專利名稱：用作鈣通路阻滯劑的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及存在棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的多肽并涉及具有與所述的多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的活性的多肽。這些多肽和它們的可做藥用的鹽可阻滯在細(xì)胞中包括各種組織(包括無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的各種組織)的神經(jīng)原細(xì)胞和肌肉細(xì)胞中的鈣通路。本發(fā)明也涉及在細(xì)胞中(如在一種器官的神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)本身的細(xì)胞中)阻滯鈣通路時(shí);在處理由乳動(dòng)物鈣通路引起的疾病或狀態(tài)時(shí);以及在抑制無(wú)脊椎動(dòng)物害蟲中應(yīng)用所說(shuō)的多肽和它們的鹽。另外，本發(fā)明還涉及含有所說(shuō)的多肽和它們的鹽的組合物。
已經(jīng)有棚蛛屬aperta蜘蛛的毒液中含有至少兩種能影響鈣流通的毒素的報(bào)告(Jackson，H.，等人，Soc.Neu.Sci.Abstr.121078，1987)。其作者公開了一種在文獻(xiàn)中稱為AG2的毒素，它的分子量低于1，000道爾頓，看來(lái)可在組織的一個(gè)大的范圍內(nèi)抑制鈣流通。此外，Jackson，H，等人(Soc.Neu.Sci.Abstr.12730，1986)報(bào)告了含有由棚蛛屬aperta取得的、其組分的分子量約為6，000的另一種毒素。據(jù)報(bào)告，這種毒素影響突觸前阻滯的傳遞并提示毒素阻滯鈣通路伴隨著神經(jīng)傳遞質(zhì)的釋放。
在1989年4月28日提出的編號(hào)為07/346，181的美國(guó)專利申請(qǐng)公開了所發(fā)現(xiàn)的存在于棚蛛屬aperta蜘蛛的毒液中的某些多肽，在此申請(qǐng)中公開了這些多肽是作為在細(xì)胞中的鈣通路阻滯劑，并敘述了所發(fā)現(xiàn)的以下成分
成份G氨基末端的氨基酸序列包括H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-；根據(jù)FAB MS整個(gè)多肽的分子量為7267成份HH2N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-arg-asn-asn-asn-CONH2；根據(jù)FAB MS整個(gè)多肽的分子量為4198成份H氨基末端的氨基酸序列包括H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glu-；根據(jù)FAB MS整個(gè)多肽的分子量為5494成份I
H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2；FABMS:4158.
成份J氨基末端的氨基酸順序包括H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala-；根據(jù)FAB MS整個(gè)多肽的分子量為5505成份K氨基末端的氨基酸順序包括H2N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-ser-met-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH2；FABMS:5274.
成份L氨基末端的氨基酸順序包括H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asP-；整個(gè)多肽的分子量約為20，000成分L具有下述鑒別特性的多肽
(a)存在于一種得自棚蛛屬aperta蜘蛛粗毒液的成分中，該成份是應(yīng)用C-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔徑，10μ粒度的柱，應(yīng)用一種應(yīng)用5%→20% B，95%→80% A〔0→30分鐘〕然后是20%→70% B，80%→30% A〔30→55分鐘〕的線性梯度程序的溶劑系統(tǒng)(其中A是0.1%TFA水溶液和B是乙腈)流速為3.5ml/分鐘約用43分鐘洗脫出;和(b)存在于上述在(a)中所述的成份的一種成份中，該成分是應(yīng)用C-18 Vydac 10mm×250mm，300 孔徑，5μ粒度的柱，應(yīng)用一種應(yīng)用25%→40% B，75%→60% A〔0→30分鐘〕的線性梯度程序的溶劑系統(tǒng)(其中A是三氟乙酸而B是乙腈)流速為3.5ml/分鐘，約用22.5分鐘洗脫出。
成份M一種氨基末端氨基酸序列包括H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-set-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-；整個(gè)多肽大約的分子量，約為80，000為作鈣拮抗物的化合物具有多種用途。鈣拮抗物可臨床應(yīng)用于治療疾病如咽峽炎、高血壓、心肌病、室上的心律不齊、aesophogeal弛緩不能、早產(chǎn)、尤其是雷諾氏病。參閱W.G.Nayler，鈣拮抗劑，Acadimic Press，Harcourt Brace Javanovich Publishers，New York，NY1988，之中所述在此已收入作參考。再者，在研究細(xì)胞(如神經(jīng)原和肌肉細(xì)胞)的生理學(xué)中和在抑制無(wú)脊椎動(dòng)物害蟲中，這些化合物是有用的。
本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)存在于棚蛛屬aperta蜘蛛的毒液中的多肽。本發(fā)明的多肽和根據(jù)本發(fā)明在其中存在的成分如下成分Q;
(a)存在于未自棚蛛屬aperta蜘蛛粗毒液的成分，它從C-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔度，10μ粒度的柱中，應(yīng)用15ml/分鐘流速和一種應(yīng)用5%→20% B〔0→30分鐘〕然后為20%→70% B〔30→55分鐘〕線性梯度程序的一種溶劑系統(tǒng)(其中A是0.1%的三氟乙酸(TFA)水溶液而B是乙腈)，約用41.5分鐘洗脫出;
(b)存在于上述(a)中所述的成份中的一種成分，它從C-18 Vydac 10mm×250mm，300 孔度，5μ粒度的柱中用3.5ml/分鐘的流速和一種應(yīng)用70% A，30% B的均等效率系統(tǒng)(isocratic system)的溶劑系統(tǒng)，(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)用7.5分鐘洗脫出;
(c)一種氨基末端的氨基酸序列包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
本發(fā)明的多肽在細(xì)胞中阻滯鈣通路。因此，所說(shuō)的多肽在細(xì)胞本身中阻滯鈣通路有效，所說(shuō)的多肽在控制無(wú)脊椎動(dòng)物的害蟲方面和在處理于細(xì)胞中由鈣通路功能引起的哺乳動(dòng)物疾病和健康狀態(tài)也是有效的。
屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)的還有具有與以上所述的多肽基本上相同的氨基酸序列和具有與以上所述的多肽基本上相同的鈣通路阻滯活性的多肽。
通過(guò)根據(jù)本專業(yè)技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法用電刺激抽取的方法，從棚蛛屬aperta蜘蛛取得毒液、所用的較好方法是一種防止污染由腹部流出的或血液的全毒液的方法。這些方法對(duì)于本專業(yè)的技術(shù)人員是熟知的。將如此得到的全毒液在約-78℃的冰凍狀態(tài)下貯存直到用于如下所述的純化作用為止。
得自全毒液的組份的純化作用是在多種制備型和半制備型的柱如C-4和C-18 Vydac 柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801)上的逆相高效液體色譜完成的。峰檢測(cè)是單色地在220-230nm處進(jìn)行。液分的進(jìn)一步分析可用例如以一種Waters 990二極管陣列檢測(cè)器(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集的多色紫外光數(shù)據(jù)來(lái)完成。用已知的方法例如通過(guò)用一種ISCO/“FOXY”液分收集器和一種ISCO 2159峰檢測(cè)器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)來(lái)收集來(lái)自色譜柱的液份。將液份收集在適當(dāng)大小的容器如無(wú)菌的聚乙烯實(shí)驗(yàn)室器皿中。然后用凍干法蒸發(fā)洗提液再用凍干法蒸發(fā)水份以實(shí)現(xiàn)液分的濃縮作用。然后可用一種有梯度系統(tǒng)的分析柱進(jìn)行色譜分析以測(cè)定所得到的組成成分的純度，這種梯度系統(tǒng)比在液分最后的純化作用中所應(yīng)用的系統(tǒng)更具有均等效率。
由各個(gè)成分所包含的結(jié)構(gòu)可根據(jù)已知的方析方法如質(zhì)譜法和核磁共振法來(lái)測(cè)定。根據(jù)已知的方法將成分Q的多肽定序。例如在研究時(shí)多肽的胱氨酸殘基的S-吡啶基乙基化可在溶液中進(jìn)行，然后進(jìn)行多肽的氨基酸定序。下面是用于S-吡啶乙基化作用的一種方法。將1至10μg多肽溶解或稀釋在50μl緩沖溶液中，該緩沖液由1份含有4mM EDTA，pH8.5的1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液和3份8M的鹽酸奎尼定混合而成。然后，加入2.5μl 10%2-巰基乙醇水溶液，再將此混合物于室溫，在黑暗下并在氬氣氛中培育兩小時(shí)。在培育之后再加入2μl 4-乙烯基吡啶(在-20℃及氬氣下貯存的新鮮試劑)，并將此混合物在室溫及氬氣氛下于黑暗中下再培育兩小時(shí)。然后將此混合物脫鹽，較好是用一短的逆相色譜柱。然后根據(jù)已知的方法將此回復(fù)成烷基化的多肽定序。
在實(shí)施本發(fā)明并應(yīng)用上面綜述的一般步驟時(shí)，已發(fā)現(xiàn)適合于初步分離毒液的柱是C-18 Vydac 22mm×250MM、300 孔度、10μ粒度的柱，洗脫這種柱應(yīng)用的流速是15ml/min、應(yīng)用95%→80% A，5%→20% B〔0→30分鐘〕然后是80%→30% A，20%→70% B〔30→55分鐘〕的線性梯度程序其中A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和B是乙腈。各部分就是用如上所述的方法收集的。將如此得到的標(biāo)示為Q的一個(gè)部分，選出作進(jìn)一步的純化作用。成分Q的洗脫時(shí)間約為41.5分鐘。
應(yīng)用C-18 Vydac 10mm×250mm、300 孔度5.0μ粒度的柱并應(yīng)用70%的0.1% TFA水溶液、30%乙腈的均等效率系統(tǒng)以7.5ml/分鐘的流速進(jìn)一步純化成分Q。如以上所述收集各個(gè)部分，成分Q約在7.5分鐘洗脫，并已發(fā)現(xiàn)約在8.3分鐘洗脫的部分含有在編號(hào)為07/346，181的美國(guó)專利申請(qǐng)中所敘述的多肽作為K成分。
成分Q包含一種多肽，這種多肽所具有的氨基末端氨基酸序列包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
假使在此公開了有關(guān)存在于得自棚蛛屬aperta的毒液的Q部分中的化合物有好處的話，現(xiàn)在有可能不用通過(guò)從全毒液中分離/純化的方法得到所說(shuō)的化合物。應(yīng)用重組體DNA技術(shù)通過(guò)用于所說(shuō)的多肽或它的各部分的編碼序列的克隆可生產(chǎn)出本發(fā)明的多肽。例如根據(jù)本專業(yè)技術(shù)人員所熟知的方法，可應(yīng)用采用了現(xiàn)有已知所說(shuō)的多肽的氨基酸序列信息優(yōu)點(diǎn)的雜化探查物以克隆整個(gè)多肽的編碼序列。將重組體DNA技術(shù)與在體外的蛋白質(zhì)合成作用相結(jié)合也可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這些在體外的合成蛋白質(zhì)的方法包括(但并不限于)應(yīng)用一種采用了本專業(yè)熟練的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)Merrifield化學(xué)原理或其他的固相化學(xué)原理的ABI430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，California 94404)。
在技術(shù)上已熟知某些氨基酸的取代作用可在多肽中完成而不影響或不在實(shí)質(zhì)上影響所說(shuō)的多肽的功能。有可能發(fā)生的恰當(dāng)?shù)娜〈饔秒S多肽之間的轉(zhuǎn)變而變化。可允許的取代作用的確定是根據(jù)本專業(yè)的技術(shù)人員所熟知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，所有基本上具有相同的氨基酸序列的和基本上具有相同的鈣通路阻塞活性的所有多肽都屬于本發(fā)明的范圍。
具有不可逆地阻滯鈣通路的本發(fā)明的多肽存在于多種細(xì)胞中如在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)的細(xì)胞中。
本發(fā)明的多肽的阻滯鈣通路的能力可由以下的方法顯示出來(lái)。小腦的顆粒細(xì)胞是用8天大的大鼠腦制成的(Wilkin，G.P.等人，Brain Res115181-199，1976)。將Aclar的方形物(1cm)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，N.J.，07719)用聚-L-賴氨酸包裹并放在12-穴的盤中，其中含有1ml Eagles Basal培養(yǎng)基。將細(xì)胞分離并將含6.25×10細(xì)胞的各等分加到含有Aclar的方形物的各穴中。浸覆24小時(shí)后，加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(終濃度為10μM)。在培養(yǎng)了6、7和8天的時(shí)后將這些細(xì)胞用作fura2分析。將這些連接到Aclar方形物上的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有1ml在HEPES緩沖液(含有0.01%牛血清白蛋白、0.01%右旋糖，pH7.4，無(wú)鎂)中的2μMfura2/AM(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，97402)。在37℃將這些細(xì)胞培育40分鐘，移去含有緩沖液的fura2/AM并以1ml 無(wú)fura2/AM的同一種緩沖液取代之。在一個(gè)石英小杯中加入2.0ml預(yù)熱(37℃)的緩沖液。將在Aclar方形物上的細(xì)胞放入小杯中，將小杯插入一裝在磁攪拌器的恒溫(37℃)容器中并用螢光分光光度計(jì)(Biochemical Instrunent Group，University of Pennsylvania)測(cè)定其螢光。使螢光信號(hào)保持穩(wěn)定約2分鐘。然后將所研究的化合物在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)所配成的貯備液5-20μl以適當(dāng)?shù)臐舛燃有”?。在完成每次試?yàn)時(shí)應(yīng)用Nemeth等人，J.Biol.Chem.2625188(1987)已確定的方法校準(zhǔn)螢光信號(hào)和進(jìn)行fura2/AM滲漏修正，最大螢光值(Fmax)由加入ionomycin(35μm)來(lái)測(cè)定而最小螢光值(Fmin)由后來(lái)加入EDTA(12μmM)與鈣螯合來(lái)測(cè)定。使用上述方法在加入主題化合物時(shí)螢光的降低顯示出發(fā)生了由主題化合物引起的鈣通路阻塞。
本發(fā)明的化合物作為在細(xì)胞本身的鈣通路阻滯劑是有效的。正因如此，這些化合物在防治無(wú)脊椎有害動(dòng)物時(shí)和在處理動(dòng)物細(xì)胞由于鈣通路功能引起的疾病和健康狀況如咽峽炎、高血壓心肌病、室上的心律不齊，aesophogenl弛緩不能、早產(chǎn)和雷諾氏病時(shí)是有效的。再者，在細(xì)胞(包括神經(jīng)系統(tǒng)的和肌肉系統(tǒng)的細(xì)胞，但并不限于這些細(xì)胞)的生理研究中也有用。
也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是可作藥用的本發(fā)明的多肽的鹽。這些鹽是應(yīng)用本專業(yè)技術(shù)人員熟悉的方法制成的。例如可根據(jù)常規(guī)的方法制成這些多肽與堿成的鹽。
在將本發(fā)明的一種多肽施用于一種哺乳動(dòng)物時(shí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的藥物實(shí)踐可以單獨(dú)施用或與可用于藥物的載體或稀釋劑混合成藥物組合物施用?？蓪⑦@些多肽以口服的或非腸道的形式施用而對(duì)于多肽則以非腸道途徑施用較好。非腸道施用包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下的和局部的施用。
將本發(fā)明的多肽用于口服時(shí)，可將這種化合物以片劑或膠囊劑，或者以水溶液或懸浮液的形式施用。在口服的片劑施用的情況下，通常使用的載體包括乳糖、玉米淀粉，通常加入的潤(rùn)滑劑為硬脂酸鎂。如以膠囊形式口服施用，有用的稀釋劑是乳糖和干的玉米淀粉。當(dāng)需用口服用的水懸浮液時(shí)，將活性成分與乳化劑和懸浮劑混合。如有需要時(shí)，可加入某些甜味劑和/或香味劑。
在用于肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)時(shí)通常制備成活性成份的無(wú)菌溶液，而溶液的pH應(yīng)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)和緩沖。用于靜脈時(shí)，應(yīng)控制溶質(zhì)總濃度成為等滲制劑。
在將本發(fā)明的多肽及其鹽用于人類時(shí)，通常的日劑量由醫(yī)囑決定。而且，劑量將根據(jù)年齡、體重和個(gè)別病人的反應(yīng)、以及病人癥狀的嚴(yán)重程度和施用的具體化合物的潛能而改變。
在將本發(fā)明的多肽及其鹽用于防治無(wú)脊椎害蟲時(shí)，可將所說(shuō)的多肽直接施用于所說(shuō)的無(wú)脊椎動(dòng)物或施用于所說(shuō)的無(wú)脊椎害蟲的環(huán)境中。例如，可將本發(fā)明的一種化合物的溶液噴布于所說(shuō)的無(wú)脊椎動(dòng)物上。用于防治所說(shuō)的脊椎動(dòng)物所必需的化合物量將根據(jù)無(wú)脊椎動(dòng)物和環(huán)境條件而改變并將由施用該化合物的人決定。
在將本發(fā)明的多肽或其鹽用于細(xì)胞的生理研究時(shí)，是根據(jù)本專業(yè)熟練的技術(shù)人員所熟知的方法將所說(shuō)的多肽施用于細(xì)胞，例如，可將所說(shuō)的多肽施用于在適當(dāng)?shù)纳砭彌_液中的細(xì)胞。用于這些研究的本發(fā)明的化合物的適當(dāng)濃度是100μM。然而，用于這些研究的所說(shuō)的多肽的濃度可以大于或小于100μM。施用該化合物的量將根據(jù)已熟知的方法由本專業(yè)熟練的技術(shù)人員決定。
以下的實(shí)例是作說(shuō)明用而不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)例1棚蛛屬aperta的全毒液的初步分離將得自天然產(chǎn)物科學(xué)公司(Natural Product Sciences Inc.，Salt Lake City Uath 84108)已在約-78℃在冰凍狀態(tài)下貯存過(guò)的棚蛛屬aperta的全毒液解凍并取出10至60μl稀釋至200μl，然后裝到C-18 Vydac (22mm×250mm，300 孔徑，10μ粒度)柱上應(yīng)用5%→20% B，95%→80% A〔0→30分鐘〕然后為20%→70% B，80%→30% A〔30→55分鐘〕的線性梯度程序的溶劑系統(tǒng)(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)并以流速為15ml/分進(jìn)行洗脫。用單色在220-230nm處進(jìn)行峰檢測(cè)，并用ISCO/“FOXY”液份收集器及ISCO 2159峰檢測(cè)器收集各液分。各液分是在20分鐘至60分鐘中內(nèi)收集。液分Q的收集時(shí)間是約41.5分鐘。
實(shí)例2液分Q的細(xì)分離和其中的結(jié)構(gòu)測(cè)定將得自所述的實(shí)例1的液份Q裝于C-18 Vydac (10mm×250mm，300 孔徑，5μ粒徑)柱上，以流速為3.5ml/分鐘用70%A、30%B的均等效能的溶劑系統(tǒng)(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)從其中洗提。用一Water 990二極陣列檢測(cè)器來(lái)完成峰檢測(cè)、按實(shí)例1所述來(lái)完成液分的收集，得到下列兩種液分。
液分 洗提時(shí)間Q 約7.5分鐘K 約8.3分鐘然后根據(jù)已熟知的方法先凍干蒸發(fā)洗提液再凍干蒸發(fā)水份來(lái)制成含有多肽的液份Q和K以用于定序。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書應(yīng)用Waters Pico-Tag方法完成對(duì)液份Q和K的烷基化多肽的氨基酸分析。從應(yīng)用生物系統(tǒng)公司型號(hào)為407A的蛋白質(zhì)/肽定序器(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，California 94404)和TFA水溶液常規(guī)收集定序數(shù)據(jù)。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司型號(hào)為120A PTH的分析器對(duì)所得到的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸直接完成分析或不直接完成分析則在DuPont Zorbax PTH柱(Biomedical Product Depontment，Chromatography Products，E.I.duPont de Nemours and Co.，Inc.，1007 Market Street，Wilmington，Delaware 19898)上進(jìn)行。
作為氨基酸分析的一個(gè)結(jié)果測(cè)定出的含于液份Q的多肽的氨基末端氨基酸順序如下
H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
作為氨基酸分析的一個(gè)結(jié)果，也測(cè)定了含有上述液分K的多肽的液分K，并公開于美國(guó)專利申請(qǐng)編號(hào)07/346，181的文獻(xiàn)中。
權(quán)利要求
1.一種制備基本上純的多肽的方法，這種多肽具有以下的鑒別特征(a)存在于得自棚蛛屬aperta蜘蛛的粗毒液的一種成分中，該成分是從C-18Vydac 22mm×250mm、300 孔度、10μ粒度的柱應(yīng)用15ml/分鐘的流速和一種應(yīng)用5%→20%B，95%→80%A
然后為20%→70%B，80%→30%A[30→55分鐘]的線性梯度程序的溶劑系統(tǒng)(其中A是0.1%三氟乙酸水溶液而B是乙腈)洗脫出的，洗脫時(shí)間約為41.5分鐘；(b)存在于在上述(a)所述的成分中的一種成分中，該成分是從C-18Vydac 10mm×250mm，300 孔度、5μ粒度的柱應(yīng)用3.5ml/分鐘流速和一種20%A、30%B的均等效率溶液系統(tǒng)(其中A是0.1%三氟乙酸水溶液而B是乙腈)洗脫出的，洗脫時(shí)間約為7.5分鐘洗；和(c)氨基末端氨基酸順序包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-；一種具有與所說(shuō)的多肽和它的可作藥用的鹽類的氨基酸順序基本上相同和鈣通路阻滯活性基本上相同的多肽，該方法的特征在于將棚蛛屬aperta蜘蛛的全毒液從C-18Vydac 22mm×250mm、300 孔徑、10μ粒度的柱應(yīng)用15ml/分鐘的流速和一種應(yīng)用5%→20%乙腈、95%→80%的0.1三氟乙酸水溶液
然后是20%→70%乙腈、80%→30%的0.1%三氟乙酸水溶液[30→55分鐘]的線性梯度程序的溶劑系統(tǒng)洗脫出而單色的峰檢測(cè)則在220-230nm，收集約41.5分鐘洗提出的液分，將它裝到C-18Vydac 10mm×250mm、300 孔度、5μ粒度柱上并用3.5ml/分鐘的流速和一種70%的0.1%三氟乙酸水溶液和30%乙腈的均等效率溶劑系統(tǒng)洗脫而峰的檢測(cè)則在220-230nm處，收集約7.5分鐘洗提出的液份并任意選擇地凍干，再懸浮于水中和凍干這種液份；或者，用另一種辦法，即用本身已知的方法合成所說(shuō)的肽；并在需要具有基本上與所說(shuō)的肽有相同的氨基酸順序的肽時(shí)，用本身已知的方法合成這種肽或這些肽；和任意選擇地用本身已知的方法將所說(shuō)明的肽轉(zhuǎn)化成它們的可作藥用的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)存在于棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的多肽并涉及具有與所說(shuō)的多肽基本上相同的氨基酸順序和基本上相同活性的多肽。本發(fā)明的多肽和它們的鹽類在多種器官的細(xì)胞中阻滯鈣通路并對(duì)在細(xì)胞本身中阻滯所說(shuō)的鈣通路；在處理由鈣通路引起的疾病、狀態(tài)和在控制無(wú)脊椎動(dòng)物害蟲時(shí)有用。本發(fā)明也涉及包括所說(shuō)的肽和它們的鹽類的組合物。
文檔編號(hào)A61P3/14GK1051182SQ9010813
公開日1991年5月8日 申請(qǐng)日期1990年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1989年9月29日
發(fā)明者道格拉斯·菲利普斯, 尼古拉斯·A·薩科曼諾, 羅伯特·A·沃爾克曼 申請(qǐng)人:美國(guó)輝瑞有限公司, 自然產(chǎn)品科學(xué)有限公司