本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料與組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種復(fù)合有纖維材料的組織工程半月板支架的制備方法。

背景技術(shù)：

半月板是位于膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨之間的由纖維軟骨組成的器官，內(nèi)外各一，分別為內(nèi)側(cè)半月板和外側(cè)半月板，是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的重要器官。其作用為營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨，潤滑關(guān)節(jié)，增加關(guān)節(jié)接觸面積，使關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力重新分布以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，增強(qiáng)關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性。不當(dāng)運(yùn)動(dòng)或退行性病變引發(fā)的半月板損傷將使半月板喪失對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，從而誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎。進(jìn)行半月板部分或全部切除短期內(nèi)可以緩解疼痛，但由于半月板不具備再生能力，因此該手術(shù)將加重骨關(guān)節(jié)炎并引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退化。

組織工程的發(fā)展為半月板再生修復(fù)提供了新的治療模式，其中組織工程支架作為細(xì)胞和生長因子等活性物質(zhì)的載體，有著至關(guān)重要的作用。目前用于半月板組織工程支架制備的材料可以分為天然材料和人工合成材料兩種。其中天然材料如膠原等具有很好的生物活性，降解產(chǎn)物無毒性，有利于細(xì)胞的生長和活性因子的負(fù)載。但其降解速率過快、力學(xué)強(qiáng)度較差。人工合成可降解高分子材料如聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等制備的半月板支架具有較好的力學(xué)性能，易于生產(chǎn)加工，且價(jià)格低廉。但其也有不可避免的缺點(diǎn)，如細(xì)胞相容性較差、降解產(chǎn)物無法被及時(shí)代謝，造成局部微環(huán)境改變加重骨關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)退化。

單純利用單一的方法(冷凍干燥、靜電紡絲、3D打印等)和單一材料(天然材料或合成高分子材料)制備半月板支架難以同時(shí)具備良好力學(xué)性能和生物相容性。復(fù)合材料制備半月板支架，將不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的材料加工組合，可以顯著提高半月板的力學(xué)性能和生物活性。靜電紡絲是一種利用電場作為驅(qū)動(dòng)力，將黏流性溶液加工成微米或納米尺度纖維絲的方法。用靜電紡絲制備的纖維絲可以很好地模擬半月板細(xì)胞外基質(zhì)中有序膠原束的結(jié)構(gòu)，具有良好的力學(xué)性能。冷凍干燥可以制備多孔結(jié)構(gòu)支架，支架孔隙聯(lián)通，孔徑可調(diào)，有利于細(xì)胞的長入和增殖。將靜電紡絲制備的纖維絲和冷凍干燥制備的多控支架結(jié)合，可以得到既有良好力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)兼具多孔結(jié)構(gòu)的半月板支架。得到的支架力學(xué)強(qiáng)度及孔隙率均可調(diào)可控，且支架在環(huán)向的彈性模量大于徑向彈性模量，與天然半月板力學(xué)特點(diǎn)相似，為各向異性支架材料，可以滿足部分半月板缺損及半月板全缺損的修復(fù)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決患者膝關(guān)節(jié)半月板受損修復(fù)問題，提供一種纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的制備方法，為組織工程修復(fù)部分半月板缺損或半月板全缺損提供新方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟：

1)用有機(jī)溶劑配制含3～5wt％膠原和3～5wt％可降解高分子材料的溶液，然后利用該溶液通過靜電紡絲的方法制成纖維絲膜；

2)將膠原溶于水制成質(zhì)量百分比濃度為5～50％的溶液；

3)將步驟1)制備的纖維絲膜和步驟2)配制的膠原水溶液通過層疊的方式進(jìn)行交替疊加，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架；

4)將凍干復(fù)合支架進(jìn)行交聯(lián)、滅菌，獲得纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。

上述步驟1)中，所述可降解高分子材料可以選自下列材料中的一種或多種：聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等。所述可降解高分子的重均分子量為50000-100000。

所述有機(jī)溶劑可以是下列溶劑中的一種或多種的混合溶劑：六氟異丙醇(HFPI)、四氫呋喃(THF)和氮氮二甲基甲酰胺(DMF)。優(yōu)選為六氟異丙醇，或者是四氫呋喃和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶劑。

步驟1)制備的纖維絲膜的厚度優(yōu)選為100～200μm。靜電紡絲的方法具體可以是：將所述溶液裝入注射器中，注射器裝在靜電紡絲機(jī)上，在壓差為10～18kV、推注速率為0.01～0.1mL/min的條件下制備纖維絲膜。

步驟2)配制的膠原水溶液的濃度優(yōu)選為25～35％。

在步驟3)中，纖維絲膜和膠原泡沫層交替層疊，夾在兩層纖維絲膜之間的膠原泡沫層的厚度通常在0.5～2.5mm左右。

步驟4)可以采用化學(xué)方法、輻照方法或干熱方法進(jìn)行交聯(lián)，其中化學(xué)方法可以利用碳化二亞胺(EDAC)、戊二醛或京尼平等化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)。

步驟4)中的滅菌方法可以是鈷60輻照滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌。

本發(fā)明方法制備的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架無固定的外形和尺寸大小，厚度通常在3～30mm，可根據(jù)實(shí)際用處需要進(jìn)行定型制備或制備完成后進(jìn)行裁剪。

將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種至所述的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架上培養(yǎng)3-14天，即可用于部分半月板缺損及半月板全缺損的修復(fù)。

本發(fā)明還提供一種纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架，其采用如上所述的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架制備方法制得。

通過本發(fā)明方法制備的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的拉伸彈性模量為0.5～100MPa，壓縮彈性模量為0.05～10MPa。一種典型的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架具有下述結(jié)構(gòu)：半圓環(huán)形三維結(jié)構(gòu)，具有五層結(jié)構(gòu)，其中三層為所述膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜，兩層為膠原冷凍干燥后得到的多孔結(jié)構(gòu)，參見圖1。該纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的半環(huán)形外徑為20～35mm，半環(huán)形內(nèi)徑為3～10mm，厚度3～30mm，如圖2所示。

本發(fā)明提供的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的制備方法，具有以下有益效果：本發(fā)明通過結(jié)合靜電紡絲、冷凍干燥的方法，制備出具有合適可修剪外形、合適孔隙率、合適力學(xué)強(qiáng)度的纖維增韌的組織工程半月板支架，有效地提高了天然材料制備半月板支架的力學(xué)強(qiáng)度，更適用于作部分半月板缺損和完全半月板缺損的移植替代，并且其中的膠原等天然材料具有良好的生物相容性和細(xì)胞活性，其孔隙結(jié)構(gòu)有利于提高接種細(xì)胞和植入后自體細(xì)胞的生存、增殖和向纖維軟骨細(xì)胞分化的能力，從而最終形成形態(tài)、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和功能良好的新生半月板。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)示意圖，其中：1為纖維絲膜，2為多孔膠原。

圖2為本發(fā)明制備的一個(gè)纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的實(shí)物圖。

圖3為本發(fā)明制備的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的縱截面電鏡圖，其中：1為纖維絲膜，2為多孔膠原；

圖4為實(shí)施例5制備的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的拉伸試驗(yàn)和壓縮試驗(yàn)結(jié)果，其中a為拉伸測試時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，b為壓縮測試時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

1、將重均分子量為80000的PCL溶于HFPI中，制成濃度為8％的溶液；將膠原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、將PCL溶液和膠原溶液以1:1的比例(體積比)混合后吸取5mL至配有鈍頭針的注射器中；將注射器安裝于靜電紡絲機(jī)上，針頭端接正極，接收器端接負(fù)極或接地，壓差為15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器為轉(zhuǎn)速可調(diào)的金屬圓筒，接收器表面線速度為9m/min，在接收器端接收由膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜。

3、配制濃度為10％的膠原水溶液。

4、將纖維絲膜與膠原水溶液通過圖1所示的層疊方式進(jìn)行疊加，而后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架。

5、將凍干復(fù)合支架浸入1mol/L的EDAC溶液中交聯(lián)，得到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。將其裁剪為半圓環(huán)形，圓環(huán)外徑為30mm，內(nèi)徑為10mm，厚度為8mm。

6、用鈷60輻照對纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行滅菌處理。

實(shí)施例2

1、將重均分子量為80000的PCL溶于THF和DMF混合液中；制成濃度為8％的溶液。將膠原溶于THF和DMF混合液中，制成8％的溶液。

2、將PCL溶液和膠原溶液以1:1的比例(體積比)混合后吸取5mL至配有鈍頭針的注射器中。將注射器安裝于靜電紡絲機(jī)上，針頭端接正極，接收器端接負(fù)極或接地，壓差為13kV，用微量泵控制注射器以0.025mL/min的速率推注，接收器為轉(zhuǎn)速可調(diào)的金屬圓筒，接收器表面線速度為9m/min，在接收器端接收由膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜。

3、配制濃度為10％的膠原水溶液。

4、將纖維絲膜與膠原水溶液通過圖1所示的層疊方式進(jìn)行疊加，而后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架。

5、將凍干復(fù)合支架浸入0.1mol/L的京尼平溶液中交聯(lián)，得到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。將其裁剪為半圓環(huán)形，圓環(huán)外徑為35mm，內(nèi)徑為12mm，厚度10mm。

6、用鈷60輻照對纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行滅菌處理。

實(shí)施例3

1、將重均分子量為80000的PLLA溶于HFPI中，制成濃度為8％的溶液；將膠原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、將PCL溶液和膠原溶液以1:1的比例(體積比)混合后吸取5mL至配有鈍頭針的注射器中。將注射器安裝于靜電紡絲機(jī)上，針頭端接正極，接收器端接負(fù)極或接地，壓差為15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器為轉(zhuǎn)速可調(diào)的金屬圓筒，接收器表面線速度為9m/min，在接收器端接收由膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜。

3、配制濃度為10％的膠原水溶液。

4、將纖維絲膜與膠原水溶液通過圖1所示的層疊方式進(jìn)行疊加，而后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架。

5、將凍干復(fù)合支架浸入0.25％的戊二醛水溶液中交聯(lián)，得到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。將其裁剪為半圓環(huán)形，圓環(huán)外徑為20mm，內(nèi)徑為50mm，厚度為5mm。

6、用鈷60輻照對纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行滅菌處理。

實(shí)施例4

1、將重均分子量為80000的PCL和PLGA混合(質(zhì)量比1:1)溶于HFPI中，制成濃度為8％的溶液；將膠原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、將PCL溶液和膠原溶液以1:1的比例(體積比)混合后吸取5mL至配有鈍頭針的注射器中。將注射器安裝于靜電紡絲機(jī)上，針頭端接正極，接收器端接負(fù)極或接地，壓差為14kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器為轉(zhuǎn)速可調(diào)的金屬圓筒，接收器表面線速度為9m/min，在接收器端接收由膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜。

3、配制濃度為10％的膠原水溶液。

4、將纖維絲膜與膠原水溶液通過圖1所示的層疊方式進(jìn)行疊加，而后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架。

5、將凍干復(fù)合支架浸入1mol/L的EDAC溶液中交聯(lián)，得到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。將其裁剪為半圓環(huán)形，圓環(huán)外徑為30mm，內(nèi)徑為10mm，厚度為8mm。

6、用鈷60輻照對纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行滅菌處理。

實(shí)施例5

1、將重均分子量為60000的PCL溶于HFPI中，制成濃度為10％的溶液；將膠原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、將PCL溶液和膠原溶液以2:3的比例(體積比)混合后吸取7.5mL至配有鈍頭針的注射器中。將注射器安裝于靜電紡絲機(jī)上，針頭端接正極，接收器端接負(fù)極或接地，壓差為15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器為轉(zhuǎn)速可調(diào)的金屬圓筒，接收器表面線速度為900m/min，在接收器端接收由膠原和可降解高分子材料混合材料制備的纖維絲膜。

3、配制濃度為30％的膠原水溶液。

4、將纖維絲膜與膠原水溶液通過圖1所示的層疊方式進(jìn)行疊加，而后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干復(fù)合支架。

5、將凍干復(fù)合支架浸入1mol/L的EDAC平溶液中交聯(lián)，得到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架。將其裁剪為半圓環(huán)形，圓環(huán)外徑為30mm，內(nèi)徑為10mm，厚度為7mm。

6、用環(huán)氧乙烷對纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行滅菌處理。

本發(fā)明對上述實(shí)施例1-5的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架進(jìn)行了力學(xué)性能分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例1-5均能得到具有多孔結(jié)構(gòu)的、力學(xué)強(qiáng)度適用于半月板移植的組織工程支架，尤其實(shí)施例5的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的力學(xué)性能最佳。

將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架上復(fù)合培養(yǎng)7天，并且在手術(shù)時(shí)根據(jù)半月板缺損部位的形狀及大小裁剪，進(jìn)行縫合即可實(shí)現(xiàn)部分半月板缺損和完全半月板缺損的移植替代。

下面將詳細(xì)介紹實(shí)施例5的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架的相關(guān)測試結(jié)果。

(1)拉伸試驗(yàn)：將實(shí)施例5制備得到的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架用生理鹽水浸泡3h后，裁剪為寬10mm，有效長度15mm，厚度7mm的長方形試樣，用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)夾具夾住固定，以5mm/min的拉伸速率對樣品進(jìn)行拉伸直至樣品斷裂，根據(jù)得到的拉伸應(yīng)力和拉伸應(yīng)變繪制曲線，如圖4中a所示，從應(yīng)力-應(yīng)變曲線中取線彈性段計(jì)算拉伸彈性模量，為11.47MPa。

(2)壓縮試驗(yàn)：將實(shí)施例5制備得到的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架用生理鹽水浸泡3h后，裁剪為邊長10mm，厚度7mm的正方形試樣，置于力學(xué)試驗(yàn)機(jī)兩壓盤之間，以5mm/min的壓縮速率對樣品進(jìn)行壓縮至30％應(yīng)變，根據(jù)得到的壓縮應(yīng)力和壓縮應(yīng)變繪制曲線，如圖4中b所示，從應(yīng)力-應(yīng)變曲線中取線彈性段計(jì)算壓縮彈性模量，為0.17MPa。

(3)動(dòng)物缺損修復(fù)試驗(yàn)：將兔麻醉后打開膝關(guān)節(jié)，切除半月板，將實(shí)施例5制備得到的纖維增韌的組織工程半月板復(fù)合支架用縫合于缺損半月板處，而后依次縫合肌肉、筋膜、皮膚，關(guān)上膝關(guān)節(jié)。術(shù)后一個(gè)月處死動(dòng)物，打開膝關(guān)節(jié)，植入出無感染、潰爛情況發(fā)生。半月板支架部分降解，仍有殘余。已降解的半月板支架處形成類半月板組織，對關(guān)節(jié)軟骨起到了有效的保護(hù)作用。

應(yīng)該理解的是，上述實(shí)施例并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白在不脫離本發(fā)明的范疇下，可進(jìn)行各種變化和等同替換。此外，為適應(yīng)本發(fā)明技術(shù)的特定場合或材料，可對本發(fā)明進(jìn)行諸多修改而不脫離其保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開的特定實(shí)施例，而包括所有落入到權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)的實(shí)施行為。