專利名稱：制備硫醚軛合物的方法
將細(xì)胞毒劑與抗體相連接的雙官能化合物是公知的。在介導(dǎo)抗與腫瘤相關(guān)的抗原的免疫軛合物的形成中這些化合物一直是特別有用的。這些免疫軛合物可使有毒性的藥物選擇性釋放至腫瘤細(xì)胞。參見(jiàn)例如Hermentin和Seiler，“Investigations With Monoclonal Antibody Drug Conjugates，”Behring Insti.Mitl.82197-215(1988);Gallego等人.，“Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity”.Int.J.Cancer 33737-744(1984);Arnon等人，“In Vitro和In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies，”Immunological Rev.62∶5-27(1982).
Greenfield等人最近描述了含有?；禄衔锛?-(2-吡啶基-聯(lián)硫基)丙酰肼的酸敏感的免疫軛合物的形成，所述?；禄衔锝?jīng)?；赕I軛合至蒽環(huán)型藥分子的13-酮位，并且描述了該蒽環(huán)型藥衍生物與抗體分子的軛合作用(Greenfield等人，歐洲專利公告EP0328147，1989年8月16日出版，該專利相應(yīng)于1988年11月16日提交的未決美國(guó)專利申請(qǐng)第07/270，509號(hào)和1988年2月11日提交但現(xiàn)已放棄的美國(guó)專利申請(qǐng)第07/155，181號(hào))。后一參考文獻(xiàn)還公開(kāi)了具體的含有硫醚的連接物和軛合物，包括含有腙硫醚的免疫軛合物。
Kaneko等人(1990年5月14日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第07/522，996號(hào)，它是1991年11月21日出版的歐洲專利公告EPA0457250的等同專利)描述了含有蒽環(huán)型抗生素的軛合物的形成，該蒽環(huán)型抗生素通過(guò)蒽環(huán)型藥分子C-13位上的?；赕I與雙官能連接物相結(jié)合。在Kaneko等人的發(fā)明中，連接物含有活性吡啶基聯(lián)硫基或鄰硝基苯基聯(lián)硫基，通過(guò)這些基團(tuán)，連接物與結(jié)合在細(xì)胞活性配位體上的合適基團(tuán)反應(yīng)，形成完整的軛合物。
D.Willner等人1992年1月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第824，951號(hào)(該專利并入本文作為參考)公開(kāi)了用酸敏感的連接鍵將治療上活性藥物分子與能識(shí)別選定的靶細(xì)胞群的配位體相連接，制備治療上活性軛合物的方法。
按Willner等人的方法形成的軛合物具有通式(I)的結(jié)構(gòu) 其中D是藥物部分，n是1～10，p是1～6，Y是O或NH+2Cl-，z是0或1，q是約1～10，x是配位體，和
A是邁克爾加成加合物部分。
在其優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物(蒽環(huán)型化合物，優(yōu)選阿霉素)經(jīng)蒽環(huán)型化合物13-酮位上的酰基腙鍵鍵合至軛合物的連接物部分。配位體(還原型抗體，優(yōu)選嵌合型BR96抗體)然后通過(guò)連接物(優(yōu)選馬來(lái)酰亞氨基)與蒽環(huán)型化合物結(jié)合。尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接鍵經(jīng)還原的二硫基(即抗體上游離的巰基(-SH)形成。
按照上述Willner等人的美國(guó)專利申請(qǐng)所述，在優(yōu)選的制備上述軛合物的方法中，配位體MAb-(SH)8上的巰基直接與式(Ⅱb)中間體的邁克爾加成受體(Michael Addition Receptor)反應(yīng)， 生成最終的軛合物(Ⅰa)，
使用該方法，每一配位體一般可與約1～10個(gè)藥物分子相連接。因此，式(Ⅰa)中q可以是約1～10。
如Willner等人的美國(guó)專利申請(qǐng)所述，依據(jù)所用的邁克爾加成受體部分，以方法A中所述的通用方法，使藥物(或衍生的藥物)與含有邁克爾加成受體的酰肼反應(yīng)，可以制備式(Ⅱb)的含有腙類藥物衍生物的中間體邁克爾加成受體。
方法A 其中D是阿霉素，R是馬來(lái)酰亞胺部分。
例如使用可用于所述目的的還原劑，例如二硫蘇糖醇(“DTT”)，通過(guò)還原天然分子(Ⅱ)中的二硫鍵，可以產(chǎn)生含有巰基的配位體(Ⅲ)(MAb-(SH)8)。
軛合反應(yīng)完全后，可以使用公知的透析、色譜和/或過(guò)濾方法分離和純化軛合物。含有軛合物的最終溶液可以冷凍干燥，產(chǎn)生可以安全貯存和運(yùn)輸?shù)母伤煞€(wěn)定的軛合物。用于給藥目的時(shí)，凍干的產(chǎn)物最終可用無(wú)菌水或另一種適用稀釋劑重新配制。另外，最終產(chǎn)物可以例如用液氮冷凍，并在給藥前解凍至環(huán)境溫度。
如Willner等人所述的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使阿霉素與馬來(lái)酰亞氨基-(C1-C10)-烷基酰肼或其鹽反應(yīng)，制備式(Ⅱb)的阿霉素腙。該反應(yīng)一般分兩步進(jìn)行。首先制備馬來(lái)酰亞氨基-(C1-C10)-烷基酰肼或其鹽。然后經(jīng)例如色譜法和/或結(jié)晶法純化后，使酰肼的游離堿或其鹽與阿霉素鹽反應(yīng)。反應(yīng)溶液濃縮后，收集式(Ⅱb)的含有馬來(lái)酰亞胺的腙反應(yīng)產(chǎn)物，必要時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)純化。
然后使腙與一種配位體(最優(yōu)選一種抗體)反應(yīng)，配位體中至少一個(gè)二硫鍵已被還原成至少一個(gè)巰基。如下文所述，尤其優(yōu)選的配位體是一種“松馳抗體”。制備游離巰基的優(yōu)選還原劑是DTT。
“松馳”抗體是其中一個(gè)或多個(gè)(或優(yōu)選四個(gè))二硫鍵已被還原的抗體。松馳抗體尤其優(yōu)選是其中至少四個(gè)二硫橋已被還原的抗體。優(yōu)選的制備松馳(即還原的)抗體的方法中，在無(wú)氧存在的惰性氣氛(例如氮或氬氣氛)下，尤其是用DTT進(jìn)行還原反應(yīng)，并進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的純化。
如Willner等人所述的另一方法中，反應(yīng)在環(huán)境條件下進(jìn)行，但使用很大量的還原劑(優(yōu)選DTT)，以克服已還原的二硫鍵可能發(fā)生的任何再氧化。在任一情形中，盡可能在反應(yīng)完全后就進(jìn)行產(chǎn)物的純化，并優(yōu)選在惰性氣氛(例如氬或氮保護(hù)層)下操作。然而，優(yōu)選的制備含有巰基的配位體的方法是這樣的方法，即將大氣氧從反應(yīng)中排除。通過(guò)任一方法制得的抗體均稱作“松馳”抗體。無(wú)論哪種方法制得的產(chǎn)物都應(yīng)盡可能快地用于隨后的反應(yīng)，或者在避免暴露于氧的條件(優(yōu)選在惰性氣氛下)和約0℃下貯存。
從反應(yīng)中排除氧的方法(即在惰性氣氛下進(jìn)行反應(yīng))中，使配位體(抗體)與過(guò)量一摩爾的DTT一起保溫約30分鐘至約4小時(shí)(優(yōu)選約3小時(shí))。依據(jù)所需的巰基數(shù)量，DTT/配位體的比率范圍可以是約1∶1～20∶1，優(yōu)選為約4∶1～10∶1，尤其優(yōu)選約5∶1～7∶1。對(duì)于有氧存在下進(jìn)行的還原反應(yīng)，DTT/配位體的摩爾比率范圍為約50∶1～400∶1，優(yōu)選約200∶1～300∶1。后一反應(yīng)在約20℃～50℃(優(yōu)選約37℃)的溫度下進(jìn)行約1～4小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行1.5小時(shí)。在pH為約6～8(優(yōu)選約7～7.5)時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。然后用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)(例如透析、過(guò)濾和/或色譜法)純化產(chǎn)物。優(yōu)選的純化方法為透濾法。在純化和貯存期間，為防止巰基的再氧化，產(chǎn)物優(yōu)選保持在避免暴露于氧的惰性氣氛和約0℃的條件下。
為制備最終的式(Ⅰa)軛合物，使還原的抗體與式(Ⅱb)腙中間體反應(yīng)。優(yōu)選在惰性氣氛于約0℃～10℃(優(yōu)選于約4℃)和約6～8(優(yōu)選約7.5)的pH條件下進(jìn)行反應(yīng)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如透析、過(guò)濾或色譜法)純化免疫軛合物或硫醚軛合物。
根據(jù)本發(fā)明，首先提供了第一種制備相對(duì)純的式Ⅰ結(jié)構(gòu)的硫醚軛合物的方法， 其中n是約1～10的整數(shù)，q是約4～10的整數(shù)，優(yōu)選7～9，并且MAb是一種免疫球蛋白(單克隆或多克隆抗體、優(yōu)選單克隆抗體)配位體，包括BR96抗體;該方法包括下列步驟(a)提供一種在pH為約4～6.5(優(yōu)選約5～6)的檸檬酸鹽緩沖液中的式Ⅱ結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白硫醚;
(b)用pH為約6～10(優(yōu)選約8～10)的磷酸鹽緩沖液的溶液處理所述的檸檬酸鹽緩沖的免疫球蛋白硫醚(Ⅱ)，得到pH為約6～9(優(yōu)選約7～8)的免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液;
(c)在還原步驟中，在惰性氣體(例如氬)氣氛下，用pH為約6～10(優(yōu)選約7～8)的還原劑(優(yōu)選二硫蘇糖醇(DTT))的磷酸鹽緩沖溶液處理所述的緩沖的免疫球蛋白硫醚，形成式Ⅲ結(jié)構(gòu)的還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液，所得的緩沖溶液pH為約6～9(優(yōu)選約7～8);
(d)在降低的溫度(例如在約-5～25℃，優(yōu)選約0℃)下，在惰性氣氛中，透濾所述還原型免疫球蛋白的溶液;
(e)在透濾純化步驟期間任意濃縮該還原型免疫球蛋白的緩沖溶液;
(f)在軛合步驟中，在惰性氣氛下使該還原型免疫球蛋白的透濾純化溶液與式Ⅳ結(jié)構(gòu)的阿霉素腙的溶液反應(yīng)，
形成式Ⅰ的硫醚軛合物粗品，該反應(yīng)優(yōu)選在氬氣氛下進(jìn)行約10～60分鐘并且相對(duì)于還原型免疫球蛋白硫醚的每當(dāng)量硫醇，阿霉素腙的使用量為約1.0～1.5當(dāng)量;
(g)純化式Ⅰ的硫醚軛合物;并且(h)收集相對(duì)純的式Ⅰ硫醚軛合物。
上述方法示于在下文將詳細(xì)討論的反應(yīng)流程Ⅲ和Ⅳ中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了第二種制備相對(duì)純的式Ⅰ的硫醚軛合物的方法，該方法包括下列步驟(a)在緩沖液交換步驟中，用pH為約6～10(優(yōu)選約6～9，更優(yōu)選約7～8)的磷酸鹽緩沖液透濾pH為約5～6的檸檬酸鹽緩沖的式Ⅱ免疫球蛋白硫醚，得到pH為約6～9(優(yōu)選約7～8)的免疫球蛋白硫醚的磷酸鹽緩沖溶液;
(b)在透濾步驟(a)之前或之后，任意濃縮所述免疫球蛋白硫醚的溶液;
(c)在還原反應(yīng)步驟中，在惰性氣氛例如氬氣氛下，用還原劑[例如二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇，優(yōu)選二硫蘇糖醇(DTT)]的磷酸鹽緩沖溶液處理所述免疫球蛋白硫醚的磷酸鹽緩沖溶液(優(yōu)選MAb∶DTT摩爾比率為1∶5)，生成式Ⅲ的還原型免疫球蛋白的緩沖溶液;
(d)在惰性氣氛例如氬氣氛下，使式Ⅲ的還原型免疫球蛋白的所述磷酸鹽緩沖溶液與式Ⅳ的阿霉素腙反應(yīng)，生成式Ⅰ的硫醚軛合物粗品;
(e)純化該式Ⅰ的硫醚軛合物粗品;并且(f)收集相對(duì)純的式Ⅰ的硫醚軛合物。
上述反應(yīng)方法示于在下文將詳細(xì)討論的在反應(yīng)流程Ⅲ和Ⅴ中。
反應(yīng)流程Ⅳ和Ⅴ中概述的任一方法中，免疫球蛋白硫醚的磷酸鹽緩沖溶液可任意用螯合劑(例如乙二胺四乙酸)處理，以除去在緩沖液、免疫球蛋白硫醚和/或反應(yīng)容器中可能存在的金屬雜質(zhì)。
在上述方法中，在使式Ⅱ的免疫球蛋白硫醚還原成式Ⅲ的免疫球蛋白硫醚之前，必須將式Ⅱ的免疫球蛋白硫醚的pH調(diào)節(jié)至約7～8。在第一種方法(反應(yīng)流程Ⅳ)中，通過(guò)加入磷酸鹽緩沖液，使原來(lái)(用檸檬酸鹽緩沖)的式Ⅱ硫醚的pH在約5～6的范圍變?yōu)?用磷酸鹽緩沖)在約7～8的范圍，通過(guò)這種方法，在還原反應(yīng)之前或期間進(jìn)行由檸檬酸鹽至磷酸鹽的緩沖液交換，制得式Ⅲ的還原型硫醚;而在第二種方法(反應(yīng)流程V)中，在還原反應(yīng)之前的透濾步驟中，使原來(lái)(用檸檬酸鹽緩沖)pH值為約5～6范圍的式Ⅱ硫醚的pH改變成為(用磷酸鹽緩沖)在約7～8范圍內(nèi)。
另外根據(jù)本發(fā)明，使用以前從未用于純化所述物質(zhì)的幾種不同的新方法純化式Ⅰ的硫醚軛合物粗品。
在第一種純化新方法中，首先用例如乙酸纖維素膜將式Ⅰ的硫醚軛合物粗品進(jìn)行過(guò)濾，使溶液澄清，然后與碳或炭在降低的溫度下混合，并按下文詳細(xì)敘述的方法過(guò)濾。
在第二種純化新方法中，將式Ⅰ的硫醚軛合物粗品用Bio-BEADTMSM-2(用于增加疏水性相互作用，Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)用一批法處理/純化，然后濾除并以基本上純的形式收集。
在第三種純化新方法中，通過(guò)用凝膠過(guò)濾離子交換或疏水性相互作用的柱色譜法純化式Ⅰ的硫醚軛合物粗品。SEPHADEXTMG-25(凝膠過(guò)濾介質(zhì))是優(yōu)選的凝膠過(guò)濾用介質(zhì);CM SEPHADEXTMC-25是優(yōu)選的離子交換用介質(zhì)，而B(niǎo)io-BEADSTM是優(yōu)選的疏水性相互作用用介質(zhì)。
在第四種純化新方法中，式Ⅰ的硫醚軛合物粗品優(yōu)選采用帶有再生的乙酸纖維素膜的Amicon攪拌池或者帶有再生的乙酸纖維素柱體的AmiconCH2RS透析器或者帶有聚醚砜盒(cassettes)的FiltronCentrasette，經(jīng)透濾法或透析法純化。也可以將式Ⅰ的硫醚軛合物粗品通過(guò)聚砜或親水性聚丙烯腈進(jìn)行純化。
另外，根據(jù)本發(fā)明，還提供一種制備用于制備式Ⅰ的硫醚軛合物的中間體的方法，該方法如下文反應(yīng)流程Ⅰ中所概述，并包括下列步驟(a)在弱有機(jī)酸(優(yōu)選乙酸)存在下，使馬來(lái)酐A與式B結(jié)構(gòu)的氨基酸反應(yīng)，
(其中n是1至約10的整數(shù)，優(yōu)選為5)，生成一種酸縮合產(chǎn)物C (b)在弱有機(jī)堿(優(yōu)選三乙胺)和惰性有機(jī)溶劑(優(yōu)選乙腈)存在下，用環(huán)合劑(例如甲硅烷基化試劑，優(yōu)選三甲基氯硅烷)處理酸C，形成D(其優(yōu)選是馬來(lái)酰亞氨基己酸)
(c)將D進(jìn)行結(jié)晶，形成環(huán)化的結(jié)晶的酸D;
(d)在N-甲基嗎啉和惰性有機(jī)溶劑(例如四氫呋喃)和肼基甲酸烷基酯(優(yōu)選肼基甲酸叔丁酯)存在下用偶聯(lián)試劑(優(yōu)選氯甲酸異丁酯)處理D，將環(huán)化的結(jié)晶的酸D進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，生成肼基甲酸酯E (e)用酸(優(yōu)選三氟乙酸)處理，將肼基甲酸酯E脫保護(hù)，生成中間體酰肼鹽F， 另外，酸D可按下法制備在惰性氣氛(例如氬或氮)下，使酸B在冰乙酸或其它酸(例如甲酸或丙酸)中的溶液與馬來(lái)酐A在冰乙酸中的溶液反應(yīng)，直接形成酸D。
如反應(yīng)流程Ⅱ所示，按Willner等人1992年1月23日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第824 951號(hào)所述方法，將阿霉素·HCl(G)與酰肼鹽F縮合，生成阿霉素腙Ⅳ。
按下文所示的反應(yīng)流程Ⅰ～Ⅴ中概述的方法可進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中闡述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
反應(yīng)流程Ⅰ
反應(yīng)流程Ⅱ
反應(yīng)流程Ⅲ
軛合物Ⅰ
反應(yīng)流程Ⅳ
反應(yīng)流程Ⅴ
如反應(yīng)流程Ⅰ所示，按下法制備原料酰肼鹽F使馬來(lái)酐A在弱酸例如乙酸、甲酸或丙酸(優(yōu)選乙酸)中的溶液與氨基酸B(其優(yōu)選為6-氨基己酸(式B，其中n為5)在弱有機(jī)酸例如乙酸或任何所述的其它酸(其中溶解A)(優(yōu)選乙酸)中的溶液反應(yīng)，得到二酸C。采用約5∶1～0.5∶1(優(yōu)選約2∶1～1∶1)范圍內(nèi)的B∶A摩爾比率進(jìn)行上述反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為約1～10小時(shí)，優(yōu)選為約3～5小時(shí)。
將溶解在惰性有機(jī)溶劑(例如乙腈、乙醚、四氫呋喃、二甲基甲酰胺或甲苯，優(yōu)選乙腈)中的二酸C用環(huán)合劑(例如三甲基氯硅烷(TMSCL)、六甲基二硅氮烷或類似的甲硅烷基化試劑，優(yōu)選三甲基氯硅烷)和弱有機(jī)堿(例如三乙胺或二異丙基乙基胺，優(yōu)選三乙胺)處理。上述環(huán)合反應(yīng)采用約10∶1～1∶1(優(yōu)選約5∶1～3∶1)范圍內(nèi)的環(huán)合劑二酸C的摩爾比率，在約25～110℃(優(yōu)選50～90℃)的溫度下進(jìn)行約1～10小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行約3～5小時(shí)。
無(wú)需應(yīng)用柱色譜法，便可以基本上純的形式分離得到的酸D，其優(yōu)選為馬來(lái)酰亞氨基己酸。優(yōu)選的分離方法是結(jié)晶法，例如用乙酸乙酯和己烷、或者丙酮和異丙醚結(jié)晶。
另外，酸D可用一步法按下法制備使馬來(lái)酐A在冰乙酸、甲酸或丙酸(優(yōu)選冰乙酸)中的溶液與氨基酸B在冰乙酸、甲酸、丙酸或乙酸酐(優(yōu)選冰乙酸)中的溶液在惰性氣氛例如氬或氮(優(yōu)選氬)氣氛下反應(yīng)。
使用的A和B的摩爾比率可以和上述制備D的兩步法中所述比率相同。
反應(yīng)在約25～150℃(優(yōu)選約100～125℃)溫度下進(jìn)行約1～10小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行約3～5小時(shí)。
環(huán)合的酸D按下法進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成肼基甲酸酯E將酸D在無(wú)水惰性有機(jī)溶液例如四氫呋喃(THF)、乙醚或乙腈中的溶液(約-15～15℃的降低的溫度，優(yōu)選約0～4℃)用4-甲基嗎啉、三乙胺或二異丙基乙基胺在無(wú)水溶劑(例如上述D中說(shuō)明的溶劑，優(yōu)選THF)和氯甲酸烷基酯如氯甲酸異丁酯或新戊酰氯在無(wú)水溶劑(例如上述D中說(shuō)明的溶劑，優(yōu)選THF)中的溶液(約-5～5℃的溫度范圍，優(yōu)選約0～4℃)處理。然后向反應(yīng)混合物中加入肼基甲酸烷基酯(優(yōu)選肼基甲酯叔丁酯)在無(wú)水溶劑(例如上述D中說(shuō)明的溶劑，優(yōu)選THF)中的溶液。反應(yīng)在約0～25℃(優(yōu)選約4～25℃)的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約10～30小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行約10～24小時(shí)。使用的4-甲基嗎啉或等同物、氯甲酸烷基酯和肼基甲酸烷基酯對(duì)酸D的摩爾比率范圍各自獨(dú)立地為約0.5∶1～5∶1，優(yōu)選為約2∶1～1∶1。通過(guò)結(jié)晶法，可以用乙酸乙酯和己烷或者其它溶劑混合物分離肼基甲酸酯E。
然后將得到的肼基甲酸酯E脫保護(hù)，其方法是在約-15～25℃(優(yōu)選約0～4℃)的溫度范圍內(nèi)，將E與酸例如三氟乙酸、鹽酸、對(duì)甲苯磺酸或氫溴酸反應(yīng)約1～24小時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)約2～5小時(shí)。優(yōu)選的馬來(lái)酰亞氨基己酰肼TFA鹽可通過(guò)用叔丁基甲基醚或乙醚沉淀而分離。
參見(jiàn)反應(yīng)流程Ⅱ，阿霉素的腙(Ⅳ)按下法制備在惰性氣氛例如氬或氮(優(yōu)選氬)氣氛下，在暗處使阿霉素鹽酸鹽G、酰肼鹽F(優(yōu)選馬來(lái)酰亞氨基己酰肼鹽)和酸(例如三氟乙酸、鹽酸或乙酸，優(yōu)選三氟乙酸)在無(wú)水醇(例如甲醇、乙醇或異丙醇，優(yōu)選甲醇)中反應(yīng)。該反應(yīng)進(jìn)行約1～10小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行約3～5小時(shí)。
可以分離阿霉素腙產(chǎn)物Ⅳ，其方法是在降低的溫度下，例如在約0～10℃(優(yōu)選約2～4℃)下，加入乙酸乙酯、乙腈或四氫呋喃使之直接沉淀，然后過(guò)濾收集并將產(chǎn)物用冷溶劑例如甲醇-乙酸乙酯混合物洗，接著用乙腈洗，并真空干燥。
再參見(jiàn)反應(yīng)流程Ⅲ和Ⅳ，在本發(fā)明方法的第一實(shí)施方案中按下法制備式Ⅰ結(jié)構(gòu)的阿霉素BR96軛合物將堿金屬磷酸鹽例如磷酸氫二鈉的溶液(將Na2HPO4溶解在注射用水(WFI)中制備)(pH范圍為約8～10，優(yōu)選約8.5～9.5)加至單克隆抗體BR96(式Ⅱ)在檸檬酸鹽緩沖液(CBS)(優(yōu)選約10～75mM檸檬酸鈉和約50～500mM氯化鈉)中的溶液。檸檬酸鹽緩沖液(CBS)pH范圍為約4～6.5，優(yōu)選為約5～6.5，更優(yōu)選為約5～6，得到pH為約6～9(優(yōu)選約7～8)的BR96 MAb溶液。得到的BR96 MAb溶液用氬清洗，以使O2含量降低至約10%以下(優(yōu)選約5%以下)。
還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇(優(yōu)選二硫蘇糖醇(DTT))在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的溶液是優(yōu)選的。PBS緩沖液的pH范圍為約6～10，優(yōu)選為約7～8，它由約1～25mM磷酸鈉和約50～250mM氯化鈉(約0.005M～0.02M磷酸鈉和約0.05M～0.2M氯化鈉)組成(其制備方法是約1～5mM NaH2PO4·H2O、約5～15mM Na2HPO4和約50～200mM NaCl中加適量水至一升，并加入1N NaOH直至pH為約7.0～8.0)。
另外，磷酸鹽緩沖液可由下列成份形成
約50～200mM(0.04～0.4重量%)KCl，約5～15mM(約0.4～4重量%)Na2HPO4，約1～5mM(約0.04～0.4重量%)KH2PO4·H2O，水適量至一升，加入1NKOH至pH為約7～8。
還原劑(優(yōu)選DTT)在磷酸鹽緩沖液中的溶液與BR96MAbⅡ的溶液反應(yīng)，摩爾比率(還原劑Ⅱ)的范圍為約10∶1～5∶1，優(yōu)選為約9∶1～6∶1，反應(yīng)溫度為約25～45℃，優(yōu)選為約30～40℃，反應(yīng)時(shí)間為約1～5小時(shí)，優(yōu)選為約2～3小時(shí)。上述反應(yīng)在惰性氣氛(優(yōu)選氬)下進(jìn)行。
形成的還原型BR96MAbⅢ MAb-(SH)7-9與氬氣清洗的磷酸鹽緩沖液混合，然后在氬氣氛下用Waters，Amicon或Filtron透濾系統(tǒng)進(jìn)行透濾/濃縮，以除去雜質(zhì)。
純化的還原型BR96MAb再與阿霉素腙Ⅳ在惰性氣氛(例如氬)在約-5～25℃(優(yōu)選約0～5℃)的溫度下進(jìn)行軛合反應(yīng)，采用還原型BR96 MAb∶Ⅳ的摩爾比率范圍為約1∶4～1∶11，優(yōu)選為約1∶8～1∶10。
參見(jiàn)反應(yīng)流程Ⅲ和Ⅴ，式Ⅰ結(jié)構(gòu)的阿霉素BR96軛合物在本發(fā)明方法的第二實(shí)施方案中按下法制備如本文所述，用透析膜(優(yōu)選Filtron Minisette)，將BR96MAb(Ⅱ)在pH為約4～6(優(yōu)選約5.0～5.5)的檸檬酸鹽緩沖的鹽水(CBS)(相對(duì)本發(fā)明方法的第一實(shí)施方案所述)中的溶液用磷酸鹽緩沖液(PBS)(相對(duì)本發(fā)明方法的第一實(shí)施方案所述)進(jìn)行透濾，采用的檸檬酸鹽緩沖的BR96MAb與磷酸鹽緩沖液的比率為1∶5，比率范圍為約0.5∶1～0.125∶1(優(yōu)選約0.33∶1～0.2∶1)。形成的濃度為約5～15mg/ml的磷酸鹽緩沖的BR96MAb(Ⅱ)用還原劑(優(yōu)選二硫蘇糖醇(DTT)在磷酸鹽緩沖液中的溶液)處理，使用的Ⅱ∶DTT的摩爾比率范圍為約0.1∶1～1∶1，優(yōu)選為0.12∶1～0.2∶1。上述反應(yīng)在惰性氣氛(例如氬)于約25～45℃(優(yōu)選約30～40℃)的溫度下進(jìn)行約1～6(優(yōu)選約3～4)小時(shí)。
然后如第一實(shí)施方案(反應(yīng)流程Ⅳ)中所述，將還原型BR96MAb(Ⅲ)與阿霉素腙Ⅳ反應(yīng)，生成軛合物粗品Ⅰ，它可按本文所述方法純化。
從上文中可清楚看出，在本發(fā)明方法的第一實(shí)施方案中，在將免疫球蛋白硫醚Ⅱ還原后，并在其與阿霉素腙Ⅳ進(jìn)行軛合反應(yīng)之前，將還原型抗體Ⅲ進(jìn)行緩沖液交換(用磷酸鹽緩沖液處理)和純化;而在本發(fā)明方法的第二實(shí)施方案中，在將免疫球蛋白硫醚Ⅱ還原成Ⅲ后，直接進(jìn)行與腙Ⅳ的軛合反應(yīng)步驟。
本發(fā)明方法的第二實(shí)施方案可包括任意濃縮檸檬酸鹽緩沖的免疫球蛋白硫醚Ⅱ，該濃縮通過(guò)連續(xù)透濾(透析)步驟進(jìn)行直至得到所需的濃度，優(yōu)選濃度范圍為約10～30mg/ml免疫球蛋白硫醚。
應(yīng)注意到，在第二實(shí)施方案中可以使用更少的還原劑(DTT)，但完成反應(yīng)的時(shí)間將增長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明，從反應(yīng)流程Ⅳ和Ⅴ中形成的軛合物粗品Ⅰ可以通過(guò)本文所述的任一技術(shù)(包括使用炭、柱色譜、透析和/或Bio-BEADSTM)純化，例如軛合物粗品可通過(guò)乙酸纖維素膜過(guò)濾澄清，然后在惰性氣氛(例如氬)于約0～20℃(優(yōu)選約0～5℃)的溫度下用炭處理。
適于本發(fā)明使用的炭實(shí)例包括1.NORITTMSX-3(優(yōu)選的)2.DARCOTMG603.ADPTMPULVERIZED4.NORITTMA SUPRA5.MORITTMB SUPRA6.NORITTMUSP 22另外，根據(jù)本發(fā)明，采用下列任一方法，通過(guò)透濾或透析法，可以純化軛合物粗品Ⅰ。
透濾法1.小規(guī)模(＜3.0克規(guī)模)a.帶有再生的乙酸纖維素膜的Amicon攪拌池b.帶有聚醚砜膜的Filtron攪拌池，2.大規(guī)模(＞3.0克規(guī)模)a.帶有再生的乙酸纖維素螺柱體的AmiconCH2RS透析器(優(yōu)選的)，b.帶有再生的乙酸纖維素螺柱體的AmiconDC1OL透析器，c.帶有聚醚砜盒的FiltronMinisette，d.帶有聚醚砜盒的FiltronCassettes.
在氬氣氛下于約0～25℃的溫度下進(jìn)行軛合物Ⅰ的透濾。
另外，根據(jù)本發(fā)明，軛合物粗品Ⅰ還可通過(guò)應(yīng)用Bio-BEADSTM用柱色譜法進(jìn)行純化，或者優(yōu)選用一批法純化，其中將軛合物粗品優(yōu)選與Bio-BEADSTMSM-2(由Bio-Rad Laboratories用聚苯乙烯二乙烯基苯制得)一起在惰性氣氛(例如氬)下于約0～25℃(優(yōu)選約0～25℃)的溫度下攪拌約5～120分鐘，優(yōu)選攪拌約10～30分鐘。
另外，根據(jù)本發(fā)明，軛合物粗品Ⅰ可利用使用下列方法的柱色譜來(lái)純化Ⅰ.用下列任一凝膠進(jìn)行凝膠過(guò)濾1.SEPHADEXTMG-25 MEDIUM2.SEPHADEXTMG-50 MEDIUM3.SEPHADEXTMG-25 SUPER FINE(SF)4.SEPHACRYLTMS-100 HR5.SUPEROSETM12 PG6.ULTRAGELTMACA 2027.TRYSACRYLTMGF 05;
Ⅱ.用下列任一凝膠進(jìn)行離子交換1.CM SEPHAROSETMFAST FLOW2.CM SEPHADEXTMG-253.CM SEPHADEXTMG-50;或通過(guò)Ⅲ.用下列任一材料進(jìn)行疏水性相互作用1.BIO-BEADSTMSM-22.BIO-BEADSTMSM-73.BIO-BEADSTMSM-164.PHENYL SEPHAROSETM6 FAST FLOW優(yōu)選用CM SEPHADEXTMC-50 SEPHADEXTMG-25 SF和 CM SEPHADEXTMC-25純化軛合物Ⅰ。
CM SEPHADEXTMC-25尤其優(yōu)選用于大規(guī)模純化，例如用于5.0g或更大規(guī)模的純化。
通過(guò)柱色譜法進(jìn)行軛合物Ⅰ的純化如下在約0～5℃的溫度下將在磷酸鹽緩沖液(pH為約7～8)中的軛合物粗品裝樣于柱上，用磷酸鹽緩沖液以約45～85ml/分鐘的體積流速洗脫軛合物。
關(guān)于優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明方法的最優(yōu)選方面是制備式(Ⅰ)的免疫軛合物，該免疫軛合物中的藥物部分是阿霉素，配位體部分選自BR96MAb、松馳型BR96抗體、嵌合型BR96 MAb、以及它們的抗原識(shí)別片段。該實(shí)施方案的最優(yōu)選的配位體是嵌合型BR96 MAb，尤其是松馳的嵌合型BR96 MAb，以及它們的抗原識(shí)別片段。
按本發(fā)明方法制備的軛合物能夠靶向定位于選定的細(xì)胞群，因而和阿霉素或其衍生物一樣可以治療其相同的疾病，包括腫瘤疾病例如癌、病毒或其它病原體的感染、自身免疫性疾病以及其它的使用阿霉素的疾病。
按本發(fā)明方法制備的軛合物以藥物制劑的形式對(duì)患者給藥，該藥物制劑包含式(Ⅰ)的軛合物和藥學(xué)上適用的載體、賦形劑或稀釋劑。所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上適用的”是指可用于治療或診斷溫血?jiǎng)游锢缛?、馬、豬、牛、鼠、犬、貓或其它哺乳動(dòng)物以及鳥(niǎo)或其它溫血?jiǎng)游锏哪切┧巹?。給藥的優(yōu)選方式是非胃腸道途徑，尤其是通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或淋巴內(nèi)途徑。該制劑可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟練的載體、稀釋劑或賦形劑制備。在這方面可參見(jiàn)例如由Osol等人編緝的Remington′s PharmaceuticalSciences，16thed.，1980，MackPublishingCompany。所述組合物可包括蛋白質(zhì)(例如血清蛋白如人血清白蛋白)、緩沖劑或緩沖物質(zhì)例如磷酸鹽、其它鹽，或電解質(zhì)等等。合適的稀釋劑可包括例如無(wú)菌水、等滲鹽水、右旋糖稀水液、多元醇或所述醇的混合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)。制劑中可含有防腐劑，例如苯乙醇、羥苯甲酸甲酯和對(duì)羥苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水楊酸鈉等。必要時(shí)制劑可含有0.05～約0.2重量%的抗氧化劑，例如焦亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鈉。
對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，將優(yōu)選如此制備制劑，以使得對(duì)患者的給藥量為約0.01～1g所需的軛合物Ⅰ。優(yōu)選的給藥量范圍為約0.2～1g軛合物Ⅰ。依據(jù)各種因素例如待治療的疾病狀態(tài)或待改善的生物學(xué)效果、軛合物的給藥方式、患者的年齡、體重和身體狀況以及治療醫(yī)生決定的其它因素，軛合物Ⅰ在很寬的劑量范圍都是有效的。因此，對(duì)任何具體患者的給藥量都必須以其個(gè)體為基礎(chǔ)作出決定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，雖然以下實(shí)施例闡述了具體試劑和反應(yīng)條件，但仍可作出變化，這些變化均包括在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)。然而下列實(shí)施例闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例12，5-二氫-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸A.(Z)-6-[(3-羧基-1-氧代-2-丙烯基)-1-氨基]己酸于室溫在約15分鐘內(nèi)將馬來(lái)酐(15.0g，0.15mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液加至6-氨基己酸(19.65g，0.15mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液中并于室溫?cái)嚢?小時(shí)。過(guò)濾白色沉淀，用冷水洗滌并于50℃在真空烘箱內(nèi)干燥2天，制得33.00g標(biāo)題化合物，產(chǎn)率9.5%。該物料無(wú)需任何進(jìn)一步的純化直接用于下一步反應(yīng)步驟。
m.p.170～172℃。TLCRf＝0.47，硅膠，MeOH-CHCl3(1∶1)，PMA噴霧顯色。
B.2，5-二氫-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸于室溫向A部分的化合物(3g，0.013mol)在乙腈(90ml)中的溶液中依次滴加三甲基氯甲硅烷(8.3ml，0.065mol)和三乙胺(9ml，0.06mol)。然后將均相混合物于回流溫度加熱7小時(shí)。冷卻至室溫后，過(guò)濾沉淀的固體(三乙胺鹽酸鹽)并在真空下濃縮濾液，得到棕色固體。殘余物溶解在二氯甲烷(75ml)中并用中性Norit(1.5g)沸騰20分鐘。將混合物經(jīng)硅藻土墊過(guò)濾并用熱的二氯甲烷(25ml)洗滌。真空濃縮合并的濾液，得到1.4g(50%)產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用丙酮和異丙醚(1∶2)結(jié)晶，得到0.91g標(biāo)題化合物，產(chǎn)率32%。m.p.83-85℃，TLCRf＝0.26，硅膠，MeOH-CHCl3(5∶95)，PMA噴霧顯色。
實(shí)施例2阿霉素(Dox)的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙A.2，5-二氫-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酸于室溫和氬氣氛下，在10分鐘內(nèi)將6-氨基己酸(20g，0.153mol)在冰乙酸(100ml)中的溶液加至馬來(lái)酐(15.0g，0.153mol)在冰乙酸(300ml)中的溶液內(nèi)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將白色均相反應(yīng)混合物回流5小時(shí)。50℃真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去大部分乙酸。用甲苯減壓共蒸餾除去殘余的乙酸。將棕色殘余物(40g)溶解在二氯甲烷(250ml)中并用中性炭(20g)沸騰20分鐘。熱的混合物經(jīng)硅藻土墊過(guò)濾并用熱的二氯甲烷(2×75ml)洗滌。真空濃縮合并的濾液，得到33g褐色產(chǎn)物粗品。將產(chǎn)物粗品在EtOAc和己烷(1∶1)中結(jié)晶，分三批共得到13g產(chǎn)物。在EtOAc和己烷(1∶1)中重結(jié)晶，得到9.8g馬來(lái)酰亞氨基己酸，產(chǎn)率30%，m.p.82～84℃;TLCRf＝0.25，硅膠，MeOH-CHCl3(5∶95)，PMA噴霧顯色。
B.2-[6-(2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]肼基甲酸1，1-二甲基乙酯0～4℃下向A部分化合物(15.0g 70mmol)的無(wú)水THF(500ml)溶液中依次加入4-甲基嗎啉(7.7ml，70mmol)的無(wú)水THF(20ml)溶液和氯甲酸異丁酯(9.1ml，70mmol)的無(wú)水THF(20ml)溶液。于0℃攪拌15分鐘后，向反應(yīng)中緩慢加入(約10分鐘)肼基甲酸叔丁酯(9.24g，70mmol)的無(wú)水THF(30ml)溶液。將淺黃色均相混合物于0℃攪拌1小時(shí)，于室溫?cái)嚢?4小時(shí)。用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將反應(yīng)混合物濃縮至干。殘余物溶解在EtOAc(200ml)中并依次用水(2×100ml)、冰冷的0.01N HCl(100ml)、5%碳酸氫鈉(100ml)和水(2×100ml)洗滌。用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到黃色油狀產(chǎn)物粗品(19.75g)，該產(chǎn)物經(jīng)快速色譜法(硅膠230-400目)純化，依次用35%EtOAc/己烷、50%EtOAc/己烷和75%EtOAc/己烷洗脫。合并合適的級(jí)份并真空下濃縮，得到19.6g(85%)粘稠油狀標(biāo)題肼基甲酸酯;TLCRf＝0.28(S.M.Rf＝0.35)，硅膠，EtOAc/己烷(7∶3)，PMA噴霧顯色。
C.2，5-二氧代-1H-吡咯-1-己酰肼三氟乙酸鹽于0℃將B部分的肼基甲酸酯(16.9g)溶解在三氟乙酸(60ml)中并在相同的溫度下攪拌3小時(shí)。30℃高真空下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去過(guò)剩的三氟乙酸。將油狀殘余物在0℃下用乙醚(150ml)研制，并在同一溫度下攪拌2小時(shí)。過(guò)濾白色沉淀，用乙醚(50ml)洗滌并高真空下干燥過(guò)夜，得到15.0g(由A部分化合物計(jì)，65.3%)C部分的化合物;m.p.107～110℃;TLCRf＝0.35(S.M.Rf＝0.60)，硅膠，MeOH-CH2Cl2(1∶9)，UV和PMA噴霧顯色。
D.阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙室溫氬氣氛下，將阿霉素鹽酸鹽(5.0g，8.6mmol)、C部分的馬來(lái)酰亞氨基己酰肼鹽(8.75g，25.81mmol)和三氟乙酸(0.5ml，6.49mmol)在無(wú)水甲醇(1.8L)中的混合物在暗處攪拌16小時(shí)。用反相HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)近于完全后，于30℃減壓下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上直接在暗處將混合物濃縮至約200ml。攪拌的同時(shí)向產(chǎn)物的甲醇溶液中緩慢加入無(wú)水乙腈(2L)，析出標(biāo)題化合物。于0～4℃保持12小時(shí)使沉淀完全。用中等孔徑的多孔濾片在布氏漏斗上過(guò)濾產(chǎn)物。暗紅色的產(chǎn)物用冷MeOH-CH3CN(1∶9，500ml)混合液洗滌并真空下干燥3～4小時(shí)，得到6.36g(93%)標(biāo)題阿霉素腙。將上述產(chǎn)物溶解在甲醇(約200ml)中，如前述用無(wú)水乙腈(2L)重新沉淀，使之進(jìn)一步純化。過(guò)濾分離并干燥，得到5.42g(82%)n標(biāo)題化合物;mp182～184℃;TLCRf＝0.46，硅膠，MeOH-CHCl3-AcOH(3∶7∶0.1)，2份洗脫物，UV、PMA和AA噴霧顯色;HPLCHI 95.4%(Rt＝15.92)，Ⅱ2.9%阿霉素鹽酸鹽。
實(shí)施例3阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙在5L三頸園底燒瓶中和冷卻(冰水浴)攪拌下，向阿霉素鹽酸鹽(10.0g，17.24mmol)在無(wú)水甲醇(400ml)中的紅色懸浮液中一次性加入實(shí)施例2C部分的馬來(lái)酰亞氨基己酰肼三氟乙酸鹽(17.53g51.72mmol)，接著加入無(wú)水甲醇(40μl)中的三氟乙酸(8μl，0.1mmol)。在同一溫度下將形成的混合物攪拌5小時(shí)。反應(yīng)完全后，保持溫度于0～4℃，在3小時(shí)內(nèi)經(jīng)加料漏斗小心加入冷的(0～4℃)乙酸乙酯(4L)，同時(shí)緩慢攪拌。在有中等孔徑的多孔濾片的布氏漏斗上過(guò)濾紅色沉淀。該亮紅色固體用冷的(0-4℃)MeOH-EtOAc混合物(1∶9;6×200ml)接著用乙腈(6×200ml)洗滌。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至500ml燒杯中，真空(～0.3mmHg)中干燥2.4小時(shí)，得到13.23g標(biāo)題阿霉素腙。上述產(chǎn)物進(jìn)一步在真空(～0.3mmHg，45℃)中干燥24小時(shí)，得到13.13g產(chǎn)物，產(chǎn)率97%，HI99.4%，IR0.4%(阿霉素)和0.2%(未知的雜質(zhì))。
實(shí)施例4阿霉素-BR96軛合物(BR96單克隆抗體與阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙的軛合物)1.用DTT還原BR96，生成BR96 MAb(SH)7-9在12L三頸圓底燒瓶中，在機(jī)械攪拌下，在約20分鐘內(nèi)向6000ml濃度為約10mg/ml的單克隆抗體BR96在檸檬酸鹽緩沖鹽水(CBS緩沖液，25mM檸檬酸鈉和250mM氯化鈉，pH＝5.5)中的溶液中加入磷酸鈉飽和溶液(二代鹽，約2155ml，pH～9.0)。該溶液用超純無(wú)菌過(guò)濾的氬氣持續(xù)清洗約1小時(shí)。清洗完畢時(shí)，抗體溶液中溶解的氧含量低于5%。測(cè)定(a)了抗體濃度(7.327mg/ml，59.76g，0.3734mmol)。室溫下約5分鐘內(nèi)向該混合物中加入二硫蘇糖醇溶液(262.5ml，0.01MPBS(b)溶液，2.625mmol，7.03摩爾當(dāng)量)，同時(shí)攪拌。然后在氬氣氛下在水浴中于36-38℃(內(nèi)溫)下將反應(yīng)混合物緩慢攪拌2小時(shí)使還原反應(yīng)完全。將該還原型抗體轉(zhuǎn)移至冷室(4°)中透濾。
注a.用Perkin Elmer Lambda 6UV/可見(jiàn)分光光度計(jì)以280nm處的UV吸收測(cè)定抗體濃度(mg/ml);1mg/ml＝1.4吸光度單位。
抗體的摩爾濃度計(jì)算如下MC抗體＝ (mg/ml)/160000其中160000是抗體的摩爾重量。
b.按下法制備PBS緩沖液，pH＝7.8(0.01M磷酸鈉和0.1M氯化鈉)NaH2PO4·H2O 0.14gNa2HPO41.28gNaCl5.85g水(WFI)適量，加至1升1NNaOH約0.5ml(加至pH為7.8)通過(guò)0.22μ乙酸纖維素膜過(guò)濾。
2.還原型BR96的透濾將第1部分的還原型抗體轉(zhuǎn)移至20L帶塞的聚丙烯壇內(nèi)，在該壇中已在氬氣氛下用蠕動(dòng)泵泵入了三升氬氣清洗的PBS緩沖液。在氬氣氛下將壇中形成的溶液(～11L)用Filtron Centrasette透濾/濃縮單元(c)濃縮至約6L。然后將濃縮的溶液(6L)在用電磁攪拌器緩慢攪拌的同時(shí)用24L氬氣清洗的PBS緩沖液進(jìn)行透濾。濾液的流速為約1.1L/分鐘。透濾了總共5倍體積(30L)后，將還原型抗體(5520ml)在氬氣氛下轉(zhuǎn)移至12L三頸圓底Morton燒瓶中。測(cè)定SH(d)和抗體(a)的濃度。
注c.由316L不銹鋼制造的Centrasette透濾單元購(gòu)自Filtron。使用兩塊總表面積為10平方英尺的Omega30K膜(用聚醚砜制備)。用裝配15.9mmBioprene管的Watson-Marlow604S/R蠕動(dòng)泵從溶液庫(kù)中將抗體溶液泵入單元之中。壓力低于20psi。
d.按照Ellman方法(Anal.Biochem.94，75-81，1979)測(cè)定巰基摩爾濃度。用PBS緩沖液將反應(yīng)混合物(0.1ml)稀釋至1ml，并用0.025ml Ellman試劑(50mM的5，5′-聯(lián)硫基-二-(2-硝基苯甲酸)在100mM磷酸氫二鈉中的溶液(DTNB)，pH7.00)處理。按相同方法用0.025ml DTNB處理一份1ml PBS緩沖液的空白對(duì)照。5分鐘后在412nm處測(cè)定樣品和空白對(duì)照的吸光度(A)，并按下列等式測(cè)量巰基的摩爾濃度(MCSH)MCSH= ((A樣品-A空白對(duì)照)×10)/(1.415×104)其中10是稀釋因子，1.415×104是2-硝基-5-硫代苯甲酸二價(jià)陰離子的摩爾吸收系數(shù)。
按下式計(jì)算巰基與抗體的摩爾比率(MR)MR= (MCSH)/(MC抗體)
3.還原型BR96的軛合在氬氣氛和5℃下，在約10分鐘內(nèi)向上述透濾的還原型抗體的機(jī)械攪拌下的溶液中緩慢加入阿霉素腙(例如實(shí)施例3中制備的)水(WFI)溶液(661ml H2O，3.68mmol，3.05g，HI95%)。在同一溫度下攪拌20分鐘后，將產(chǎn)物粗品泵經(jīng)兩個(gè)0.8μ和0.2μ乙酸纖維素膜的膠囊，使產(chǎn)物粗品澄清。于5℃氬氣氛下，向12L三頸圓底燒瓶中攪拌著的產(chǎn)物粗品溶液一次性地加入30g炭并攪拌15分鐘(1)。產(chǎn)物經(jīng)兩個(gè)真空過(guò)濾單元(1L Corning Vacuum Filtration unit，0.45μ，隨后為0.22μ)過(guò)濾。標(biāo)題產(chǎn)物(6350ml)暫時(shí)貯存在10L帶塞的聚丙烯壇內(nèi)。然后測(cè)定抗體濃度和阿霉素的摩爾濃度(并因而測(cè)定抗體與阿霉素的摩爾比率)(2)。軛合物pH為7.48，抗體濃度為9.1mg/ml，摩爾比率是8.49。
將上述軛合物分成兩份第一份2830ml第二份3520ml(該份用于實(shí)施例11)然后將第一份按28×100ml和5×5ml的量分裝于無(wú)菌塑料瓶中在液氮中冷凍，并貯存于-80-85℃。
注1.攪拌下將炭(Fisher Scientific，Cat＃C170-500，Norit，中性)用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌，直至洗液的pH恒定于7.4，再在真空烘箱中干燥。
2.如前所述通過(guò)280nm處的吸光度，同時(shí)按下式校正阿霉素在同一波長(zhǎng)處的吸光度，測(cè)定抗體在軛合物中的濃度(mg/ml)
(A280-(0.724×A495))/1.4其中0.724是阿霉素在280nm處吸光度的校正因子，1.4是抗體的吸光度單位。
通過(guò)下面給出的等式測(cè)定阿霉素的摩爾濃度MC阿霉素(A495)/(8.03×103)其中8.03×103是阿霉素在495nm處的摩爾吸收系數(shù)。
通過(guò)下列等式計(jì)算軛合物的摩爾比率(MR)(MC阿霉素)/(MC抗體)實(shí)施例5阿霉素-BR96軛合物(BR96單克隆抗體與阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙軛合)在無(wú)菌塑料瓶中向單克隆抗體BR96的溶液(325ml，濃度為9.73mg/ml，在檸檬酸緩沖鹽水(a)中)滴加二硫蘇糖醇(DTT)的溶液(13.84ml，0.01M，在PBS緩沖液中，0.1384mmol(b))。在氬氣氛下，在水浴中于37℃(內(nèi)溫)將混合物緩慢攪拌3小時(shí)使還原反應(yīng)完全。起始時(shí)和其后每小時(shí)(如實(shí)施例4所述)測(cè)定巰基與抗體的摩爾比率(MR)(MR值應(yīng)保持在約14，以確信鏈間的S-S鍵完全還原)(c)。將松馳型(還原型)抗體轉(zhuǎn)移至冷室(4℃)中的與裝配了Omega弦向膜(d)的Filtron Minisette連接的5L溶液庫(kù)內(nèi)。將還原型抗體用2L PBS(b)緩沖液(pH7.4)稀釋并透濾/濃縮(e)至約350ml。然后在氬氣氛下將溶液轉(zhuǎn)移至透明無(wú)菌的塑料容器內(nèi)。如上所述測(cè)定抗體濃度和巰基摩爾濃度(并因而測(cè)定巰基與抗體的MR)。將阿霉素腙的預(yù)冷溶液(如實(shí)施例3所述制備)(27.06ml，0.0063M水溶液，0.172mmol，相對(duì)于每當(dāng)量巰基(f)1.1當(dāng)量)在冷室(4℃)中在恒定的氬氣流并同時(shí)緩慢攪拌的條件下慢慢加到松馳型抗體中。加后30分鐘，將紅色軛合物溶液經(jīng)乙酸纖維素濾膜(0.45μ，而后0.22μ)摩擦過(guò)濾，得到的濾液(350ml)分成以下三份第一份(150ml)、第二份(100ml)、第三份(100ml)。在冷室中在氬氣氛下第一份(150ml)與炭(g)(0.75g)一起攪拌10分鐘，經(jīng)乙酸纖維素膜(0.22μ)過(guò)濾，得到標(biāo)題軛合物。然后如實(shí)施例5所述測(cè)定抗體濃度和阿霉素的摩爾濃度(并因而測(cè)定抗體與阿霉素的MR)?？贵w濃度為8.18mg/ml。摩爾比率為7.96，pH為7.22。將軛合物以4×5ml和3×40ml的量分裝在無(wú)菌塑料瓶中在液氮中冷凍并貯存于-80℃。
注a.將BR96在檸檬酸鹽緩沖液(25mM檸檬酸鈉和250mM氯化鈉，pH＝5.5)中的pH用飽和磷酸氫二鈉(pH9.0，約10ml)調(diào)至7.41。
b.PBS緩沖液購(gòu)自Gibco LaboratoriesInc.并按下列方法改性將500ml這種PBS緩沖液(內(nèi)含2.00g氯化鉀、2.00g磷酸二氫鉀、80.00g氯化鈉和21.60g磷酸氫二鈉)用注射用水(WFI)稀釋至5L，并將pH用1N氫氧化鈉調(diào)至7.4，將形成的溶液經(jīng)0.22μ乙酸纖維素膜過(guò)濾。
c.假設(shè)由于在反應(yīng)混合物中存在痕量金屬如果MR變低，則應(yīng)當(dāng)加入另外的DTT。還原反應(yīng)還可在EDTA(1mM在PBS緩沖液中的溶液)存在下進(jìn)行，以螯合抗體中存在的任何氧化金屬。
d.Minisette和Omega弦向膜購(gòu)自Filtron。該膜由30000MW的聚醚砜制造。用Watson-Marlow604S/R蠕動(dòng)泵在25～30psi的壓力下將溶液泵入超濾系統(tǒng)。
e.透濾/濃縮的速率為65ml/分鐘。監(jiān)測(cè)流出物的巰基與抗體的MR。洗脫約1.6L后，流出物的MR為0.44。推定此時(shí)大多部氧化的DTT和過(guò)量的DTT已從反應(yīng)混合物中除去。
f.按下式計(jì)算所需的阿霉素腙的體積((巰基的摩爾濃度)×(還原型抗體的體積)×1.1)/(6.3×10-3)其中6.3×10-3是阿霉素腙溶液的摩爾濃度，1.1是相對(duì)于每當(dāng)量巰基的阿霉素腙當(dāng)量數(shù)g.攪拌下用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌炭(Fisher Scientific，Cat＃7440-44-0，Norit，中性)，直至洗液的pH恒定于7.4，在真空中干燥。
實(shí)施例6制備阿霉素BR96軛合物(BR96單克隆抗體與阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰肼軛合)的任選方法從檸檬酸鹽(pH5.4)至磷酸鹽(pH7.8)緩沖液的緩沖液交換將BR96 MAb溶在檸檬酸鹽緩沖鹽水(1)(CBS)中。在DTT還原作用之前，使用帶有兩Cassettes(3)的Filtron Minisette用五倍體積的PBS緩沖液(2)透濾BR96的CBS緩沖液溶液。
軛合物的制備攪拌下，在三頸園底燒瓶中，在約2～3分鐘內(nèi)向上述單克隆抗體BR96的溶液(480ml，pH＝7.76，0.032mmol，濃度為10.77mg/ml，在磷酸鹽緩沖鹽水(2)中)加入二硫蘇糖醇(DTT)的溶液(16.2ml，0.01M在PBS緩沖液中的溶液，0.162mmol，5.0mol當(dāng)量)。在氬氣氛下在水浴中于37℃(內(nèi)溫)將混合物緩慢攪拌4小時(shí)。然后冰浴冷卻反應(yīng)混合物。將阿霉素腙的預(yù)冷溶液(如實(shí)施例3所述方法制備，56ml，0.0063M水溶液，0.356mmol)在恒定的氬氣流中在攪拌下于0～4℃緩慢加到還原型抗體中。加畢20分鐘，經(jīng)乙酸纖維素膜(0.45μ，然后0.22μ)摩擦過(guò)濾紅色軛合物溶液。形成的濾液(510ml)在冰浴中在氬氣氛下于0～4℃與炭(4)(7.0g)一起攪拌15分鐘。該混合物經(jīng)兩種乙酸纖維素膜(0.45μ，然后0.22μ)過(guò)濾，得到標(biāo)題軛合物(495ml)。如實(shí)施例4所述方法測(cè)定抗體濃度和阿霉素的摩爾濃度(并因而測(cè)定抗體與阿霉素的MR)?？贵w濃度為8.42mg/ml。摩爾比率為8.26，pH為7.44。然后將軛合物以4×100ml、5×5ml和2×35ml的量分裝在無(wú)菌塑料瓶中在液氮中冷凍并貯存于-80℃。
注
1.BR96的檸檬酸鹽緩沖溶液(25mM檸檬酸鈉和250mM氯化鈉，pH＝5.5)。
2.按下法制備PBS緩沖液，pH＝7.8(0.01M磷酸鈉和0.1M氯化鈉)NaH2PO4·H2O 0.14gNa2HPO41.28gNaCl5.85g水(WFI)適量，加至一升1NNaOH約0.7ml(加至pH為7.8)經(jīng)0.22μ乙酸纖維素膜過(guò)濾。
3.Cassettes是由30000MW的聚醚砜制造的膜。
4.攪拌下用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌炭(Fisher Scientific，Cat＃7440-44-0，Norit，中性)，直至洗液pH恒定于7.4，在真空中干燥。
實(shí)施例7用Bio-BEADTM純化阿霉素-BR96軛合物按下法通過(guò)Bio-BEADTMSM-2用一批法純化軛合物粗品(例如實(shí)施例4或5中制備的沒(méi)有用炭純化的軛合物粗品)在冷室(4℃)中在氬氣氛下將上述軛合物粗品(100ml)和Bio-BEADTMSM-2(50.0g)在無(wú)菌聚苯乙烯燒瓶中攪拌30分鐘。軛合物溶液經(jīng)乙酸纖維素濾膜(0.22μ)過(guò)濾，按實(shí)施例4所述方法測(cè)定MR(藥物與抗體的摩爾比率)，測(cè)得MR為8.12，抗體濃度為6.74mg/ml。將軛合物以2×5ml和2×40ml的量分裝在無(wú)菌塑料瓶?jī)?nèi)在液氮中冷凍并貯存于-80℃。
1.Bio-BEADTM(型號(hào)SM-2)由聚苯乙烯-二乙烯基苯制造，購(gòu)自Bio-Rad Laboratories。使用前將其依次用0.5N氫氧化鈉、水(洗至中性)、甲醇和水洗滌，最后在冷室中用PBS緩沖液平衡(約2小時(shí))。
實(shí)施例8用透析法純化阿霉素-BR96軛合物按下法通過(guò)透濾法純化軛合物粗品(例如實(shí)施例4中制備的沒(méi)有用炭純化的軛合物粗品)(350ml)在氬氣氛下在冷室中將上述軛合物轉(zhuǎn)移至帶有YM30螺柱體的Amicon CH2RS透析器的庫(kù)中并透濾。濾液的流速為約20ml/分鐘。將軛合物轉(zhuǎn)移至無(wú)菌NalgenePETE瓶中。然后測(cè)定抗體濃度和阿霉素的摩爾濃度(并因而測(cè)定抗體與阿霉素的MR)。軛合物的pH為7.6?？贵w濃度為9.2mg/ml，摩爾比率為8.25。將產(chǎn)物以3×100ml、1×20ml和2×5ml的形式分裝在無(wú)菌塑料瓶?jī)?nèi)在液氮中冷凍并貯存于-80℃。
實(shí)施例9通過(guò)陽(yáng)離交換純化阿霉素-BR96軛合物A.樹(shù)脂的制備、柱的裝填和平衡在室溫下在0.5N NaCl(2L)中使CM SEPHADEXTMC-25(1)(500g)膨脹2小時(shí)。傾析上清液水層后，濕的樹(shù)脂在室溫下在PBS緩沖液(2)(4L)中貯存2天。傾析PBS緩沖液并用1N NaCl(3L)替代，16小時(shí)后膨脹的樹(shù)脂(3)用于裝填柱子。
組裝的BPG 100(Pharmacia Inc)柱(4)先用1N HCl沖洗。將在1N NaCl中膨脹的CM SEPHADEXTMC-25樹(shù)脂(總體積3L)慢慢倒入柱中并裝填。然后通過(guò)用PBS緩沖液(3體積)洗脫/洗滌使柱平衡(5)。用丙酮和1N NaCl作柱的試驗(yàn)(6)。使用前將裝填好的柱子貯存于約4℃保持2天使之平衡。
B.軛合物的純化將新制備的軛合物粗品(7)(例如實(shí)施例4中制備的沒(méi)有用炭純化的軛合物粗品)置于PBS緩沖液中(濃度(8)＝10.5mg/ml，MR＝10.0，430ml)，在4℃下在約12分鐘內(nèi)用蠕動(dòng)泵以35ml/分鐘的體積流速上樣(9)至上述柱中。以約60ml的流速用PBS緩沖液洗脫軛合物。在約9分鐘內(nèi)收集3份洗脫液;開(kāi)始一份40ml，接著是作為單一級(jí)份的在465ml中的軛合物主要部分，最后是65ml的稀的第三級(jí)份。
級(jí)份的UV分析結(jié)果如下級(jí)分IIIIII收集的體積(ml)4046565蛋白(g)0.14.360.09MR6.847.648.16回收率(%)2.096.02.0C.柱的再生和平衡當(dāng)共軛物洗出后，用1N NaCl(3倍體積)洗柱，然后用PBS緩沖液(3倍體積)洗/沖洗柱，使柱再生(10)。
注1.CM SEPHADEXTMC-25是一種改性的SEPHADEXTMG-25弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，排阻限＝3×104，顆粒粒徑＝40～125μm，總的離子容量＝4～5μmol/ml。
2.PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.5)NaH2PO4·H2O 0.00117M;Na2HPO40.009M;NaCl 0.1M;離子濃度0.1282;電導(dǎo)率9.35mS。
3.500g樹(shù)脂膨脹至2800ml。
4.柱的尺寸L＝36cm;D＝10cm;柱床體積約為2800ml。
5.在室溫下裝填和平衡柱子，并轉(zhuǎn)移至冷室(4℃)中。在裝載軛合物之前，使柱子在該溫度平衡16小時(shí)。
流速(28psi)[體積]＝215ml/分鐘;[線性]＝2.74ml/分鐘/cm2。
6.在此情形下HETP是0.072。0.01～0.1之間的數(shù)值是可接受的數(shù)值(Pharmacia)。HETP(理論等板高度)＝L/N，其中L＝柱床高度(cm)，N＝理論塔板數(shù)目。N＝5.54(Ve/W1/2)2，其中Ve＝洗脫體積(ml)并且W1/2＝半高峰寬(ml)。
7.在加至柱中之前，將軛合物粗品經(jīng)乙酸纖維素膜(預(yù)過(guò)濾0.44μ，然后0.22μ)摩擦過(guò)濾。
8.用PE Lambda 6UV/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定抗體摩爾濃度(mg/ml)，MC抗體＝ (A280-(0.724-A495))/1.4其中0.724是阿霉素在280nm處吸光度的校正因子，1.4是抗體在280nm處的UV吸光度。
9.物料裝載比率(柱床體積∶軛合物體積)＝6.5∶1。
10.柱再生和平衡耗時(shí)約1.5～2小時(shí)。
但柱子使用3次之后，在樹(shù)脂的頂部觀察到清晰的紅色薄層。柱再生方法不能完全除去該紅色。
再生和平衡后，洗脫液的UV吸光度在280nm和495nm處讀數(shù)為零。
實(shí)施例10用柱色譜法純化阿霉素-BR96軛合物柱的制備在實(shí)施例9中已描述了CM SEPHADEXTMC-25樹(shù)脂的制備(如實(shí)施例9所述)、柱裝填、初始洗滌和再生。
軛合物的純化用蠕動(dòng)泵，在約9分鐘內(nèi)以50ml/分鐘的體積流速將在PBS緩沖液(如實(shí)施例9中)中的新制備的軛合物粗品(例如實(shí)施例4中制備的沒(méi)有用炭純化的軛合物粗品)(濃度＝9.01mg/ml，MR＝12.31;430ml)上樣至上述柱中(如實(shí)施例9所述)(該柱在4℃平衡了16小時(shí))。軛合物用PBS緩沖液以約60ml/分鐘的流速洗脫。在約9分鐘內(nèi)收集三份洗脫液;開(kāi)始一份是40ml級(jí)份，接著是在450ml級(jí)份中的軛合物主要部分，最后是60ml的很稀的第三級(jí)份。
級(jí)份的UV分析結(jié)果級(jí)分IIIIII收集的體積(ml)4045060蛋白質(zhì)(g)0.083.660.08MR7.78.428.41回收率(%)2.095.02.0柱的再生和平衡
洗脫軛合物后，通過(guò)用1NNaCL(3倍體積)洗滌，隨后用PBS緩沖液(3倍體積)洗滌/洗脫，使柱再生。
實(shí)施例11用透濾法濃縮阿霉素-BR96軛合物按下法濃縮純化的軛合物(3520ml，濃度為8.5mg/ml)(例如實(shí)施例4中制備的軛合物)在氬氣氛下在冷室中將上述軛合物轉(zhuǎn)移至帶有YM30再生的乙酸纖維素螺柱體之AmiconCH2RS透析器上的庫(kù)中并濃縮。流速為約20ml/分鐘。將軛合物濃縮至約1785ml(濃度為17.3mg/ml)并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌NalgenePETE瓶中。測(cè)定抗體濃度和阿霉素摩爾濃度(并因而測(cè)定抗體與阿霉素的MR)。軛合物的pH為7.7，抗體濃度為17.3mg/ml，摩爾比率為8.39。將產(chǎn)物以17×100ml、1×55ml和6×5ml的量分裝在無(wú)菌塑料瓶中在液氮中冷凍并貯存于-80℃。
權(quán)利要求
1.制備下式結(jié)構(gòu)的硫醚軛合物的方法， 其中n是約1～10的整數(shù)，q是4～10，MAb是一種免疫球蛋白，它是松弛嵌合型BR96抗體、BR96抗體、嵌合型BR96抗體或松弛型BR96抗體、或其抗原結(jié)合片段；該方法包括在第一種方法中，(a)提供式MAb-(SH)6-9結(jié)構(gòu)的還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖的溶液，其中含有pH為約6～9的磷酸鹽緩沖液，(b)在惰性氣氛下透濾該還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液，制得已透濾的溶液，(c)在惰性氣氛下使所述免疫球蛋白硫醚的已透濾溶液與下式結(jié)構(gòu)的阿霉素腙的溶液反應(yīng)，生成硫醚軛合物粗品， 其中n如上所定義，(d)純化該硫醚軛合物；或者該方法包括在第二種方法中，(a)提供結(jié)構(gòu)式為 的免疫球蛋白硫醚的透濾的磷酸鹽緩沖溶液，所說(shuō)溶液的pH為約6～9，(b)在惰性氣氛下用還原劑的磷酸鹽緩沖溶液處理所述的免疫球蛋白硫醚的磷酸鹽緩沖溶液，生成結(jié)構(gòu)式為的還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液，(c)在惰性氣氛下使所述還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液與下式結(jié)構(gòu)的阿霉素腙溶液反應(yīng)，生成硫醚軛合物粗品， 其中n如上所定義，(d)純化硫醚軛合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在第一種方法中所述的還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液制備如下(a)提供結(jié)構(gòu)式為 的免疫球蛋白硫醚的檸檬酸鹽緩沖溶液，所述的檸檬酸鹽緩沖液的pH值范圍為約4～6;(b)用pH為約6～10的磷酸鹽緩沖液處理所述的緩沖的免疫球蛋白硫醚，制得pH為約6～9的免疫球蛋白硫醚緩沖溶液，(c)在惰性氣氛下，用還原劑的磷酸鹽緩沖溶液處理所述的緩沖的免疫球蛋白硫醚，形成還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中n為5并且MAb是松弛嵌合型BR96抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中還原劑是二硫蘇糖醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在約25～45℃的溫度下，在氬氣氛中將緩沖的免疫球蛋白硫醚與緩沖的還原劑間的反應(yīng)進(jìn)行約1～5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在約-5～25℃下，在氬氣氛中進(jìn)行還原型免疫球蛋白硫醚的緩沖溶液的透濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在約-5～25℃的溫度下，在氬氣氛中將已透濾的免疫球蛋白硫醚溶液與阿霉素腙間的反應(yīng)進(jìn)行約10～60分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中采用的還原劑與免疫球蛋白硫醚的摩爾比率為約10∶1～5∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中還原型免疫球蛋白硫醚與阿霉素腙的摩爾比率為約1∶4～1∶11。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中相對(duì)于還原型免疫球蛋白硫醚的每當(dāng)量巰基，使用阿霉素腙的量為約1.0～1.5當(dāng)量。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中檸檬酸鹽緩沖鹽水含有約10mM～75mM檸檬酸鈉和約50mM～500mM氯化鈉，pH為約5～6.5。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中磷酸鹽緩沖液是堿金屬磷酸鹽緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中磷酸鹽緩沖鹽水含有約0.005M～0.02M磷酸鈉和約0.05M～0.2M氯化鈉，并且pH為約7～8。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中磷酸鹽緩沖鹽水含有約0.04～0.4%(重量)KCl，約0.4～4%(重量)Na2HPO4約0.04～0.4%(重量)KH2PO4·H2O。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中按下法純化硫醚軛合物粗品過(guò)濾軛合物粗品并用碳或炭處理過(guò)濾的軛合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)膜過(guò)濾法純化硫醚軛合物粗品。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中通過(guò)將硫醚軛合物粗品通過(guò)再生的乙酸纖維素膜、聚醚砜膜、聚砜膜或親水性聚丙烯腈膜進(jìn)行純化。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用微球顆粒(beads)純化硫醚軛合物粗品。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中在一批法中使用Bio-Beads。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將硫醚軛合物通過(guò)含有凝膠或樹(shù)脂過(guò)濾介質(zhì)的色譜柱或者將軛合物通過(guò)離子交換柱，使硫醚軛合物粗品純化。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中通過(guò)應(yīng)用凝膠過(guò)濾法或者通過(guò)離子交換或者通過(guò)疏水的相互作用純化所述的硫醚軛合物粗品。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在第二種方法中，按下法制備結(jié)構(gòu)式 的免疫球蛋白硫醚的透濾磷酸鹽緩沖溶液(a)提供免疫球蛋白硫醚在檸檬酸鹽緩沖鹽水中的溶液，所說(shuō)的檸檬酸鹽緩沖鹽水的pH為約4～6。(b)用pH為約6～9的磷酸鹽緩沖液透濾所說(shuō)的檸檬酸鹽緩沖的免疫球蛋白硫醚，制得pH為約6～9的免疫球蛋白硫醚的透濾的磷酸鹽緩沖溶液。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中在第二種方法中，在透濾步驟之前，將檸檬酸鹽緩沖的免疫球蛋白硫醚溶液濃縮至約10～30mg/ml。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中用螯合劑處理免疫球蛋白硫醚的磷酸鹽緩沖溶液，除去存在于免疫球蛋白硫醚、磷酸鹽緩沖劑或兩者之中的金屬雜質(zhì)。
25.制備下式結(jié)構(gòu)的酰肼酸鹽化合物的方法， 其中n為1～10，該方法包括(a)通過(guò)用包括肼基甲酸烷基酯在內(nèi)的偶合試劑處理下式結(jié)構(gòu)的環(huán)合的酸 使該環(huán)合的酸的晶體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，生成下式結(jié)構(gòu)的肼基甲酸酯， 并且(b)將上述肼基甲酸酯中間體與酸反應(yīng)，脫去保護(hù)基，生成酰肼酸鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中按下法制備環(huán)合的酸原料(a)在弱有機(jī)酸存在下，使馬來(lái)酐與結(jié)構(gòu)式為的氨基酸反應(yīng)，生成下式結(jié)構(gòu)的酸縮合產(chǎn)物， 并且(b)在弱有機(jī)堿和惰性有機(jī)溶劑存在下，用環(huán)合劑處理上述的酸，生成下式結(jié)構(gòu)的環(huán)合的酸
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中在有機(jī)酸存在下在惰性氣氛中使馬來(lái)酐與結(jié)構(gòu)式為H2N-(CH2)n-COOH的氨基酸反應(yīng)，制備環(huán)合的酸原料。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中馬來(lái)酐與一種氨基酸即氨基己酸反應(yīng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在乙酸存在下進(jìn)行馬來(lái)酐與氨基己酸的反應(yīng)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中在環(huán)合所述酸縮合產(chǎn)物中使用的環(huán)合劑是三甲基氯甲硅烷或六甲基二硅氮烷，弱有機(jī)堿是三乙胺或二異丙基乙基胺，惰性有機(jī)溶劑為乙腈，結(jié)果生成馬來(lái)酰亞氨基己酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中應(yīng)用乙酸乙酯和己烷使馬來(lái)酰亞氨基己酸結(jié)晶。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中在約70～100℃的溫度下進(jìn)行環(huán)合反應(yīng)。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中用于偶聯(lián)環(huán)合的酸的偶合劑包括肼基甲酸叔丁酯、N-甲基嗎啉和氯甲酸異丁酯以及惰性有機(jī)溶劑，生成肼基甲酸酯中間體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中通過(guò)用乙酸乙酯和己烷進(jìn)行結(jié)晶來(lái)分離肼基甲酸酯中間體。
35.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中通過(guò)肼基甲酸酯中間體與三氟乙酸反應(yīng)來(lái)使肼基甲酸酯中間體脫保護(hù)，生成相應(yīng)的三氟乙酸鹽，或者通過(guò)使肼基甲酸酯中間體與鹽酸反應(yīng)而脫保護(hù)，生成相應(yīng)的鹽酸鹽。
36.制備下式結(jié)構(gòu)的肼基甲酸叔丁酯中間體的方法， 該方法包括通過(guò)先用N-甲基嗎啉、氯甲酸異丁酯和惰性有機(jī)溶劑，然后在惰性有機(jī)溶劑存在下用肼基甲酸叔丁酯處理馬來(lái)酰亞氨基己酸，使所說(shuō)的酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
37.用透濾技術(shù)將如權(quán)利要求1所述的純化的阿霉素-BR96軛合物濃縮至約10～50mg/ml的所需濃度的方法。
38.制備如權(quán)利要求1所述的阿霉素腙的方法，該方法包括在惰性氣氛中，在酸和醇溶劑存在下，使阿霉素鹽酸鹽與下式結(jié)構(gòu)的酰肼酸鹽反應(yīng) 生成阿霉素腙，并分離該阿霉素腙。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述的阿霉素腙按下法分離將阿霉素腙用乙酸乙酯、乙腈或四氫呋喃在降低的溫度下處理，并過(guò)濾收集阿霉素腙，且用冷溶劑任意洗滌該腙。
全文摘要
提供了一種制備可用于治療腫瘤疾病的硫醚軛合物的方法，該硫醚軛合物優(yōu)選由BR96免疫軛合物形成，所述免疫軛合物由阿霉素的雜雙官能連接物合成。在該方法中，將純化的還原型BR96 MAb與阿霉素的6-馬來(lái)酰亞氨基己酰腙軛合，并且使形成的軛合物粗品純化。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1109886SQ9510161
公開(kāi)日1995年10月11日 申請(qǐng)日期1995年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月27日
發(fā)明者J·K·托塔希爾, Y·彭德里, K·G·加達(dá)馬塞蒂, 李文森, R·H·米勒 申請(qǐng)人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司