚少。J.Gern和R.Lemanske，《北美臨床免疫和變態(tài)反應》13，Bush，R.K.編輯。W.B.Saunders Company，London，pp.839-860(1993)。
腺苷可能是一種介導支氣管哮喘的重要天然介質。R.Pauwels等，《臨床和實驗變態(tài)反應》21增刊1，48-55(1991)；S.Holgate等，《紐約科學院年鑒》629，227-236(1991)。腺苷對人體哮喘的潛在作用得到了實驗結果的支持，即與正常個體相比，哮喘個體對霧化腺苷產生強烈的支氣管收縮反應。M.Church和S.Holgate，《藥理科學進展》7，49-50(1986)；M.Cushley等，《英國臨床藥理學雜志》15，161-165(1983)。與之類似，使用塵螨致敏兔子模型可作為人哮喘的動物模型，哮喘兔子也顯示出對霧化的腺苷產生強烈的支氣管收縮反應，而無哮喘兔子則沒有反應。SAli等，《藥劑與作用》37，165-176(1992)。最近應用此模型系統(tǒng)提示，哮喘中腺苷介導的支氣管收縮和支氣管過度應答主要是通過刺激腺苷受體來介導的。S.Ali等，《藥理學實驗治療雜志》268，1328-1334(1994)；S.Ali等，《美國生理雜志》266，L271-277(1994)。
茶堿作為一種作為治療哮喘的重要藥物，已知是一種腺苷受體拮抗劑(參見M.Cushley等，《美國呼吸系疾病評論》129，380-384)，可減少哮喘兔子中腺苷介導的支氣管收縮(Ali等，同上)。對過敏性兔子預先給予另一種A1-特異受體拮抗劑，8-環(huán)苯基-1，3-二丙基黃嘌呤(DPCPX)，該藥可強效地抑制過敏性兔子中腺苷介導的支氣管收縮和支氣管過度應答。同上。目前可用的腺苷A1受體-特異拮抗劑雖然具有潛在治療價值，但由于其毒性而受到限制。H.Klitgaard等，《歐洲藥理學雜志》242，221-228(1993)。茶堿雖已被廣泛用于治療哮喘，但由于其狹窄的治療劑量范圍，經常伴隨明顯的毒副作用。E.Powell等，《兒科急癥護理》9，129-133(1993)；S Nasser和P.Rees，《藥物安全》8，12-18(1993)；P.Epstein，《內科學紀事》119，1216-1217(1993)。下調腺苷-介導支氣管收縮作為一種可行的替代策略明顯地具有治療意義。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面是一種減少需要治療的患者中腺苷介導的支氣管收縮的方法。該方法包括向患者肺部給予有效減少支氣管收縮劑量的腺苷受體反義寡核苷酸，在此腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體。
本發(fā)明的第二方面是一種給需要治療的患者治療哮喘的方法。該方法包括向患者肺部給予有效治療哮喘劑量的腺苷受體反義寡核苷酸，在此腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體。
本發(fā)明的第三方面是一種藥物組合物，含有腺苷受體反義寡核苷酸，其中腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體，所含反義寡核苷酸的劑量能有效減少腺苷介導的支氣管收縮。藥物組合物中同時還包括適合用藥的載體。
本發(fā)明的第四方面是使用上述所指的腺苷受體反義寡核苷酸制備藥物，用于(a)減少需接受此種治療的患者中由腺苷介導的支氣管收縮，或(b)對需接受此種治療的患者中哮喘進行治療。
反義寡核苷酸作為治療人類疾病的潛在有用的藥物制劑，在理論上受到了相當的重視。R.Wagner，《自然》372，333-335(1994)。然而，有關這些分子對現實人類疾病模型的實際應用尚未實現。對這些分子的藥理學應用，值得重要考慮的是它們的用藥途徑。大部分在體應用反義寡核苷酸的實驗，涉及直接應用它到腦(參見C.Wahlestedt，《藥理科學進展》15，42-46(1994)；J.Lai等，《神經報告》5，1049-1052(1994)；K.Standifer等，《神經元》12,805-810(1994)；A.Akabayashi等，《腦研究》21，55-61(1994))或脊髓液(參見L.Tseng等，《歐洲藥理學雜志》258，R1-3(1994)；R.Raffa等，《歐洲藥理學雜志》258，R5-7(1994)；F.Gillardon等，《歐洲神經科學雜志》6，880-884(1994))的有限區(qū)域。鑒于這些方法的侵入性，在臨床上存在應用局限。
全身性給予反義寡核苷酸也引起藥理學應用的明顯問題，不只是難以到達疾病侵害的組織。相反，肺臟是應用反義寡核苷酸的極好的潛在靶器官，因為它可能被非侵入性接近，并且具有組織特異性。
附圖簡述

圖1闡明了A1腺苷受體反義寡核苷酸和錯配的對照反義寡核苷酸對免子模型中支氣管道的動力順應性的不同作用。**代表顯著性差異p＜0.01，Stutent’st檢驗。
圖2以經A1腺苷受體反義寡核苷酸治療后的呼吸道組織中A1和A2腺苷受體表達數目作為參考，闡明了A1腺苷受體反義寡核苷酸的特異性。
發(fā)明詳述核苷酸序列在此僅以從5’端到3’端方向、從左至右，以單鏈形式表示。核苷酸和氨基酸表示方式在此按照IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的方式，或(對氨基酸)按照37CFRξ1.822及已建立方法，以三字符表示。參見，例如《專利申請者手冊》99-102 (Nov.1990)(U.S.Patent andTrademark Office，Office of the Assistant commissioner for Patents，Washington，D.C.20231)；Hudson等的美國專利號4,871,670 Col.320-43行(申請人明確指出本申請及本文引用的所有其它專利文獻的內容在此引入以供參考)。
本發(fā)明的方法可被用于減少因任何原因，包括(但不僅限于)哮喘的病人肺臟中由腺苷介導的支氣管收縮。A1和A3受體的反義寡核苷酸據證明有下調細胞A1或A3的作用。與治療腺苷介導的支氣管收縮的傳統(tǒng)方法相比，此種治療的一個新穎特征是藥物直接使用于肺部。另外，受體蛋白不僅只是與藥物作用，其本身數量減少，并且毒性被降低了。
在此使用的術語“治療”哮喘一詞特指一種治療，該種治療減少接受這種療法的患者表現出支氣管收縮或哮喘癥狀的可能性。術語“下調”特指為誘導細胞內A1或A3腺苷受體，使之產生、分泌或有效性減少(并因此導致濃度減少)。
本發(fā)明主要是關于對人類患者的治療，但出于獸醫(yī)應用的目的，也可以用于治療其它哺乳類動物，如狗和貓。
通常術語“反義”一詞指使用小的類似單鏈DNA的合成寡核苷酸，通過抑制目標信使RNA(mRNA)功能來抑制基因表達。Milligan，J.F.等，《醫(yī)藥化學雜志》36(14)，1923-1937(1993)。對于本發(fā)明，是期望抑制A1或A3腺苷受體的基因表達?；虮磉_的抑制是通過按照Watson-Crick堿基配對法則，對特定信使RNA(mRNA)的編碼(有義)序列進行雜交取得的。反義抑制的機制在于使用外源性的寡核苷酸，減少靶基因mRNA或蛋白的表達，或使細胞生長或形態(tài)發(fā)生改變。參見Helene，C.和Toulme，J.，《生物物理和生物化學學報》1049，99-125(1990)；Cohen，J.S.編輯，《脫氧寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑》CRC出版Boca Raton，FL(1987)。
在此應用的術語“腺苷受體反義寡核苷酸”被定義為短序列的人工合成核苷酸。它們(1)按照后面描述的雜交條件與編碼A1或A3腺苷受體的mRNA的任何編碼序列雜交，(2)通過雜交減少A1或A3腺苷受體的基因表達。
A1或A3腺苷受體的mRNA序列來自A1或A3腺苷受體表達基因的DNA堿基序列。人類基因組A1腺苷受體序列是已知的，并由G.Stiles等的美國專利5,320,963號公開。A3腺苷受體已經被克隆、測序并在大鼠(參見FZhou等，《美國國家科學院院報》897432(1992))和人體(參見M.A.Jacobson等，英國專利申請?zhí)?304582.1(1993))中表達。因此，按照標準技術可以生產下調A1或A3腺苷受體表達的反義寡核苷酸。
本發(fā)明一個方面在于，反義寡核苷酸具有一定的序列，能與編碼人A1或A3腺苷受體的mRNA分子的任何序列特異性結合，從而阻止mRNA分子的轉譯。反義寡核苷酸可能具有在此公開的序列，它們是SEQ IDNO1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5。
寡核苷酸的化學類似物(例如，寡核苷酸的磷酸二酯鍵被修飾，形成諸如甲基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵或氨基磷酸酯鍵，使寡核苷酸在體內更穩(wěn)定)也是本發(fā)明的一個方面。寡核苷酸中的天然磷酸二酯鍵容易被細胞內源性產生的核酸酶所降解，而許多類似物的鍵對核酸酶的降解作用是高度耐受的。參見Milligan等，和Cohen J.S.，同上。采用“3’末端加帽”的策略，用抗核酸酶的鍵去替代寡核苷酸3’端的磷酸二酯鍵，可以防止寡核苷酸的降解。參見Tidd D.M.和Warenius H.M.，《英國癌癥雜志》60，343-350(1989)；Shaw J.P.等，《核酸研究》19，747-750(1991)。氨基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵和甲基磷酸酯鍵都可以此方式產生作用。更廣泛地修飾磷酸二酯骨架已顯示出可提高穩(wěn)定性，并且可能增強寡核苷酸的親和力和細胞滲透性。參見Milligan等，同上。許多不同的化學手段被用來將整個磷酸二酯骨架替換為新的鍵。同上。骨架類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、甲硼烷磷酸酯、磷酸三酯、甲縮醛、3’-硫甲縮醛、5’-硫甲縮醛、5’-硫醚、碳酸酯、5’-N-氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、氨磺酰、砜、亞硫酸酯、亞砜、硫化物、羥胺、亞甲基(甲基亞氨基)(MMI)或亞甲氧基(MOMI)鍵。經硫代磷酸酯鍵和甲基磷酸酯修飾的寡核苷酸由于可以自動化合成，所以是特別優(yōu)選的。同上。適當的情況下，反義寡核苷酸可采用它們適合藥物應用的鹽類的形式進行給藥。
依照所結合的特定靶目標和因此所采用的輸送方式，反義寡核苷酸可以具有任何適當的長度(例如從大約10至60個核苷酸長度)。反義寡核苷酸優(yōu)選直接作用于含有內含子與外顯子連接部的mRNA區(qū)域。反義寡核苷酸直接作用于內含子/外顯子連接部時，它或者可能完全覆蓋連接部，或者可能充分接近連接部，從而抑制在mRNA前體變?yōu)槌墒靘RNA的加工過程中間插外顯子的剪接。(舉例來說，反義寡核苷酸的3’或5’末端覆蓋內含子/外顯子連接部大約10、5、3或2個核苷酸的范圍)。反義寡核苷酸此外還優(yōu)選與起始編碼重疊。
當使用本發(fā)明時，所使用的反義寡核苷酸可能與被給藥的生物物種具有相關性。當治療人類時，希望使用人類反義寡核苷酸。
本發(fā)明的另一方面是包含上述反義寡核苷酸的藥物組合物，該藥物組合物可有效減少A1或A3腺苷受體的表達，此過程是通過藥物組合物穿過細胞膜并與細胞內編碼A1或A3腺苷受體的mRNA特異性結合，從而阻止mRNA轉譯。這些組合物用適當的藥用載體配制(例如無熱源的無菌生理鹽水)。反義寡核苷酸可用能穿過細胞膜的疏水性載體進行配制(例如使用脂質體，而脂質體又以藥用的含水載體作為載體)。寡核苷酸也可以與滅活mRNA的物質偶聯，如核酶。給予此種寡核苷酸用于抑制患者的A1或者A3腺苷受體活化，患者需要接受此種治療由于任何在此討論的原因。此外，藥物制劑也可能包括嵌合分子，它包含的反義寡核苷酸吸附在一種據知被細胞內化的分子上。這些寡核苷酸結合體利用細胞攝取途徑增加細胞內寡核苷酸的濃度。采用這種方式的大分子的實例包括轉鐵蛋白、去唾液酸糖蛋白(通過聚賴氨酸與寡核苷酸結合)和鏈親合素。
對于藥物制劑，反義化合物可以包含于脂質微?；蛭⒛抑?，例如脂質體或微晶體。微?？梢允侨魏芜m合的結構，象單層或多層片狀結構，以便反義寡核苷酸可以被容納于其中。帶正電荷的脂類如N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，-N，N-三甲基-銨甲基硫酸鹽，或“DOTAP”，特別優(yōu)選作為這種微粒或微囊。制備這種脂質微粒的方法是眾所周知的。參見Janoff等的美國專利號4,880,635；Kurono等的4,906,477；Wallach的4,911,928；Wallach的4,917,951；Allen等的4,920,016；Wheatley等的4,921,757及其它文獻。
患者接受有活性組合物的用藥可通過各種輸送反義核苷酸組合物到達肺部的途徑進行。在此公開的反義化合物可經各種適當的方法用于病人的肺臟，但優(yōu)選的用藥方式為產生包括可吸入的微粒的氣霧劑，該可吸入的微粒包含有反義化合物，患者吸入該微粒。它們可以是液態(tài)或固態(tài)的，微粒中還可任選包含其它治療成分。
本發(fā)明使用的含反義化合物的微粒應包括適于吸入的大小的微粒這意味著，微粒小到足以隨吸氣通過口腔和咽部進入到肺支氣管和肺泡。通常微粒在0.5到10微米大小的范圍適于吸入。氣霧劑中不適于吸入尺寸的微粒容易沉積在喉部被吞咽掉，優(yōu)選氣霧劑中這種微粒的含量最小。對于鼻吸入法，優(yōu)選微粒在10-500微米范圍內，以使其易于滯留在鼻腔中。
反義化合物與適當的賦形劑，比如無菌無熱源的水結合，可做成包含活性化合物用于產生氣霧劑的液體藥物組合物。也可任選含有其它的治療用化合物。
固體微粒組合物含有適于吸入的微化反義化合物干顆粒，它可通過下面的方法來制備，即使用臼和杵研磨干燥的反義化合物，然后將細顆粒通過400目篩網進行打碎或分離出大的結塊。包含反義化合物的固體微粒組合物可任選地含有分散劑，它具有促進氣霧形成的作用。較適合的分散劑是乳糖，它可與反義化合物按任意適當比例進行混合(比如按重量1∶1的比例)。此外，也可添加其它的治療用化合物。
給予反義化合物的劑量是依據所治療疾病、患者狀況、特定的制劑、用藥途徑以及用藥時間等因素來決定。一般細胞內寡核苷酸濃度應從0.05到50μM，或更具體而言從0.2到5μM。對于象人體的用藥，一般應用的劑量從大約0.01，0.1或1mg/kg到50,100或150mg/kg或更高。根據所用的活性物質的特定制劑的可溶性，每日用藥劑量可一次或分次完成。給予反義化合物可作為治療(即作為搶救治療)或預防目的使用。
含反義化合物液體微粒的氣霧劑可用各種相應方法制造，例如使用噴霧器。例如參見美國專利No.4,501,729。噴霧器是可商購的產品，它將具有活性成分的溶液或懸液轉變成可用于治療的氣霧，其原理是使壓縮氣體加速通過狹窄的噴口，氣體一般為空氣或氧氣；或采用超聲振蕩的方法。較適合應用于噴霧器的制劑為液相載體包容的活性成分，活性成分占制劑比例可高達40％w/w，但優(yōu)選小于20％w/w。載體一般為水或是用水稀釋的乙醇溶液，優(yōu)選添加如氯化鈉等以使之與體液等滲。如果該制劑不是制備成無菌的，任選的添加物可包括防腐劑，比如甲基羥基苯甲酸鹽以及抗氧化劑、調味劑、揮發(fā)油、緩沖劑和表面活性劑。
含活性化合物固體微粒的氣霧劑可同樣用各種固體微粒藥物氣霧發(fā)生器產生。用于給予患者固體微粒藥物的氣霧發(fā)生器可以產生如前所述的可吸入微粒，并產生一定體積的氣霧，其中含有預先設定劑量、適于人類用藥比例的藥物。一種示例性的固體微粒氣霧發(fā)生器是吹入器。適合吹入給藥的制劑中包含磨成細粉的藥粉，可以經吹入器導入或通過鼻吸到達鼻腔。在吹入器中，藥粉(可有效產生在此表述的治療作用的一定劑量的藥物)被放置于膠囊或藥筒中，膠囊或藥筒通常用明膠或塑料制成，或被刺破或在原位置被打開，藥粉通過吸氣隨流經該裝置的氣流傳送或通過手動泵傳送。吹入器中使用的藥粉或者僅含活性成分，或者由包含活性成分、適當的稀釋劑(例如乳糖)和可選擇添加的表面活性劑的混合藥粉組成?；钚猿煞衷谥苿┲兴急壤ǔ?.1到100w/w。另一種示例性的氣霧發(fā)生器由可度量吸入器構成?？啥攘课肫魇且环N氣霧加壓輸送裝置，通常在液化推進劑中含有活性成分的懸液或溶液制劑。使用這些裝置時，通過控制閥門來調節(jié)一定量體積藥物的輸送，一般為10到150μl，從而產生含有活性成分的微粒噴霧。適合使用的推進劑包括某些氯氟烴化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和它們的混合物。制劑中可另外含有一種或更多的輔助溶劑，例如乙醇、油酸或脫水山梨醇三硬脂酸酯等表面活性劑、抗氧化劑和合適的調味劑。
氣霧劑無論是以固體還是液體微粒的形式存在，均可由氣霧發(fā)生器以一定速率制造出來，該速率從每分鐘大約10至150升，更優(yōu)選每分鐘30至150升，最優(yōu)選每分鐘大約60升。氣霧劑中所含藥物含量越多，則可被更快速地用藥。
以下實例用于解釋本發(fā)明，不應被理解為限制本發(fā)明。在這些實例中，μM代表微摩爾，mL代表毫升，μm代表微米，mm代表毫米，cm代表厘米，℃代表攝氏度，μg代表微克，mg代表毫克，g代表克，kg代表千克，M代表摩爾，h代表小時。
實例1反義寡核苷酸的設計與合成設計對應于A1和A3腺苷受體的反義寡核苷酸，可能需要弄清A1和A3靶受體mRNA復雜的二級結構。獲得這種結構后，可設計出靶向mRNA的特定區(qū)域的反義核苷酸，這些區(qū)域被認為決定mRNA的功能活性或穩(wěn)定性，反義核苷酸最好可覆蓋起始密碼子。其它的靶位點也是可用的。為證明反義作用的特異性，其它不能與靶mRNA完全互補，但按照w/w比例含有同樣的核苷酸組成的寡核苷酸在反義實驗中被用來作為對照。
對腺苷A1受體mRNA二級結構進行了分析，并按以上所述用于設計硫代磷酸酯反義寡核苷酸。所合成的反義寡核苷酸被稱為HAdAlAS，它具有以下序列5’-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3’(SEQ ID NO1)作為對照，合成了稱為HAdA1MM的錯配的硫代磷酸酯反義核苷酸，其序列如下5’-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3’(SEQ ID NO2)每種寡核苷酸都具有同樣的堿基含量和通用的序列結構。在GENBANK(85.0版)和EMBL(40.0版)中同源檢索結果表明，反義寡核苷酸對人體和兔子的腺苷A1受體基因具有特異性，而錯配的對照物與任何已知基因序列不存在雜交特性。
腺苷A3受體mRNA的二級結構同樣進行了分析，并如上所述設計出兩種硫代磷酸酯反義寡核苷酸。合成的第一種反義寡核苷酸(HAdA3AS1)具有下面的序列5’-GTT GTT GGG CAT CTT GCC-3’(SEQ ID NO3)作為對照，合成了錯配的硫代磷酸酯反義寡核苷酸(HAdA3MM1)，它具有以下序列5’-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3’(SEQ ID NO4)另一種硫代磷酸酯反義寡核苷酸(HAdA3AS2)也被設計并合成，它具有以下序列5’-GTG GGC CTA GCT CTC GCC-3’(SEQ ID N05)它的對照寡核苷酸(HAdA3MM2)具有以下序列5’-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3’(SEQ ID NO6)硫代磷酸酯寡核苷酸是用Applied Biosystems 396型寡核苷酸合成儀合成，并采用NENSORB色譜儀(DuPont，MD)純化。
實例2A1-腺苷受體反義寡核苷酸的體外檢測通過使用肺腺癌細胞HTB-54作為體外模型，對前面敘述的抗人A1受體的反義寡核苷酸(SEQ ID NO1)進行了有效性鑒定。采用標準的northern印跡方法和實驗室設計并合成的受體探針，HTB-54肺腺癌細胞被證明表達A1腺苷受體。
HTB-54人肺腺癌細胞(106/100毫米組織培養(yǎng)皿)用5.0μM HAdAlAS或HAdAlMM處理24小時，并在孵育12小時后更換新鮮的培養(yǎng)基和寡核苷酸。寡核苷酸處理24小時后，細胞被收獲并按照標準方法提取它們的RNA。一種相應于反義藥物作用的靶mRNA區(qū)域的21聚體的探針(因而與反義核苷酸具有同樣的序列，但沒有硫代磷酸化)被合成，并被作為經過HAdAlAS處理、HAdAlMM處理、HAdAlMM處理和無處理的HTB-54細胞中所制備RNA的探針，用于northern印跡。這些印跡清楚地顯示，HAdAlAS而非HAdAlMM能有效(＞50％)減少人腺苷受體mRNA。該結果表明，HAdAlAS是作為抗哮喘藥物的良好候選者，因為它能減少同哮喘有關的胞內腺苷A1受體的mRNA。
實例3A1腺苷受體反義寡核苷酸的在體功效在覆蓋起始密碼子的腺苷A1基因中，兔與人的DNA序列存在偶然的同源性，這就允許在兔子模型中使用最初為人腺苷A1受體而設計的硫代磷酸酯反義寡核苷酸。
新生的無巴斯德菌新西蘭白兔，在出生24小時內用312抗原單位/mL的家居塵螨(D.farinae)提取物(Berkeley Biologicals，Berkeley，CA)與10％的白陶土混合，進行腹膜內免疫。在第一個月每周重復免疫一次，而隨后的兩個月每兩周進行一次免疫。在3-4月齡時，8只致敏的兔子經肌肉注射鹽酸氯胺酮(44mg/kg)和馬來酸乙酰丙嗪(0.4mg/kg)的混合物進行麻醉和松弛。
然后讓兔子放松地仰臥于小的動物模塊墊板上，并且用4.0-mm氣管插管(Mallinkrodt，Inc.，Glens Falls，NY)進行插管。將一根外徑為2.4mm帶有乳膠氣囊的聚乙烯導管穿入食管，并在實驗的全過程中與口部保持同樣的距離(大約16cm)。氣管插管與加熱式Fleisch呼吸速度描記器(size00；DOM Medical，Richmond，VA)相連，流量通過由Gould輸送放大器(型號11-4113，Gould Electronic，Cleveland，OH)空制的Validyne差異壓力換能器(型號DP-45161927；Validyne Engineering Corp.，Northridge，CA)來計量。食道氣囊與差異壓力換能器的一端相連，而氣管插管的外流口與壓力換能器的另一端相接，以便記錄通過肺部的壓力。流量通過求積分變?yōu)檫B續(xù)的波動量，并且全肺耐受性(RL)和動力順應性(Cdyn)是在等容和流量零點分別進行計算，該計算通過自動呼吸分析儀(型號6；Buxco，Sharon，CT)完成。
實驗動物經隨機選擇，在實驗第一天測定實驗前霧化腺苷的PC50值。反義(HAdAlAS)或錯配對照(HAdAlMM)寡核苷酸溶解于無菌生理鹽水，濃度為5000μg(5mg)/1.0ml。實驗動物隨后通過氣管插管給予霧化的反義或錯配寡核苷酸(大約5000μg/1.0ml)，每日兩次共兩天。霧化的鹽水、腺苷、反義或錯配寡核苷酸均使用超聲噴霧器(DeVilbiliss，Somerset，PA)產生，產生的霧化液滴80％直徑都小于5μm。
實驗的第一部分，隨機選擇4只致敏兔子給予反義寡核苷酸，另4只給予錯配對照寡核苷酸。第三天早晨取得PC50值(與基礎值相比減少支氣管呼吸道動力順應性50％所需霧化腺苷以mg/ml表示的濃度)，同這些動物未用寡核苷酸前的PC50值進行比較。
間隔一周后動物被互換，以前給予錯配對照寡核苷酸的動物現在給予反義寡核苷酸，而那些以前給予反義寡核苷酸的改為使用錯配對照寡核苷酸。治療方法與測量方法同第一部分相同。值得注意的是，8只用反義寡核苷酸治療的動物中，有6只在腺苷溶解飽和(20mg/ml)時未出現腺苷介導的支氣管收縮。為了便于計算，這些動物的PC50值被設定為20mg/ml。此時的測量值因而體現了反義效應的最小情況。實際效應要高一些。本實驗的結果以圖1和表1表示。
表1.腺苷A1受體反義寡核苷酸對哮喘兔子PC50值的作用錯配對照 A1受體反義寡核苷酸
結果以平均值(N＝8)±標準誤表示。顯著性通過重復測量值方差分析(ANOVA)和Tukey’s protected t檢驗確定。**代表與所有其它組相比有顯著差異，P＜0.01。
在實驗的兩部分中，霧化腺苷劑量為使肺動力順應性減少50％時，用反義寡核苷酸治療的動物表現出明顯的增加；而錯配對照寡核苷酸未發(fā)現對PC50值有影響。任何接受反義或對照寡核苷酸吸入的動物也未觀察到中毒現象。
這些結果清楚地表明，肺臟具有極大潛力可作為基于反義寡核苷酸的介入治療的靶器官。這些結果進一步說明，在模擬人類哮喘的模型中，下調腺苷A1受體能在很大程度上消除在哮喘呼吸道中由腺苷介導的支氣管收縮。由于參與支氣管過度應答的組織接近霧化寡核苷酸的作用位點，所以在人哮喘的過敏性兔子模型中，這種反應是反義物質介入治療時極好的終點，并且該模型能很好地模仿這種很重要的人類疾病。
實例4A1-腺苷受體反義寡核苷酸的特異性總結實例3中的互換實驗，所有兔子的呼吸道平滑肌都進行了腺苷A1受體數目的定量分析。作為反義寡核苷酸特異性的對照受體-腺苷A2受體，其數目也作了定量分析，這種受體不應受到影響。
每只兔子的呼吸道肌肉組織經解剖，其膜部分按以下描述的方法(JKleinstein和H.Glossmann，《Naunyn-Schmiedeberg’s藥理學進展》305，191-200(1978))制備，只作少量的改變。粗質膜制備物儲存在-70℃直到分析時使用。蛋白含量采用Bradford(M.Bradford，《分析生物化學》72，240-254(1976))方法測定。冷凍的質膜在室溫解凍，與0.2U/ml腺苷脫氨酶一起37℃孵育30分鐘，以去除內源性的腺苷。按以前描述的方法測定[3H]DPCPX(A1受體特異)或[3H]CGS-21680(A2受體特異)結合，參見SAli等，《藥理學實驗治療雜志》268，1328-1334(1994)；S.Ali等，《美國生理學雜志》266，L271-277(1994)。
如圖2和表2所示，利用A1特異拮抗劑DPCPX分析特異性結合，在互換實驗中用腺苷A1反義寡核苷酸治療的動物與對照組相比，A1受體數目減少了將近75％，而用A2受體特異拮抗劑2-[對(2-羧乙基)-苯乙氨基]-5’-(N-乙羧酰氨基)腺苷(CGS-21680)分析，腺苷A2受體數目無變化。
表2.腺苷A1受體反義寡核苷酸作用的特異性錯配對照寡核苷酸 A1反義寡核苷酸
結果以平均值(N＝8)±標準誤表示。顯著性通過重復測量值方差分析(ANOVA)和Tukey’s protected t檢驗確定。**代表與錯配對照相比有顯著差異，P＜0.01。
前述的實例均用于說明本發(fā)明，不應被理解為限制本發(fā)明。本發(fā)明由下述權利要求定義，包括等同于權利要求的敘述。
序列表(1)一般資料(i)申請人Nyce.Jonathan W.(ii)發(fā)明名稱哮喘治療方法(iii)序列數目6(iv)通信地址(A)收件人Kenneth D.Sibley(B)街道Post Office Drawer 34009(C)城市Charlotte(D)州North Carolina(E)國家美國(F)郵編28234(v)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)代理人/事務所資料(A)姓名Sibley，Kenneth D.(B)登記號31，665(C)參考/摘要號5218-29(ix)電訊資料(A)電話(919)881-3140(B)傳真(919)881-3175(C)電傳575102(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特性(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO1GATGGAGGGC GGCATGGCGG G(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特性(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO2GTAGCAGGCG GGGATGGGGG C(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特性(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO3GTTGTTG GGC ATCTTGCC(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特性(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO4GTACTTGCGG ATCTAGGC(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特性(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO5GTGGGCCTAG CTCTCGCC(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特性(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列表述SEQ ID NO6GTCGGGGTAC CTGTCGGC
權利要求
1.一種減少需要治療的患者中腺苷介導的支氣管收縮的方法，包括向患者肺部給予有效減少支氣管收縮劑量的腺苷受體反義寡核苷酸，所述腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體。
2.根據權利要求1的方法，其中所述腺苷受體是A1腺苷受體。
3根據權利要求1的方法，其中所述腺苷受體是A3腺苷受體。
4.根據權利要求1的方法，其中反義寡核苷酸包括其中至少一個磷酸二酯鍵被其它鍵取代的核苷酸，其它鍵選自甲基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵和氨基磷酸酯鍵。
5根據權利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ ID NO1給出的序列。
6.根據權利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ ID NO3給出的序列。
7.根據權利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ ID NO5給出的序列。
8.根據權利要求1的方法，其中反義寡核苷酸是通過向患者的肺部給予含反義寡核苷酸的可吸入微粒的氣霧劑來運送的。
9.根據權利要求8的方法，其中所述微粒選自固體微粒和液體微粒。
10.根據權利要求9的方法，其中所述霧化劑包含的微粒大小在約0.5到10微米范圍內。
11.根據權利要求8的方法，其中所述微粒是包含反義寡核苷酸的脂質體。
12.根據權利要求8的方法，其中給予的反義寡核苷酸的量足以使患者體內該反義寡核苷酸的胞內濃度達到大約0.1到10μM。
13.一種給需要治療的患者治療哮喘的方法，包括向患者給予有效治療哮喘劑量的腺苷受體反義寡核苷酸，所述腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體。
14.根據權利要求13的方法，其中所述腺苷受體是A1腺苷受體。
15.根據權利要求13的方法，其中所述腺苷受體是A3腺苷受體。
16.根據權利要求13的方法，其中反義寡核苷酸包括其中至少一個磷酸二酯鍵被其它鍵取代的核苷酸，其它鍵選自甲基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵和氨基磷酸酯鍵。
17.根據權利要求13的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO1給出的序列。
18.根據權利要求13的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO3給出的序列。
19.根據權利要求13的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO5給出的序列。
20.根據權利要求13的方法，其中反義寡核苷酸是通過向患者的肺部給予含反義寡核苷酸的可吸入微粒的氣霧劑來運送的。
21.根據權利要求20的方法，其中所述微粒選自固體微粒和液體微粒。
22.根據權利要求21的方法，其中所述霧化劑包含的微粒大小在約0.5到10微米范圍內。
23.根據權利要求20的方法，其中所述微粒是包含反義寡核苷酸的脂質體。
24.根據權利要求13的方法，其中給予的反義寡核苷酸的量足以使患者體內該反義寡核苷酸的胞內濃度達到大約0.1到10μM。
25.一種藥物組合物，包括一種藥用載體和一種腺苷受體反義寡核苷酸；所述腺苷受體選自A1腺苷受體和A3腺苷受體；藥物劑量能有效減少腺苷介導的支氣管收縮。
26.根據權利要求25的方法，其中所述腺苷受體是A1腺苷受體。
27.根據權利要求25的方法，其中所述腺苷受體是A3腺苷受體。
28.根據權利要求25的方法，其中反義寡核苷酸包括其中至少一個磷酸二酯鍵被其它鍵取代的核苷酸，其它鍵選自甲基磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵和氨基磷酸酯鍵。
29.根據權利要求25的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO1給出的序列。
30.根據權利要求25的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO3給出的序列。
31.根據權利要求25的方法，其中所述反義寡核苷酸具有SEQ IDNO5給出的序列。
32.根據權利要求25的藥物組合物，其中所述載體選自固體載體和液體載體。
33.根據權利要求25的藥物組合物，進一步包含一種脂質體，該脂質體含有所述的反義寡核苷酸。
34.根據權利要求25的藥物組合物，其中所述反義寡核苷酸與能被細胞攝取的分子結合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種減少需要治療的患者中支氣管收縮的方法。該方法包括給患者使用有效減少支氣管收縮劑量的反義寡核苷酸分子,該分子相對應的受體是A
文檔編號A61K31/70GK1192158SQ96195955
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月3日 優(yōu)先權日1995年6月7日
發(fā)明者J·W·尼塞 申請人:東卡羅萊那大學