本申請是申請日為2011年5月26日的申請?zhí)枮?01180025496.2(pct申請?zhí)枺簆ct/us2011/038200)、發(fā)明名稱為“多價的合成納米載體疫苗”的分案申請。

相關(guān)申請

本申請根據(jù)35u.s.c.§119要求了2010年5月26日提交的美國臨時申請61/348713、2010年5月26日提交的61/348717、2010年5月26日提交的61/348728以及2010年6月25日提交的61/358635的權(quán)益，各自的全文內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。

本申請涉及多價的合成納米載體疫苗。

背景技術(shù)：

多價疫苗是一種對某些外來物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有用的方式，這些外來物質(zhì)否則不會令人希望地強(qiáng)健。舉例來說，與使用單價疫苗進(jìn)行接種相比，針對一種病毒的多個病毒株的接種可以提供針對該病毒的多個病毒株的更強(qiáng)健的交互保護(hù)。

然而，當(dāng)前的多價疫苗和其制造方法需要改進(jìn)。舉例來說，當(dāng)前的使抗原與蛋白質(zhì)載體結(jié)合的方法是復(fù)雜的且提供低產(chǎn)率。另外，經(jīng)常需要開發(fā)新技術(shù)來使新抗原與載體蛋白質(zhì)結(jié)合，因為常規(guī)技術(shù)可能因常規(guī)載體蛋白質(zhì)的相對易碎性而不成功。

需要的是提供改進(jìn)的多價疫苗的組合物和方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一個方面，提供一種組合物，包含一個劑型，該劑型包含一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

另一個方面，還提供一種組合物，包含一個劑型，該劑型包含一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

又另一個方面，還提供一種組合物，包含一個劑型，該劑型包含一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

再另一個方面，提供一種組合物，包含一個劑型，該劑型包含一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

在任何所提供的組合物的一個實施方案中，該第一組表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第二組表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含從第一感染性屬獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性屬獲得或衍生的抗原。在一個實施方案中，該第一感染性屬與該第二感染性屬相同。在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含從第一感染性種獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性種獲得或衍生的抗原。在一個實施方案中，該第一感染性種與該第二感染性種相同。在另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含從第一感染性病毒株獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性病毒株獲得或衍生的抗原。在一個實施方案中，該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株相同。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下科的病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒科、細(xì)小核糖核酸病毒科、皰疹病毒科、嗜肝dna病毒科、黃病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭瘤病毒科、彈狀病毒科、披膜病毒科或細(xì)小病毒科。在一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒、柯薩奇病毒、a型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、埃-巴二氏病毒、人類巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒、b型肝炎病毒、c型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西方尼耳病毒、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、人類偏肺病毒、人類乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風(fēng)疹病毒、人類博卡病毒或細(xì)小病毒b19。在另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：vi、vii、e1a、e3-19k、52k、vp1、表面抗原、3a蛋白質(zhì)、衣殼蛋白、核衣殼、表面突出物、跨膜蛋白、ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、早期抗原、衣殼抗原、pp65、gb、p52、潛伏的核抗原-1、ns3、包膜蛋白、包膜蛋白e2結(jié)構(gòu)域、gp120、p24、脂肽gag(17-35)、gag(253-284)、nef(66-97)、nef(116-145)、pol(325-355)、神經(jīng)氨酸酶、核衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶、糖蛋白、e6、e7、包膜脂蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(ns)。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下細(xì)菌獲得或衍生的抗原：博德特氏菌屬、疏螺旋體屬、布魯氏菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬和披衣菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、鉤端螺旋體屬、李斯特菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟菌屬、假單胞菌屬、立克次體、沙門氏菌屬、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬弧菌屬或耶爾森氏菌屬。在一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳桿菌、伯氏疏螺旋菌、牛布魯氏菌、狗布魯氏菌、羊布魯氏菌、豬布魯氏菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡披衣菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、白喉棒狀桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希氏桿菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團(tuán)桿菌、問號鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、綠膿假單胞菌、立氏立克次體、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌或鼠疫耶爾森氏菌。在另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳毒素(pt)、絲狀血球凝集素(fha)、百日咳粘附素(prn)、菌毛(fim2/3)、vlse；dbpa、ospa、hia、prpa、mlta、l7/l12、d15、0187、virj、mdh、afua、l7/l12、外膜蛋白、lps、a型抗原、b型抗原、c型抗原、d型抗原、e型抗原、flic、flid、cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氫鹽-醛縮酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)、延伸因子-g(ef-g)、假定蛋白(hp)、t毒素、類毒素抗原、莢膜多糖、蛋白質(zhì)d、mip、核蛋白(np)、rd1、pe35、ppe68、esxa、esxb、rd9、esxv、hsp70、脂多糖、表面抗原、sp1、sp2、sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引導(dǎo)蛋白質(zhì)、莢膜蛋白質(zhì)(f1)或v蛋白質(zhì)。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下屬的真菌獲得或衍生的抗原：念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、組織胞漿菌屬、肺囊蟲屬或葡萄穗霉菌屬。在一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：白色念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、新型隱球菌、羅氏隱球菌、淺白隱球菌、加特隱球菌、莢膜組織胞漿菌、伊氏肺囊蟲或黑葡萄穗霉。在另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：表面抗原、莢膜糖蛋白、yps3p、hsp60、主要表面蛋白質(zhì)、msgc1、msgc3、msgc8、msgc9或schs34。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從在此提供的任何以下物質(zhì)獲得或衍生的抗原：感染物、病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、肽、多肽、小分子、多糖或寡糖。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含從一種濫用的或上癮的物質(zhì)獲得或衍生的抗原。在一個實施方案中，該濫用的或上癮的物質(zhì)是可卡因或煙堿。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含相同表面抗原，并且其中該第一組表面抗原的至少一種抗原所呈現(xiàn)的定向與該第二組表面抗原所呈現(xiàn)的不同。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含相同表面抗原，并且其中該第一組表面抗原的至少一種抗原所呈現(xiàn)的構(gòu)象與該第二組表面抗原所呈現(xiàn)的不同。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原的分子結(jié)構(gòu)與該第二組表面抗原不同。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原的至少一種表面抗原和/或該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含肽的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含肽的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一個實施方案中，該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一個實施方案中，該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一個實施方案中，該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一個實施方案中，該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。在一個實施方案中，該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

在任何所提供的組合物的一個實施方案中，這些組合物另外包含一種或多種佐劑。在一個實施方案中，該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到該合成納米載體上的佐劑。在另一個實施方案中，該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到該合成納米載體上的佐劑并且該組合物包含一種或多種混合的佐劑。

在一個實施方案中，任何所提供的組合物的一種或多種佐劑各自包含礦物鹽、明礬、與腸細(xì)菌的單磷酰脂質(zhì)(mpl)、(as04)組合的明礬、as15、皂甙、qs-21、quil-a、iscoms、iscomatrix^tm、mf59^tm、isa51、isa720、as02、脂質(zhì)體或脂質(zhì)體配制品、as01、as15、合成的或特別制備的微粒和微載體、淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的衍生自細(xì)菌的外膜泡、殼聚糖顆粒、貯存形成劑、嵌段共聚物、特異性修飾或制備的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、rc529、細(xì)菌類毒素、毒素片段、toll樣受體2、3、4、5、7、8或9的激動劑、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性dna、免疫刺激性rna、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、1，2-橋接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、針對dc表面分子cd40的激動劑、類型i干擾素、聚i：c、細(xì)菌性脂多糖(lps)、vsv-g、hmgb-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含cpg的免疫刺激性dna分子、從壞死細(xì)胞釋放的促發(fā)炎刺激物、尿酸鹽晶體、補(bǔ)體級聯(lián)的活化組分、免疫復(fù)合物的活化組分、補(bǔ)體受體激動劑、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體激動劑。在一個實施方案中，這些佐劑是不同的。在另一個實施方案中，該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含一種tlr-2、-3、-4、-7、-8或-9激動劑。在又另一個實施方案中，該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、mpl、咪喹莫特或瑞喹莫德。在一個實施方案中，該混合的佐劑是包含cpg的免疫刺激性核酸、as01、as02、as04、as15、qs-21、皂甙、明礬或mpl。

在任何所提供的組合物的一個實施方案中，該第一和該第二群的合成納米載體的存在量有效在一位受試者中對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，這些組合物包含一種或多種另外的群的合成納米載體，其中各另外的群的合成納米載體包含一組表面抗原，該組表面抗原與該組合物中的其他組的表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。在一個實施方案中，該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個另外包含一種偶合到其上的佐劑。在另一個實施方案中，該偶合到該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個上的佐劑與該組合物中的其他佐劑不同。

在任何所提供的組合物的又另一個實施方案中，該第一組表面抗原包含第一組單價或低價的表面抗原；并且該第二組表面抗原包含第二組單價或低價的表面抗原。

在任何所提供的組合物的再另一個實施方案中，各組表面抗原是一個單價或低價組的表面抗原。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，這些群的合成納米載體的存在量有效對各組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對各組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

在任何所提供的組合物的一個實施方案中，該第一和/或該第二群的合成納米載體另外包含一種偶合到其上的通用t細(xì)胞抗原。在另一個實施方案中，該通用的t細(xì)胞抗原包含一種t輔助細(xì)胞抗原。在又另一個實施方案中，該t-輔助細(xì)胞抗原包含一種從卵白蛋白獲得或衍生的肽。在再另一個實施方案中，該從卵白蛋白獲得或衍生的肽包含如seqidno：1中所闡明的序列。在另一個實施方案中，該通用的t細(xì)胞抗原通過封裝偶合。

在任何所提供的組合物的一個實施方案中，該藥物學(xué)上可接受的賦形劑包含防腐劑、緩沖劑、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、著色劑或穩(wěn)定劑。

在任何所提供的組合物的另一個實施方案中，各合成納米載體的群的合成納米載體包含基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹狀聚合物、巴克球(buckyball)、納米線、病毒樣顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物納米顆粒、球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、金字塔形納米顆粒、長方形納米顆粒、圓柱形納米顆?；颦h(huán)形納米顆粒。在一個實施方案中，各合成納米載體的群包含一種或多種聚合物。在另一個實施方案中，該一種或多種聚合物包含一種聚酯。在再另一個實施方案中，該一種或多種聚合物包含或另外包含一種偶合到親水聚合物上的聚酯。在又另一個實施方案中，該聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己內(nèi)酯。在另一個實施方案中，該親水聚合物包含一種聚醚。在再另一個實施方案中，該聚醚包含聚乙二醇。

另一個方面，提供一種方法，該方法包括給予一位受試者任何所提供的組合物。在一個實施方案中，該受試者罹患或有風(fēng)險罹患一種感染或感染性疾病。在另一個實施方案中，該受試者罹患或有風(fēng)險罹患癌癥。在又另一個實施方案中，該受試者罹患或有風(fēng)險罹患成癮。在另一個實施方案中，該組合物通過經(jīng)口、皮下、經(jīng)肺、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予來給藥。

又另一個方面，提供一種方法，該方法包括制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；并且將該第一和該第二群合成納米載體組合于一個劑型中，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

另一個方面，提供一種方法，該方法包括制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；并且將該第一和該第二群合成納米載體組合于一個劑型中，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。在一個實施方案中，該方法另外包括給予一位受試者該劑型。在另一個實施方案中，該方法另外包括確定是否對各組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對各組表面抗原具有特異性的抗體滴度。在另一個實施方案中，該方法另外包括確定有效對各組表面抗原產(chǎn)生該免疫應(yīng)答的量。

再另一個方面，提供一種用于制造組合物的劑型的方法，該方法包括如在此提供的任何方法中所定義的方法步驟。

在一個實施方案中，任何所提供的組合物用于治療或預(yù)防中。在另一個實施方案中，任何所提供的組合物用于在此提供的任何方法中。在又另一個實施方案中，任何所提供的組合物用于治療或預(yù)防感染或感染性疾病的方法中。在再另一個實施方案中，任何所提供的組合物用于治療或預(yù)防癌癥的方法中。在另一個實施方案中，任何所提供的組合物用于治療或預(yù)防成癮的方法中。

在另一個實施方案中，任何這些方法包含通過經(jīng)口、皮下、經(jīng)肺、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予來給予任何這些組合物。

又另一個方面，提供任何所提供的組合物的用途，用于制造供在任何所提供的方法中使用的藥劑。

附圖說明

圖1示出了未免疫的小鼠和注射過nc-nic和nc-ova(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗煙堿(深灰色條)和抗卵白蛋白(淺灰色條)抗體滴度。

圖2示出了未免疫的小鼠和注射過nc-nic-ova和nc-l2(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗煙堿、抗卵白蛋白以及抗l2肽抗體滴度。

圖3示出了未免疫的小鼠和注射過nc-nic-ova和nc-m2e-l2(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗煙堿、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。

圖4示出了未免疫的小鼠和注射過nc-m2e和nc-l2(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗m2e肽和抗l2肽抗體滴度。

圖5示出了未免疫的小鼠和注射過nc-ha5和nc-ova(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗ha5蛋白質(zhì)和抗卵白蛋白蛋白質(zhì)抗體滴度。

圖6示出了未免疫的小鼠和注射過nc-ha5、nc-ova以及nc-m2e-l2(5只動物/組；s.c.，每次注射100μg各nc，以3-周為間隔進(jìn)行2次)的小鼠的抗ha、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。

圖7示出了用nc-m2e、nc-l2肽以及nc-煙堿-卵白蛋白的組合免疫過的小鼠的抗體滴度。

圖8示出了用nc-3′-煙堿和nc-1′-煙堿的組合免疫過的小鼠的抗體滴度。

具體實施方式

在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不受特別例證的材料或工藝參數(shù)限制，因為這些材料和工藝參數(shù)當(dāng)然可以變化。還應(yīng)理解，在此使用的術(shù)語僅出于描述本發(fā)明的特定實施方案的目的，并且不打算對使用替代性術(shù)語描述本發(fā)明進(jìn)行限制。

在此引用的所有公布、專利以及專利申請，無論上文還是下文，都出于所有目的特此通過引用以其全文結(jié)合在此。

除非發(fā)明內(nèi)容另有明確規(guī)定，否則如本說明書和隨附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“一(a/an)”和“該”包括復(fù)數(shù)指示物。舉例來說，提及“一種聚合物”包括兩種或更多種此類分子的混合物，提及“一種溶劑”包括兩種或更多種此類溶劑的混合物，提及“一種粘合劑”包括兩種或更多種此類材料的混合物，等等。

引言

諸位發(fā)明人已出乎意料并且出人意料地發(fā)現(xiàn)上文指出的問題和限制可以通過實施在此披露的發(fā)明來克服。具體地說，諸位發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，有可能提供發(fā)明的組合物和相關(guān)方法，這些組合物和方法通過提供一種組合物來解決本領(lǐng)域的問題和限制，該組合物包含一個劑型，該劑型包含：一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

另一個方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含：一個劑型，該劑型包含：一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

一個方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含：一個劑型，該劑型包含：一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

一個方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含：一個劑型，該劑型包含：一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

另一個方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法包括：制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及將該第一和第二群合成納米載體組合于一個劑型中；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

又另一個方面，本發(fā)明提供一種方法，該方法包括：制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及將該第一和第二群合成納米載體組合于一個劑型中；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

已發(fā)現(xiàn)，有可能產(chǎn)生對應(yīng)地包含第一和第二組表面抗原的第一和第二群合成納米載體，這些納米載體可以與一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑組合在一起產(chǎn)生一個劑型。在某些實施方案中，此劑型可以用作多價疫苗。諸位發(fā)明人另外指出了本發(fā)明劑型產(chǎn)生中的某些優(yōu)點(diǎn)，特別是相對于常規(guī)的多價疫苗。這些優(yōu)點(diǎn)包括但不限于使常規(guī)多價疫苗中的一個問題疫苗體積最小化，和使在常規(guī)的蛋白質(zhì)載體-半抗原多價疫苗中存在的可以導(dǎo)致非特異性結(jié)合和沉淀的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用最小化。

本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是包含多組表面抗原的不同群的合成納米載體的組合允許使用不同的方法來使不同組的表面抗原偶合到不同群的合成納米載體上。這可以是需要不相容的偶合方法來使多組表面抗原偶合到多群合成納米載體上的實施方案的重要的優(yōu)點(diǎn)。舉例來說，針對鏈球菌肺炎的疫苗(艾伯塔科研委員會(albertaresearchcouncil)的美國專利6,132,723和惠氏(wyeth)的wo2008/143709)包含多個抗原。因為不是所有多糖抗原的連接化學(xué)條件都相同(wo2008/143709)，所以在單個偶合環(huán)境中將所有表面抗原連接到單個群的合成納米載體上的偶合方法將不是所希望的。實施不同群的合成納米載體首先偶合到某些組的表面抗原并且然后組合的本發(fā)明的實施方案可以改善本領(lǐng)域中所提出的問題。

可以受益于本發(fā)明的這一實施方案的多價疫苗的另一個實例包含基于多糖并且多價的針對腦膜炎奈瑟菌的疫苗。此類實施方案可以針對腦膜炎奈瑟菌a和c群(二價的)或a、c、w135以及y群(四價的)。

這些實例說明根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，其中肽、多糖、小分子等結(jié)合到第一群合成納米載體和/或第二群合成納米載體上。這些群然后結(jié)合形成一種根據(jù)本發(fā)明的組合物。

現(xiàn)將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

定義

“濫用的物質(zhì)”是受試者(例如人類)出于除物質(zhì)指示的目的以外的目的或以除醫(yī)師所指導(dǎo)的以外的方式或量而服用的任何物質(zhì)。在一些實施方案中，濫用的物質(zhì)是上癮的物質(zhì)。在一些實施方案中，用于包括在納米載體中的濫用的物質(zhì)是完全分子、類似物或其部分。“上癮的物質(zhì)”是引起癡迷、強(qiáng)迫或物理依賴或心理依賴的物質(zhì)。在一些實施方案中，用于包括在納米載體中的上癮的的物質(zhì)是完全分子、類似物或其部分。

“佐劑”意指一種不構(gòu)成特異性抗原但增強(qiáng)所給予的抗原(例如伴隨給予的抗原)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和壽命的試劑。這樣的佐劑可以包括但不限于：模式識別受體(如toll樣受體、rig-1和nod樣受體(nlr))的刺激劑、礦物鹽(例如明礬，與腸道細(xì)菌(例如大腸埃希氏桿菌、明尼蘇達(dá)沙門菌、鼠傷寒沙門菌、或弗氏志賀菌)的單磷酰脂質(zhì)(monphosphoryllipid，mpl)a組合的明礬或分別與(as04)、以上提到的細(xì)菌的mpla特異性組合的明礬)、皂苷(如qs-21、quil-a、iscoms、iscomatrix^tm)、乳液(如mf59^tm、isa51和isa720)、as02(qs21+角鯊烯+)、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體配制品(如as01)、as15、合成的或特別制備的微粒和微載體(如淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和其他細(xì)菌的衍生自細(xì)菌的外膜泡(omv))、或殼聚糖顆粒、貯存形成劑(如嵌段共聚物)、特異性修飾或制備的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如rc529)、或蛋白質(zhì)(如細(xì)菌類毒素或毒素片段)。

在實施方案中，佐劑包括針對模式識別受體(prr)(包括但不限于toll樣受體(tlr)，特別是tlr2、3、4、5、7、8、9和/或其組合)的激動劑。在其他實施方案中，佐劑包含針對toll樣受體3的激動劑、針對toll樣受體7和8的激動劑、或針對toll樣受體9的激動劑；所述佐劑優(yōu)選地包括咪唑并喹啉(如r848)；腺嘌呤衍生物(如美國專利權(quán)6,329,381(住友制藥公司(sumitomopharmaceuticalcompany))、比戛迪克(biggadike)等人的us公布專利申請2010/0075995、或坎坡斯(campos)等人的wo2010/018132中所披露的那些)；免疫刺激性dna；或免疫刺激性rna。

在具體的實施方案中，合成的納米載體合并了化合物作為佐劑，它們是針對toll樣受體(tlr)7&8的激動劑(“tlr7/8激動劑”)。它的效用是托馬伊(tomai)等人的美國專利6,696,076中披露的tlr7/8激動劑化合物，包括但不限于咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、以及1，2-橋接咪唑并喹啉胺。優(yōu)選的佐劑包括咪喹莫特和瑞喹莫德(也稱為r848)。在具體的實施方案中，合成的納米載體合并了一種針對toll樣受體(tlr)-9的配體(如cpgs)，它誘導(dǎo)類型i干擾素產(chǎn)生并且刺激t和b細(xì)胞活化，產(chǎn)生增加的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答(克力克(krieg)等人，細(xì)菌dna中的cpg基元觸發(fā)直接b細(xì)胞活化(cpgmotifsinbacterialdnatriggerdirectbcellactivation)，自然(nature)1995.374：546-549；朱(chu)等人，cpg寡脫氧核苷酸充當(dāng)接通t輔助細(xì)胞1型(th1)免疫性的佐劑(cpgoligodeoxynucleotidesactasadjuvantsthatswitchonthelper1(th1)immunity)，實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)1997.186：1623-1631；利甫福德(lipford)等人，含有cpg的合成寡核苷酸促進(jìn)對蛋白質(zhì)抗原產(chǎn)生的b細(xì)胞和細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答：一種新型疫苗佐劑(cpg-containingsyntheticoligonucleotidespromotebandcytotoxictcellresponsestoproteinantigen：anewclassofvaccineadjuvants)，歐洲免疫學(xué)雜志(eur.j.immunol)1997.27：2340-2344；羅曼(roman)等人，免疫刺激性dna序列充當(dāng)促進(jìn)t輔助細(xì)胞1型的佐劑(immunostimulatorydnasequencesfunctionasthelper-1-promotingadjuvants)，自然醫(yī)學(xué)(nat.med.)1997.3∶849-854；戴維斯(davis)等人，cpgdna是用重組b型肝炎表面抗原免疫的小鼠中特異性免疫的有效增強(qiáng)劑(cpgdnaisapotentenhancerofspecificimmunityinmiceimmunizedwithrecombinanthepatitisbsurfaceantigen)，免疫學(xué)雜志(j.immunol.)1998.160：870-876；利甫福德(lipford)等人，作為免疫細(xì)胞活化劑的細(xì)菌dna(bacterialdnaasimmunecellactivator)，微生物趨勢(trendsmicrobiol)1998.6：496-500；克力克等人的美國專利6,207,646；塔克(tuck)等人的美國專利7,223,398；范內(nèi)斯特(vannest)等人的美國專利7,250,403；或克力克等人的美國專利7,566,703)。

在具體的實施方案中，佐劑可以是dc表面分子cd40的激動劑。在某些實施方案中，為了刺激免疫性而不是耐受性，合成的納米載體合并了促進(jìn)dc成熟(對于引發(fā)初始t細(xì)胞而言是需要的)以及細(xì)胞因子(例如類型i干擾素，它促進(jìn)抗體免疫應(yīng)答和抗病毒免疫性)的產(chǎn)生的佐劑。在實施方案中，佐劑還可以包括免疫刺激rna分子(如但不限于dsrna、ssrna、聚i：c或聚i：聚c12u(以獲得，聚i：c與聚i：聚c12u兩者都稱為tlr3刺激劑)、和/或在海爾(f.heil)等人，“經(jīng)由toll樣受體7和8種屬特異性識別單鏈rna(species-specificrecognitionofsingle-strandedrnaviatoll-likereceptor7and8)”科學(xué)(science)303(5663)，1526-1529(2004)；福爾默(j.vollmer)等人，“通過化學(xué)修飾的核糖核苷和寡核糖核苷酸進(jìn)行的免疫調(diào)節(jié)(immunemodulationbychemicallymodifiedribonucleosidesandoligoribonucleotides)”wo2008033432a2；福爾斯巴赫(a.forsbach)等人，“含有特異性序列基元并且靶向toll樣受體8通路的免疫刺激性寡核糖核苷酸(immunostimulatoryoligoribonucleotidescontainingspecificsequencemotif(s)andtargetingthetoll-likereceptor8pathway”wo2007062107a2；烏爾曼(e.uhlmann)等人，“具有增強(qiáng)的免疫疫刺激性活性的修飾的寡核糖核苷酸類似物(modifiedoligoribonucleotideanalogswithenhancedimmunostimulatoryactivity)”美國專利申請公布us2006241076；利甫福德(g.lipford)等人，“免疫刺激性病毒性rna寡核糖核苷酸和其用于治療癌癥和感染的用途(immunostimulatoryviralrnaoligonucleotidesandusefortreatingcancerandinfections)”wo2005097993a2；g.lipford(利甫福德)等人，“免疫刺激性含g，u的寡核糖核苷酸、組合物以及篩選方法(immunostimulatoryg，u-containingoligoribonucleotides，compositions，andscreeningmethods)”wo2003086280a2中披露的那些。

在一些實施方案中，一種佐劑可以是tlr-4激動劑，如細(xì)菌性脂多糖(lps)、vsv-g、和/或hmgb-1。在一些實施方案中，佐劑可以包括tlr-5激動劑(如鞭毛蛋白)或其部分或衍生物，包括但不限于美國專利6,130,082、6,585,980以及7,192,725中所披露的那些。

在一些實施方案中，佐劑可以是從壞死細(xì)胞釋放的促發(fā)炎刺激物(例如尿酸鹽晶體)。在一些實施方案中，佐劑可以是補(bǔ)體級聯(lián)的活化組分(例如cd21、cd35，等)。在一些實施方案中，佐劑可以是免疫復(fù)合物的活化組分。這些佐劑還包括補(bǔ)體受體激動劑(如結(jié)合到cd21或cd35上的分子)。在一些實施方案中，補(bǔ)體受體激動劑誘導(dǎo)合成納米載體的內(nèi)生補(bǔ)體調(diào)理作用。在一些實施方案中，佐劑是細(xì)胞因子，它是由細(xì)胞釋放的小的蛋白質(zhì)或生物因子(在5kd-20kd的范圍內(nèi))，并且對細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、聯(lián)通以及其他細(xì)胞的行為具有特異性作用。在一些實施方案中，細(xì)胞因子受體激動劑是小分子、抗體、融合蛋白或適體。

在實施方案中，至少一部分佐劑劑量可以偶合到合成納米載體上，優(yōu)選地所有佐劑劑量偶合到合成納米載體上。在其他實施方案中，至少一部分佐劑劑量并不偶合到合成納米載體上。在實施方案中，佐劑劑量包括兩種或更多種類型的佐劑。例如，而沒有限制，可以組合作用于不同tlr受體的佐劑。作為一個實例，在一個實施方案中，tlr7/8激動劑可以與tlr9激動劑組合。在另一個實施方案中，tlr7/8激動劑可以與tlr4激動劑組合。在又另一個實施方案中，tlr9激動劑可以與tlr3激動劑組合。

“給予”或“給藥”意指以藥物學(xué)上有用的方式提供物質(zhì)給受試者。

“有效量”是組合物的產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應(yīng)答的任何量。此量可以出于體外或體內(nèi)目的。出于體內(nèi)目的，該量可以是健康開業(yè)醫(yī)師將認(rèn)為可以對需要一種或多種抗原特異性抗體應(yīng)答的受試者具有臨床益處的量?！翱贵w應(yīng)答”意指導(dǎo)致b細(xì)胞產(chǎn)生或刺激和/或抗體產(chǎn)生的任何免疫應(yīng)答。在實施方案中，因此，有效量是健康開業(yè)醫(yī)師將認(rèn)為可以針對在此提供的本發(fā)明組合物的表面抗原產(chǎn)生抗體應(yīng)答的量。有效量可以通過常規(guī)方法監(jiān)測。有效產(chǎn)生一種或多種所希望的免疫應(yīng)答的量還可以是在此提供的組合物產(chǎn)生所希望的治療終點(diǎn)或所希望的治療結(jié)果的量。因此，在其他實施方案中，有效量是臨床醫(yī)師將認(rèn)為將向在此提供的受試者提供治療益處(包括預(yù)防性益處)的量。此類受試者包括罹患或有風(fēng)險罹患癌癥、感染或感染性疾病的那些。

在實施方案中，在此提供的任何本發(fā)明組合物的這種或這些抗原可以是有效量的。在一些實施方案中，有效量是健康開業(yè)醫(yī)師將認(rèn)為可以針對在此提供的組合物的多組表面抗原產(chǎn)生抗體滴度的量?！翱贵w滴度”意指產(chǎn)生可測量水平的抗體?？贵w應(yīng)答或抗體滴度的產(chǎn)生優(yōu)選地是在人類中。在一些實施方案中，抗體是某種同種型的抗體，如igg或其子類。本領(lǐng)域已知抗體滴度的測量方法并且這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。抗體應(yīng)答的測量方法還在實例中略為詳細(xì)地進(jìn)行了描述。抗體應(yīng)答或抗體滴度優(yōu)選地對一組表面抗原具有特異性。在合成納米載體除針對一種特異性免疫應(yīng)答(如抗體應(yīng)答或抗體滴度)的一組表面抗原以外還包括通用抗原的一些實施方案中，該免疫應(yīng)答對該組表面抗原但不對通用抗原具有特異性。

有效量當(dāng)然將取決于所治療的具體受試者；病狀、疾病或病癥的嚴(yán)重程度；個別患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時間；并行治療(如果有)的性質(zhì)；具體的給藥途徑以及健康開業(yè)醫(yī)師的知識和專業(yè)知識內(nèi)的類似因素。這些因素為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，并且可以僅僅用常規(guī)實驗方法解決?？傮w上優(yōu)選的是使用“最大劑量”，即根據(jù)合理醫(yī)藥判斷的最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解，出于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或幾乎任何其他原因，患者可以堅持較低劑量或耐受劑量。

“抗原”意指b細(xì)胞抗原或t細(xì)胞抗原。在實施方案中，抗原偶合到合成納米載體上。在其他實施方案中，抗原并未偶合到合成納米載體上。在實施方案中，抗原與合成納米載體共給予。在其他實施方案中，抗原不與合成納米載體共給予?！耙环N或多種類型的抗原”意指共享相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的抗原特征的分子。

“至少一部分劑量”意指劑量的至少某部分，范圍高達(dá)包括所有劑量。

“有風(fēng)險”受試者是健康開業(yè)醫(yī)師認(rèn)為有可能罹患在此提供的疾病或病狀的受試者，該疾病或病狀包括但不限于感染、感染性疾病、癌癥或成癮。

“b細(xì)胞抗原”意指b細(xì)胞中或b細(xì)胞所識別并且在b細(xì)胞中觸發(fā)免疫應(yīng)答的任何抗原(例如由b細(xì)胞上的b細(xì)胞受體所特異性識別的抗原)。在一些實施方案中，是t細(xì)胞抗原的抗原也是b細(xì)胞抗原。在其他實施方案中，t細(xì)胞抗原并不也是b細(xì)胞抗原。b細(xì)胞抗原包括但不限于：蛋白質(zhì)、肽、小分子、碳水化合物、寡糖以及多糖。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原是非蛋白質(zhì)抗原(即不是蛋白質(zhì)或肽抗原)。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括與感染因子締合的碳水化合物、寡糖或多糖。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括與感染因子締合的糖蛋白或糖肽。感染因子可以是細(xì)菌、病毒、真菌、原生動物或寄生蟲。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括免疫原性差的抗原。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括濫用的或上癮的物質(zhì)或其一部分或類似物。上癮的物質(zhì)包括但不限于煙堿、麻醉藥、咳嗽抑制劑、安神劑、以及鎮(zhèn)靜劑。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括毒素，如來自化學(xué)武器或天然來源的毒素。b細(xì)胞抗原還可以包括危險的環(huán)境因素。在一些實施方案中，b細(xì)胞抗原包括一種自身抗原。在其他實施方案中，b細(xì)胞抗原包括異體抗原、變應(yīng)原、接觸性致敏原、退行性疾病抗原、半抗原、感染性疾病抗原、癌抗原、特應(yīng)性疾病抗原、自身免疫疾病抗原、上癮的物質(zhì)、異種抗原、或代謝性疾病酶或其酶產(chǎn)物。

“偶合”或“偶合了”或“偶合了的”(等等)意指使一種實體(例如部分)與另一個在化學(xué)上締合。在一些實施方案中，偶合是共價的，意指偶合在兩個實體之間存在共價鍵的情況下發(fā)生。在非共價的實施方案中，通過非共價相互作用介導(dǎo)非共價偶合，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。在實施方案中，封裝是偶合的一種形式。

“衍生”意指從原始來源改編或修改。舉例來說，作為一個非限制性實例，衍生自感染性病毒株的肽抗原可以具有數(shù)個非天然氨基酸殘基，這些非天然氨基酸殘基取代感染性病毒株中可見的原始抗原中可見的天然氨基酸殘基。這些改編或修飾可以由于種種原因，包括但不限于增加的特異性、更容易的抗原加工、或改進(jìn)的安全性。

在實施方案中，具有與天然肽或核酸(優(yōu)選天然共同肽或核酸)僅50％一致性的肽或核酸將被稱為衍生自天然肽或核酸。在實施方案中，對物質(zhì)實質(zhì)上進(jìn)行修飾。實質(zhì)上經(jīng)過修飾的物質(zhì)意指經(jīng)過修飾使得該修飾顯著影響所討論物質(zhì)的化學(xué)或免疫學(xué)特性的物質(zhì)。如果所述衍生的肽和核酸相比于天然肽或核酸具有改變的化學(xué)或免疫學(xué)特性，那么衍生的肽和核酸還可以包括具有與天然肽或核酸序列大于50％一致性的序列的那些。這些化學(xué)或免疫學(xué)特性包括親水性、穩(wěn)定性、親和性、以及與載體(如合成納米載體)偶合的能力。

“劑型”意指在培養(yǎng)基、載體、媒劑或器件中的適用于給予受試者的藥理學(xué)和/或免疫學(xué)活性物質(zhì)(如疫苗)。

“封裝”或“封裝的”意指密封在合成納米載體內(nèi)，優(yōu)選完全密封在合成納米載體內(nèi)。被封裝的大部分或所有物質(zhì)不暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。封裝與吸收不同，吸收將大部分或所有物質(zhì)放置在合成納米載體的表面上，并且使物質(zhì)暴露于合成納米載體外的局部環(huán)境。

“在免疫上不同”是指在通過免疫產(chǎn)生的血清產(chǎn)生一個針對各表面抗原的獨(dú)特的抗體應(yīng)答譜圖時可以指出的某些表面抗原之間的差異。表面抗原特異性抗體將僅識別一個特異性組的表面抗原，并且將以可區(qū)別的結(jié)合模式結(jié)合到其他組的表面抗原上。舉例來說，如果用一組表面抗原a免疫，那么所產(chǎn)生的抗血清將結(jié)合到表面抗原a的組，但不結(jié)合到表面抗原b的組。如果兩個或更多個表面抗原組合在單個合成納米載體上，那么可以設(shè)計將相對于兩組表面抗原區(qū)分血清的結(jié)合模式的淘選分析。在實施方案中，第一組表面抗原和第二組表面抗原在免疫上不同。在其他實施方案中，第一組表面抗原、第二組表面抗原以及第三組表面抗原全部在免疫上不同。

“感染”或“感染性疾病”是由微生物、病原體或其他因子(如細(xì)菌、真菌、朊病毒或病毒)引起的任何病狀或疾病。在此提供的本發(fā)明組合物的表面抗原可以從任何感染因子獲得或衍生，例如在此提供的可以引起感染或感染性疾病的那些。

“感染性屬”意指包括能夠感染受試者的有機(jī)體的屬。在實施方案中，表面抗原可以從第一感染性屬獲得或衍生，或從第二感染性屬獲得或衍生。在實施方案中，該第一感染性屬與該第二感染性屬相同。在其他實施方案中，該第一感染性屬與該第二感染性屬不同。

“感染性種”意指包括能夠感染受試者的有機(jī)體的種。在實施方案中，表面抗原可以從第一感染性種獲得或衍生，或從第二感染性種獲得或衍生。在實施方案中，該第一感染性種與該第二感染性種屬于相同屬。在其他實施方案中，該第一感染性種與該第二感染性種也相同。在一些實施方案中，該第一感染性種與該第二感染性種不同，但屬于相同屬。在其他實施方案中，這些不同的感染性種屬于不同的屬。

“感染性病毒株”意指包括能夠感染受試者的有機(jī)體的病毒株。在實施方案中，表面抗原可以從第一感染性病毒株獲得或衍生，或從第二感染性病毒株獲得或衍生。在實施方案中，該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株屬于相同種。在其他實施方案中，該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株也相同。在又其他實施方案中，他們屬于相同種，但屬于不同病毒株。在一些實施方案中，該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株屬于不同種，但屬于相同屬。

“分離的核酸”意指從核酸的天然環(huán)境中分離并且以足以允許鑒別或使用的數(shù)量存在的核酸。分離的核酸可以是(i)在體外通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增；(ii)通過克隆重組生產(chǎn)；(iii)如通過切割和凝膠分離進(jìn)行純化；或(iv)通過例如化學(xué)合成而合成的核酸。分離的核酸是可以通過本領(lǐng)域中眾所周知的重組dna技術(shù)容易地操作的核酸。因此，認(rèn)為已知5′和3′限制位點(diǎn)或已披露聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)引物序列的載體中包含的核苷酸序列是分離的，但以天然狀態(tài)存在于天然宿主中的核酸序列不是。分離的核酸可以是實質(zhì)上純化的，但不必是。舉例來說，在克隆或表達(dá)載體內(nèi)分離的核酸是不純的，因為它可能包含僅微小百分比的它所存在的細(xì)胞中的物質(zhì)。但是，如同在此使用該術(shù)語，該核酸為分離的，因為它可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地操作。在此提供的任何核酸可以是分離的。在一些實施方案中，在此提供的組合物中的抗原以分離的核酸的形式存在，如編碼抗原肽、多肽或蛋白質(zhì)的分離的核酸。

“分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)”意指肽、多肽或蛋白質(zhì)從它的天然環(huán)境分離并且以足以允許其鑒別或使用的數(shù)量存在。這表示例如這些多肽可以被(i)通過表達(dá)克隆選擇性地生產(chǎn)或(ii)如通過色譜法或電泳進(jìn)行純化。分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以是(但不必是)實質(zhì)上純的。因為分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可以與藥物制劑中的藥物學(xué)上可接受的載體混合，所以肽、多肽或蛋白質(zhì)可以僅占該制劑的小重量百分比。盡管如此，該肽、多肽或蛋白質(zhì)是分離的，因為它已經(jīng)與生物系統(tǒng)中它可能締合的物質(zhì)分開，即與其他肽、多肽或蛋白質(zhì)分離。在此提供的任何肽、多肽或蛋白質(zhì)可以是分離的。在一些實施方案中，在此提供的組合物中的抗原是肽、多肽或蛋白質(zhì)。

“合成納米載體的最大尺寸”意指沿合成納米載體的任何軸測量的納米載體的最大尺寸?！昂铣杉{米載體的最小尺寸”意指沿合成納米載體的任何軸測量的合成納米載體的最小尺寸。舉例來說，對于球形合成納米載體，合成納米載體的最大和最小尺寸應(yīng)該是實質(zhì)上一致的，并且應(yīng)該是它的直徑的大小。類似地，對于立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸應(yīng)該是它的高度、寬度或長度中最小的那個，而合成納米載體的最大尺寸應(yīng)該是它的高度、寬度或長度中最大的那個。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸是大于100nm。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最小尺寸等于或大于110nm，更優(yōu)選等于或大于120nm，更優(yōu)選等于或大于130nm，并且再更優(yōu)選等于或大于150nm。本發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以取決于實施方案而變化。舉例來說，合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以從1∶1到1,000,000∶1、優(yōu)選從1∶1到100,000∶1、更優(yōu)選從1∶1到1000∶1、再優(yōu)選從1∶1到100∶1、并且又更優(yōu)選從1∶1到10∶1變化。優(yōu)選地，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選等于或小于2μm、更優(yōu)選等于或小于1μm、更優(yōu)選等于或小于800nm、更優(yōu)選等于或小于600nm、并且再更優(yōu)選等于或小于500nm。在優(yōu)選的實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的合成納米載體的最大尺寸是等于或大于100nm、更優(yōu)選等于或大于120nm、更優(yōu)選等于或大于130nm、更優(yōu)選等于或大于140nm、并且仍更優(yōu)選等于或大于150nm。通過將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性)介質(zhì)中，并且使用動態(tài)光散射(例如使用一臺brookhavenzetapals儀器)獲得合成納米載體大小的測量值。

“分子量小于10,000”意指基于分子的分子結(jié)構(gòu)計算的分子量小于10,000。

“獲得”意指從一個來源獲得不進(jìn)行實質(zhì)性修飾。實質(zhì)性修飾是顯著影響所討論物質(zhì)的化學(xué)或免疫學(xué)特性的修飾。舉例來說，作為一個非限制性實例，序列與天然肽或核苷酸序列(優(yōu)選天然共同肽或核苷酸序列)具有大于90％、優(yōu)選大于95％、優(yōu)選大于97％、優(yōu)選大于98％、優(yōu)選大于99％、優(yōu)選100％的一致性，并且具有不顯著不同于天然肽或核酸的化學(xué)和/或免疫學(xué)特性的肽或核酸將被稱為是獲自天然肽或核苷酸序列。這些化學(xué)或免疫學(xué)特性包括親水性、穩(wěn)定性、親和性、以及與載體(如合成納米載體)偶合的能力。在實施方案中，所獲得的物質(zhì)已取自原始來源并且未曾進(jìn)行改編或修飾。舉例來說，在實施方案中，獲自一種來源的抗原可以包括可見于此來源中的原始氨基酸殘基序列。在其他實施方案中，舉例來說，獲自一種來源的抗原可以包括可見于此來源中的原始分子結(jié)構(gòu)。

“一種或多種寡糖”意指包含幾個(典型地兩個到二十個)通過糖苷鍵連接的糖單元的糖聚合物。在高數(shù)目糖單元下，寡糖可以包括多糖。

“一種或多種肽”意指包含主要通過相鄰氨基酸殘基的羧基與氨基之間的肽鍵接合在一起的氨基酸殘基并且具有100個或更少的氨基酸殘基的化合物。出于不同的目的，如穩(wěn)定或偶合，肽中的某些肽鍵可以由其他鍵類型替代。

“藥物學(xué)上可接受的賦形劑(或載體)”意指與所述合成納米載體一起用來配制本發(fā)明的組合物的藥理學(xué)上無活性的物質(zhì)。藥理學(xué)上無活性的物質(zhì)可以添加到本發(fā)明的劑型中以進(jìn)一步促進(jìn)組合物的給予。藥物學(xué)上可接受的賦形劑包括本領(lǐng)域中已知的多種物質(zhì)，包括但不限于糖(如葡萄糖、乳糖等)、防腐劑(如抗微生物劑)、復(fù)水助劑、著色劑、生理鹽水(如磷酸鹽緩沖的生理鹽水)以及緩沖劑。藥物學(xué)上可接受的賦形劑的實例(但不限于)包括碳酸鈣、磷酸鈣、不同的稀釋劑、不同的糖以及各種淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇、防腐劑、不同的藥物載體、無菌生理鹽水、凍干穩(wěn)定劑等。組合物可以使用常規(guī)的藥物制造和配合技術(shù)獲得有用劑型來制備。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮于供注射的無菌的生理鹽水溶液中。

“一種或多種多糖”意指由許多通過糖苷鍵連接的糖單元構(gòu)成的糖聚合物。在低數(shù)目糖單元下，多糖可以包括寡糖。

“群”意指共享一個或多個共同的物理或化學(xué)特征的合成納米載體的一個定義組。共同的物理或化學(xué)特征可以包括具有一組共同的表面抗原、共同的偶合佐劑、構(gòu)成大塊納米載體的共同的材料、共同的形狀、共同的粒度，等等?？梢澡b別多個群的合成納米載體，例如第一群、第二群、第三群、第四群，等等。在一個實施方案中，可以呈現(xiàn)三個或更多個群的合成納米載體，優(yōu)選地其中各群合成納米載體包括一組表面抗原；并且其中各組表面抗原在結(jié)構(gòu)上或在免疫上彼此不同。

“一種或多種蛋白質(zhì)”意指分子量典型地大于1000道爾頓的包含主要通過相鄰氨基酸殘基的羧基與氨基之間的肽鍵接合在一起的氨基酸殘基的化合物。蛋白質(zhì)還可以包括其他鍵結(jié)結(jié)構(gòu)，如二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，等等。出于不同的目的，例如穩(wěn)定或偶合，蛋白質(zhì)中的某些肽鍵可以由其他鍵類型替代。

“單價表面抗原的組”意指一組表面抗原，其中表面抗原不是不同，優(yōu)選地不是在結(jié)構(gòu)上和/或在免疫上不同。在實施方案中，單價表面抗原的組包含多個復(fù)本的一種類型的不是在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同的表面抗原(即多個復(fù)本的相同抗原)。在一些實施方案中，多個復(fù)本的此相同抗原可以串聯(lián)(strung)在一起，如美國公布2003/0223938中說明的那樣。包含多個復(fù)本的一種類型的不是在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同的表面抗原的一組單價的表面抗原不是一組低價(或多價)的表面抗原。

“低價(或多價)的表面抗原的組”意指一組表面抗原，其中存在有限數(shù)目、即大于一個的不同類型的表面抗原，優(yōu)選地其中差異包括結(jié)構(gòu)差異和/或免疫學(xué)差異。在優(yōu)選實施方案中，該組中的有限數(shù)目的表面抗原包括2到15種類型的表面抗原，優(yōu)選地2到10種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到8種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到7種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到6種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到5種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到4種類型的表面抗原，更優(yōu)選地2到3種類型的表面抗原，并且甚至更優(yōu)選地2種類型的表面抗原。在其他實施方案中，該低價(或多價的表面抗原)的組包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種或更多種類型的表面抗原。

“表面抗原的組”意指一組經(jīng)過鑒別的表面抗原，優(yōu)選地基于它們的特性、優(yōu)選地它們的結(jié)構(gòu)和/或它們的免疫學(xué)特性通過測量和/或預(yù)測來鑒別。一組表面抗原可以基于使用用于合成該組表面抗原和/或包括該組表面抗原的合成納米載體的群的化學(xué)合成方法以及用于偶合它們的化學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測來部分地或完全地進(jìn)行鑒別。可以鑒別多個組的表面抗原；例如第一組、第二組、第三組等。

“在結(jié)構(gòu)上不同”或“結(jié)構(gòu)差異”意指呈現(xiàn)不同的用于與b細(xì)胞受體相互作用的分子結(jié)構(gòu)。在實施方案中，此差異可以通過比較一組表面抗原中所呈現(xiàn)的抗原的占有率(prevalence)和類型與不同組表面抗原中所呈現(xiàn)的抗原的占有率和類型來表示。如果這些組之間的所呈現(xiàn)的抗原的占有率和/或類型不同，那么可以認(rèn)為這些組的表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。在實施方案中，所呈現(xiàn)的抗原的占有率和/或類型的差異可以通過比較用于產(chǎn)生表面抗原和/或?qū)⒈砻婵乖己系胶铣杉{米載體的一個表面的化學(xué)合成策略與配制策略來確定。舉例來說，在一個實施方案中，如果使用一種或多種特別的化合物產(chǎn)生一組表面抗原，并且使用一種或多種不同的化合物產(chǎn)生另一組表面抗原，那么可以確定這兩組表面抗原是不同的。在一個不同的實施方案中，如果使用三種化合物產(chǎn)生表面抗原以形成一個具有三個表面抗原的組，并且使用兩種化合物產(chǎn)生其他的表面抗原以形成一個具有兩個表面抗原的組，那么可以確定這兩組表面抗原是不同的。在又另一個實施方案中，如果使用非不同的化學(xué)合成策略和配制策略(包括使用非不同量的物質(zhì)--在實驗誤差范圍內(nèi)--在策略中)產(chǎn)生兩組表面抗原并且(適當(dāng)時)將這兩組表面抗原偶合到合成納米載體的表面上，并且這兩組表面抗原具有相同的構(gòu)象和定向，那么這兩組表面抗原很可能不會在結(jié)構(gòu)上不同。在實施方案中，第一組表面抗原與第二組表面抗原之間的結(jié)構(gòu)差異包括非不同組的分子，這些分子所呈現(xiàn)的定向在第一組與第二組表面抗原之間不同。在實施方案中，第一組表面抗原與第二組表面抗原之間的結(jié)構(gòu)差異包括非不同組的分子，這些分子所呈現(xiàn)的構(gòu)象在第一組與第二組表面抗原之間不同。在實施方案中，第一組表面抗原與第二組表面抗原之間的結(jié)構(gòu)差異包括多組分子，它們的分子結(jié)構(gòu)在第一組與第二組表面抗原之間不同。

“受試者”意指動物，包括溫血哺乳動物，如人類和靈長類動物；禽類；家庭馴養(yǎng)動物或農(nóng)用動物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實驗動物，如小鼠、大鼠以及天竺鼠；魚；爬行動物；動物園動物和野生動物；等。

“一種或多種表面抗原”意指可見于合成納米載體的一個表面上或表面周圍的抗原。在優(yōu)選實施方案中，表面抗原包括b細(xì)胞抗原。在實施方案中，表面抗原偶合到合成納米載體的一個表面上。

“一種或多種合成納米載體”意指未見于自然界中并且擁有至少一個小于或等于5微米大小的尺寸的離散物體?？傮w上，包括白蛋白納米顆粒作為合成納米載體，但是，在某些實施方案中，合成納米載體不包含白蛋白納米顆粒。在實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包含殼聚糖。

合成納米載體可以是但不限于一個或多個基于脂質(zhì)的納米顆粒(例如脂質(zhì)體)(在此還稱為脂質(zhì)納米顆粒，即構(gòu)成其結(jié)構(gòu)的大多數(shù)物質(zhì)是脂質(zhì)的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹枝狀聚合物、巴克球、納米線、病毒樣顆粒(即主要由病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成但不具有感染性或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒(在此還稱為蛋白質(zhì)顆粒，即構(gòu)成其結(jié)構(gòu)的大多數(shù)物質(zhì)是肽或蛋白質(zhì)的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)和/或使用納米材料的組合產(chǎn)生的納米顆粒(如脂質(zhì)-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以具有多種不同的形狀，包括但不限于球狀、立方形、金字塔形、長方形、圓柱形、環(huán)形等。根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包括一個或多個表面?？梢赃m用于本發(fā)明的慣例中的示例性合成納米載體包括：(1)格里夫(gref)等人的美國專利5,543,158中披露的生物可降解納米顆粒，(2)索爾茲曼(saltzman)等人的已公布的美國專利申請20060002852的聚合納米顆粒，(3)德西蒙(desimone)等人的已公布的美國專利申請20090028910的用平版印刷法建構(gòu)的納米顆粒，(4)馮安德里安(vonandrian)等人的wo2009/051837的披露，(5)penades(佩納德斯)等人的已公布的美國專利申請2008/0145441中披露的納米顆粒，(6)德洛斯里奧斯(delosrios)等人的已公布的美國專利申請20090226525中披露的蛋白質(zhì)納米顆粒，(7)西貝(sebbel)等人的已公布的美國專利申請20060222652中披露的病毒樣顆粒，(8)巴赫曼(bachmann)等人的已公布的美國專利申請20060251677中披露的與核酸偶合的病毒樣顆粒，(9)wo2010047839a1或wo2009106999a2中披露的病毒樣顆粒，或(10)保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效締合并且遞送病毒樣顆粒的經(jīng)過表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”，納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中披露的納米沉淀的納米顆粒。在實施方案中，合成納米載體可以擁有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。

根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括具有使補(bǔ)體活化的羥基的表面，或者可替代地包括基本由不是使補(bǔ)體活化的羥基的部分組成的表面。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括實質(zhì)上使補(bǔ)體活化的表面，或者可替代地包括基本由不實質(zhì)上活化補(bǔ)體的部分組成的表面。在更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體具有等于或小于大約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸，不包括使補(bǔ)體活化的表面，或者可替代地包括基本由不使補(bǔ)體活化的部分組成的表面。在實施方案中，合成納米載體排除病毒樣顆粒。在實施方案中，當(dāng)合成納米載體包括病毒樣顆粒時，病毒樣顆粒包括非天然佐劑(意指vlp包含除vlp制造期間所產(chǎn)生的天然存在的rna以外的佐劑)。在實施方案中，合成納米載體可以擁有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長寬比。

“t細(xì)胞抗原”意指由t細(xì)胞識別并且觸發(fā)t細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原(例如，由t細(xì)胞或nkt細(xì)胞上的t細(xì)胞受體經(jīng)由呈現(xiàn)結(jié)合到i類或ii類主要組織相容性復(fù)合分子(mhc)上或結(jié)合到cd1復(fù)合物上的抗原或它的一部分特異性識別的抗原)。在一些實施方案中，是t細(xì)胞抗原的抗原也是b細(xì)胞抗原。在其他實施方案中，t細(xì)胞抗原并不也是b細(xì)胞抗原。t細(xì)胞抗原總體上是蛋白或多肽。t細(xì)胞抗原可以是刺激cd8+t細(xì)胞應(yīng)答、cd4+t細(xì)胞應(yīng)答或兩者的抗原。因此，在一些實施方案中，納米載體可以有效地刺激兩種類型的應(yīng)答。

在一些實施方案中，t細(xì)胞抗原是‘通用’t細(xì)胞抗原或t細(xì)胞記憶抗原(即受試者具有原有記憶并且可以用于加強(qiáng)t細(xì)胞對不相關(guān)抗原(例如不相關(guān)的b細(xì)胞抗原)的輔助的t細(xì)胞抗原)。通用t細(xì)胞抗原包括破傷風(fēng)類毒素以及一種或多種衍生自破傷風(fēng)類毒素、埃-巴二氏病毒或流感病毒的肽。通用的t細(xì)胞抗原還包括流感病毒的組分，如血球凝集素、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白或一種或多種從它們衍生的肽。在一些實施方案中，通用t細(xì)胞抗原不是存在于與mhc分子的復(fù)合物中的抗原。在一些實施方案中，通用t細(xì)胞抗原不與用于呈現(xiàn)到t輔助細(xì)胞上的mhc分子復(fù)合。因此，在一些實施方案中，通用t細(xì)胞抗原不是t輔助細(xì)胞抗原。然而，在其他實施方案中，通用t細(xì)胞抗原是t輔助細(xì)胞抗原。

在實施方案中，t輔助細(xì)胞抗原可以包含一種或多種獲自或衍生自以下物質(zhì)的肽：破傷風(fēng)類毒素、埃-巴二氏病毒、流感病毒、呼吸道合胞體病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、白喉類毒素或padre肽(從賽特(sette)等人的美國專利7,202,351的工作中知曉)。在其他實施方案中，t輔助細(xì)胞抗原可以包含卵白蛋白或從它獲得或衍生的肽。優(yōu)選地，卵白蛋白包含如寄存編號aab59956、np_990483.1、aaa48998或caa2371中所述的氨基酸序列。在其他實施方案中，獲自或衍生自卵白蛋白的肽包含以下氨基酸序列：h-ile-ser-gln-ala-val-his-ala-ala-his-ala-glu-ile-asn-glu-ala-gly-arg-oh(seqidno：1)。在其他實施方案中，t輔助細(xì)胞抗原可以包含一種或多種脂質(zhì)或糖脂，包括但不限于：α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-galcer)、α-鍵聯(lián)的鞘糖脂(來自鞘氨醇單胞菌屬)、半乳糖苷二?；视?來自伯氏疏螺旋體)、脂磷酸聚糖(來自杜氏利什曼蟲)以及磷脂酰肌醇四甘露糖苷(pim4)(來自麻風(fēng)分枝桿菌)。對于用作t輔助細(xì)胞抗原的另外的脂質(zhì)和/或糖脂，參看塞昂多羅(v.cerundolo)等人，“開發(fā)疫苗接種策略中的不變nkt細(xì)胞(harnessinginvariantnktcellsinvaccinationstrategies)”，自然免疫學(xué)評論(naturerevimmun)，9：28-38(2009)。

在實施方案中，cd4+t細(xì)胞抗原可以是獲自一個來源(如天然來源)的cd4+t細(xì)胞抗原的衍生物。在此類實施方案中，cd4+t細(xì)胞抗原序列(如結(jié)合到mhcii上的那些肽)可以與獲自該來源的抗原具有至少70％、80％、90％或95％的一致性。在實施方案中，t細(xì)胞抗原、優(yōu)選通用t細(xì)胞抗原或t輔助細(xì)胞抗原可以偶合到合成納米載體上或與合成納米載體去偶合。在一些實施方案中，通用t細(xì)胞抗原或t輔助細(xì)胞抗原封裝在本發(fā)明的組合物的合成納米載體中。

“表面抗原的類型”、“表面抗原類型”等意指表面抗原共享一個或多個共同的化學(xué)和/或免疫學(xué)特征的一個定義組。

“疫苗”意指改良對特定病原體或疾病產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的物質(zhì)組合物。疫苗典型地含有刺激受試者的免疫系統(tǒng)的因子以將特異性抗原識別為外來的并且將它從受試者的體內(nèi)去除。疫苗還建立免疫學(xué)‘記憶’，使得在一個人再受到攻擊時，抗原將被快速識別并且產(chǎn)生應(yīng)答。疫苗可以是預(yù)防性的(例如預(yù)防未來感染任何病原體)或治療性的(例如針對腫瘤特異性抗原以治療癌癥的疫苗)。在實施方案中，疫苗可以包含根據(jù)本發(fā)明的劑型。

納米載體群和表面抗原組

在實施方案中，多群合成納米載體共享共同的物理或化學(xué)特征。在實施方案中，此類共同的物理或化學(xué)特征可以包括一組共同的表面抗原、共同的偶合佐劑、構(gòu)成大塊納米載體的共同的材料、共同的形狀、共同的粒度、共同的表面電荷等等。佐劑、材料、形狀以及粒度的類型在本申請中論述。

在實施方案中，一個群可以共享一組共同的表面抗原。這些共同的表面抗原可以基于共同的物理或化學(xué)特征(如但不限于結(jié)構(gòu)或免疫學(xué)特性)而集中在一起。在實施方案中，共同的特征可以包括共同的定向或構(gòu)象、或多組共享共同的分子結(jié)構(gòu)的分子、或所有前述事項。在實施方案中，共同的表面抗原可以包括分子量小于10,000的表面抗原。在其他實施方案中，共同的表面抗原可以包括肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子。在又其他實施方案中，共同的表面抗原可以包括分子量小于10,000的那些，并且包括肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子。在其他實施方案中，共同的表面抗原可以根據(jù)它們所獲自或衍生自的感染性有機(jī)體而集中在一起；并且因共享共同的屬、種和/或病毒株而分類。在表面抗原的分子量小于10,000的實施方案中，共同的表面抗原可以根據(jù)分子類別而集中在一起，如化學(xué)戰(zhàn)劑、環(huán)境毒素、上癮的或濫用的物質(zhì)、以及生理學(xué)內(nèi)生分子，包括但不限于激素、脂質(zhì)以及神經(jīng)遞質(zhì)。在實施方案中，多組共同的表面抗原可以由它們體內(nèi)誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的能力的強(qiáng)度來定義。舉例來說，一組表面抗原可能具有體內(nèi)誘導(dǎo)高親和力抗體產(chǎn)生的能力，而另一組共同的表面抗原可以體內(nèi)誘導(dǎo)低親和力抗體產(chǎn)生。

在實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)可以包括從感染因子獲得或衍生的抗原。在一些實施方案中，感染因子是細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物或寄生蟲。在其他實施方案中，病毒是痘病毒、天花病毒、埃博拉病毒、馬伯格氏病毒、麻疹病毒(在實施方案中，抗原可以從血球凝集素蛋白質(zhì)、血球凝集素套索表位、血球凝集素氨基酸106-114和/或519-550等獲得或衍生)、登革熱病毒、流感病毒、a型流感病毒(在實施方案中，抗原可以從ha蛋白質(zhì)、m2e蛋白質(zhì)等獲得或衍生)、流感h5n1病毒、流感h1n1病毒、感染性鮭魚貧血病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、麻疹病毒、人類免疫缺陷性病毒、人類乳頭瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、埃-巴二氏病毒、jc病毒、彈狀病毒、輪狀病毒、鼻病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒(在實施方案中，抗原可以從l1或l2蛋白質(zhì)獲得或衍生)、細(xì)小病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、引起流行性腮腺炎的病毒、引起狂犬病的病毒、呼腸孤病毒、風(fēng)疹病毒、披衣病毒、正粘病毒、反向病毒、嗜肝dna病毒、柯薩奇病毒、馬腦炎病毒、蜱媒腦炎、日本腦炎病毒、黃熱病毒、立谷熱病毒、a型肝炎病毒、b型肝炎病毒、c型肝炎病毒、d型肝炎病毒或e型肝炎病毒。

在實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自下表1所示的病毒科的病毒。在另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表1中所提供的種的病毒。在再另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表1中所提供的抗原。

表1：病毒性感染因子

在其他實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)可以包括從細(xì)菌性有機(jī)體獲得或衍生的抗原，如疏螺旋體種(borreliaspecies)、炭疽桿菌、伯氏疏螺旋體、百日咳桿菌、副百日咳桿菌、空腸彎曲桿菌、衣原體種(chlamydiaspecies)、鸚鵡披衣菌、沙眼衣原體、梭菌種(clostridiumspecies)、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、白喉桿菌、考克斯氏體種(coxiellaspecies)、腸球菌種(enterococcusspecies)、埃里克體種(erlichiaspecies)、大腸埃希氏桿菌、土弗朗西斯氏菌、嗜血桿菌種(haemophilusspecies)、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、乳桿菌種(lactobacillusspecies)、軍團(tuán)桿菌種(legionellaspecies)、嗜肺軍團(tuán)桿菌、問號鉤端螺旋體、李斯特菌種(listeriaspecies)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、分枝桿菌種(mycobacteriumspecies)、結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、支原體種(mycoplasmaspecies)、肺炎支原體、奈瑟菌種(neisseriaspecies)、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、肺炎球菌種(pneumococcusspecies)(例如類型6a、6b、3、4、14、19f等)、假單胞菌種(pseudomonasspecies)、綠膿假單胞菌、沙門氏菌種(salmonellaspecies)、傷寒沙門菌、腸道沙門菌、立克次體種(rickettsiaspecies)、立氏立克次體、傷寒立克次體、志賀氏桿菌種(shigellaspecies)、葡萄球菌種(staphylococcusspecies)、金黃色葡萄球菌、鏈球菌種(streptococcusspecies)、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、變形鏈球茵、密螺旋體種(treponemaspecies)、蒼白密螺旋體、弧菌種(vibriospecies)、霍亂弧茵、鼠疫耶爾森氏茵，等等。

在實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自下表2所示的細(xì)菌屬的細(xì)菌。在另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表2中所提供的細(xì)菌種。在再另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表2中所提供的抗原。

表2：細(xì)菌性感染因子

在又其他實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)可以包括從真菌、原生動物和/或寄生有機(jī)體的抗原獲得或衍生的抗原，如曲霉種、念珠菌種、白色念珠茵、熱帶假絲酵母、隱球菌種、新型隱球菌、溶組織內(nèi)阿米巴、莢膜組織胞漿茵、利什曼蟲種，星形諾卡茵、鐮狀瘧原蟲、剛地弓形蟲、陰道毛滴蟲、弓形蟲種、布魯斯錐蟲、曼氏血吸蟲，等等。

在又其他實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)可以包括從毒素獲得或衍生的抗原，如o-烷基(＜c10，包括環(huán)烷基)烷基(me、et、n-pr或i-pr)-氟膦酸酯(例如沙林：甲基氟膦酸o-異丙酯，梭曼：甲基氟膦酸o-叔己酯)、o-烷基(＜c10，包括環(huán)烷基)n，n-二烷基(me、et、n-pr或i-pr)磷酰胺基氰酸酯(phosphoramidocyanidates)(例如塔崩：n，n-二甲基磷酰胺基氰酸o-乙酯)、o-烷基(h或＜c10，包括環(huán)烷基)s-2-二烷基(me、et、n-pr或i-pr)-氨乙基烷基(me、et、n-pr或i-pr)硫代膦酸酯以及相對應(yīng)的烷基化或質(zhì)子化的鹽(例如vx：o-乙基s-2-二異丙基氨基乙基甲基硫代膦酸酯)、硫芥子氣：2-氯乙基氯甲基硫醚，芥子氣：雙(2-氯乙基)硫醚、雙(2-氯乙基硫基)甲烷，倍半芥子氣：1，2-雙(2-氯乙基硫基)乙烷、1，3-雙(2-氯乙基硫基)-正丙烷、1，4-雙(2-氯乙基硫基)-正丁烷、1，5-雙(2-氯乙基硫基)-正戊烷、雙(2-氯乙基硫基甲基)醚，o-芥類：雙(2-氯乙基硫基乙基)醚；路易氏氣類，路易氏氣1：2-氯乙烯基二氯胂，路易士氣2：雙(2-氯乙烯基)氯胂，路易士氣3：三(2-氯乙烯基)胂，氮芥類：hn1：雙(2-氯乙基)乙胺，hn2：雙(2-氯乙基)甲胺，hn3：三(2-氯乙基)胺，石房蛤毒素，篦麻毒素，胺吸磷：o，o-二乙基s-(2.(二乙基氨基)乙基)硫代膦酸酯和相對應(yīng)的烷基化或質(zhì)子化的鹽，pfib：1，1，3，3，3-五氟-2-(三氟甲基)-1-丙烯、二苯乙醇酸3-奎寧環(huán)基酯(bz)；光氣：碳酰二氯、氯化氰、氰化氫；以及氯化苦：三氯硝基甲烷。

在其他實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自下表3所示的真菌屬的真菌。在另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表3中所提供的真菌種。在再另一個實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)包括或獲自或衍生自表3中所提供的抗原。

表3：真菌感染因子

在再另外的實施方案中，一組表面抗原(例如第一和/或第二組表面抗原)可以包括從濫用的或上癮的物質(zhì)獲得或衍生的抗原。在一些實施方案中，濫用的或上癮的物質(zhì)是一種藥物，如非法藥物、非處方藥物或處方藥物。在其他實施方案中，濫用的或上癮的物質(zhì)具有改變情緒的作用，且因此包括吸入劑和溶劑。在其他實施方案中，濫用的或上癮的物質(zhì)是沒有改變情緒的作用或中毒性質(zhì)的物質(zhì)，且因此包括同化類固醇。濫用的或上癮的物質(zhì)包括但不限于大麻素(例如印度大麻、大麻)、鎮(zhèn)靜劑(例如巴比妥、苯二氮卓、氟硝西泮(rohypnol)、ghb、安眠酮(quaaludes))、解離麻醉劑(例如開他敏、pcp)、迷幻劑(例如lsd、墨斯卡靈、裸頭草堿)、類鴉片物質(zhì)和嗎啡衍生物(例如可待因、芬太尼、海洛因、嗎啡、鴉片)、興奮劑(安非他明、可卡因、迷幻藥(ecstacy)(mdma)、脫氧麻黃堿、哌醋甲酯(利他林)、煙堿)、同化類固醇以及吸入劑。在實施方案中，抗原包括可卡因類似物，如去甲可卡因。在其他實施方案中，抗原包括可鐵寧。

在本發(fā)明的實施方案中，可以組合各自包含一組表面抗原的不同群的合成納米載體。群之間的差異是基于多組表面抗原之間的差異。

在某些實施方案中，這些差異可以包含物理或化學(xué)特征的差異，如但不限于結(jié)構(gòu)或免疫學(xué)特性。在實施方案中，這些差異可以包含表面抗原定向或構(gòu)象的差異或多組表面抗原之間的分子結(jié)構(gòu)的差異。在又其他實施方案中，表面抗原的差異可以基于它們所獲自或衍生自的感染性有機(jī)體；并且將因來自不同的屬、種和/或病毒株而分類。在表面抗原的分子量小于10,000的實施方案中，表面抗原可以基于化學(xué)類別而不同，如化學(xué)戰(zhàn)劑、上癮的或濫用的物質(zhì)、以及內(nèi)生分子，包括但不限于激素、脂質(zhì)以及神經(jīng)遞質(zhì)。

在實施方案中，這些差異可以包括表面抗原定向或構(gòu)象的差異。舉例來說，表面抗原連接到合成納米載體上的不同連接點(diǎn)將引起該表面抗原的不同呈現(xiàn)。這些不同呈現(xiàn)可以產(chǎn)生識別表面抗原的不同表位的抗體。表面抗原可以用不同構(gòu)象呈現(xiàn)，并且可以被合成或修飾以實現(xiàn)這些構(gòu)象。舉例來說，可以執(zhí)行肽或蛋白質(zhì)截斷，其中在所關(guān)心的肽或蛋白質(zhì)抗原中產(chǎn)生修飾的構(gòu)象變化?？商娲兀梢蕴砑影被峄蚧瘜W(xué)連接物以增加長度或使改變肽或蛋白質(zhì)抗原暴露的特定定向穩(wěn)定。類似地，如分子量小于10,000的抗原、或寡糖、或多糖可以通過添加化學(xué)連接物或化學(xué)修飾來改變。

在其他實施方案中，合成納米載體的群之間的差異可以基于表面抗原的組之間基于不同的分子結(jié)構(gòu)和/或抗原占有率的差異。在一些實施方案中，差異可以包括這些組之間的表面抗原的一個或多個類型的占有率的差異。

在一個群包含一組單價的表面抗原的實施方案中，這組表面抗原的分子結(jié)構(gòu)、優(yōu)選地抗原類型可以不同于另一群或其他群的一組單價的表面抗原的分子結(jié)構(gòu)。在一個群包含一組單價的表面抗原的某些實施方案中，它的表面抗原的組包含的表面抗原占有率可以不同于另一群或其他群的一組單價的表面抗原所包含的表面抗原占有率。

在一群合成納米載體包含一組低價(或多價)的表面抗原的實施方案中，不同占有率的不同抗原類型可以在該組內(nèi)組合以形成此類表面抗原類型的組合。因此，在至少一群合成納米載體包含一組低價(或多價)的表面抗原的實施方案中，該組低價(或多價)的表面抗原的分子結(jié)構(gòu)(可以用每一類型的抗原的分子結(jié)構(gòu)隨它們在該組內(nèi)的占有率的變化來表示)可以不同于另一群或其他群的該組表面抗原的分子結(jié)構(gòu)。在實施方案中，此可能是因為另一群包含一組單價的表面抗原(其中根據(jù)定義這些組的表面抗原將不同)或因為另一群包含一組低價(或多價)的表面抗原，其中這兩組表面抗原的分子結(jié)構(gòu)(以每一類型的抗原的分子結(jié)構(gòu)和/或各抗原類型在該組內(nèi)的占有率表示)是不同的。

舉例來說，這些組的表面抗原可以包含一組對映體，如(r)和(s)煙堿。對映體可以等量地存在于相同或不同的納米載體上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上。在另一個實施方案中，一組表面抗原可以包含光學(xué)純的或外消旋的兩個在結(jié)構(gòu)上不同但相關(guān)的分子，如可鐵寧和煙堿。可鐵寧和煙堿可以等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上。另外，多組表面抗原可以包含來自單個包含幾種血清型的有機(jī)體的抗原，如來自肺炎鏈球菌血清型4、6b、9v、14、18c、19f以及23f的莢膜抗原性多糖。不同的抗原可以等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上。在實施方案中，多組表面抗原可以包含來自單個有機(jī)體的一族不同的抗原，如人類乳頭瘤病毒的衣殼蛋白l1和l2。這些組的表面抗原可以等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上。在實施方案中，這些組的表面抗原可以包含具有互異的結(jié)構(gòu)的幾種小分子，如毒氣戰(zhàn)劑vx、沙林以及梭曼。不同的化合物可以等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上，并且可以不等量地存在于相同或不同群的合成納米載體上。舉例來說，在一個實施方案中，一組表面抗原可以包含50％vx和50％沙林，而另一組表面抗原可以包含80％vx和20％沙林，其中表面抗原的百分比可以是重量百分比或摩爾百分比，并且基于表面抗原的總重量或總摩爾數(shù)。

在實施方案中，表面抗原的組的差異可以包含提供包含一組來自一種類型或多種類型的表面抗原(例如分子量小于10,000和/或是肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子)的一群合成納米載體；并且然后提供包含一個不同組的來自一種類型或多種類型的表面抗原(例如分子量小于10,000和/或是肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子)的另一群合成納米顆粒。

在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含分子量小于10,000的表面抗原時，第二組表面抗原包含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子(只要這些組在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同)。在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含含肽的表面抗原時，第二組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原時，第二組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含含寡糖的表面抗原時，第二組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含含多糖的表面抗原時，第二組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、寡糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤M表面抗原包含含小分子的表面抗原時，第二組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、寡糖或多糖的表面抗原(只要這些組在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同)。

在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含分子量小于10,000的表面抗原時，第一組表面抗原包含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子(只要這些組在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同)。在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含含肽的表面抗原時，第一組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含蛋白質(zhì)、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原時，第一組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、寡糖、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含含寡糖的表面抗原時，第一組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、多糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含含多糖的表面抗原時，第一組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、寡糖或小分子的表面抗原。在實施方案中，當(dāng)?shù)诙M表面抗原包含含小分子的表面抗原時，第一組表面抗原包含含分子量小于10,000的那些和/或含肽、蛋白質(zhì)、寡糖或多糖的表面抗原(只要這些組在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同)。

合成納米載體的群之間的其他差異可以基于表面抗原的組之間基于抗原的來源的差異。舉例來說，在一個實施方案中，此類差異可以基于獲得或衍生表面抗原的感染性屬、種和/或病毒株的差異。舉例來說，一群合成納米載體可以包括一組從以下細(xì)菌性來源(如大腸埃希氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌、破傷風(fēng)梭菌或炭疽桿菌)獲得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一組從病毒性來源(如流感病毒、b型肝炎病毒、c型肝炎病毒以及人類皰疹病毒)獲得或衍生的表面抗原。在實施方案中，一群合成納米載體可以包括一組從以下細(xì)菌性來源(如以上指出的那些)獲得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一組從真菌(例如白色念珠菌或伊氏肺孢子蟲)獲得或衍生的表面抗原。在其他實施方案中，一群合成納米載體可以包括一組從以下病毒性來源獲得或衍生的表面抗原，而另一群可以包括一組從寄生蟲(如鐮狀瘧原蟲)獲得或衍生的表面抗原。按照以上說明的其他組合和子組合涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在其他實施方案中，不同組的表面抗原可以從并非不同的感染性屬、種或病毒株獲得或衍生。在實施方案中，這些差異可以起因于對感染性屬、種或病毒株內(nèi)的不同抗原的選擇。舉例來說，一組表面抗原可以從一種病毒性外殼蛋白獲得或衍生，而另一組表面抗原可以從來自同一病毒的相同或另一病毒性外殼蛋白的不同表位獲得或衍生。在一個實施方案中，不同組的表面抗原可以從一種可以包括幾個獨(dú)特的表位的病毒蛋白質(zhì)(例如巨細(xì)胞病毒(cmv)衣殼蛋白質(zhì)或其他cmv蛋白質(zhì))獲得或衍生。同樣地，不同組的表面抗原可以從白喉或破傷風(fēng)毒素的不同表位獲得或衍生。

在其他實施方案中，合成納米載體的群之間的差異可以基于表面抗原的組之間基于不同化學(xué)類別的抗原的差異。舉例來說，在分子的分子量小于10,000的情況下，此類差異可以基于化學(xué)骨架或整個分子結(jié)構(gòu)或此類分子展現(xiàn)的活性的差異。舉例來說，不同的表面抗原的組可以從結(jié)構(gòu)不同但活性類似的表面抗原的組(如類鴉片類，如嗎啡和海洛因)獲得或衍生。在其他實施方案中，不同組的表面抗原可以包含結(jié)構(gòu)類似但活性不同的分子，示例的是對映異構(gòu)體，如(r)和(s)利他林或(r)和(s)煙堿。在實施方案中，表面抗原的組之間的差異可以包括化合物和它們的代謝產(chǎn)物，如特非那定和非索非那丁或阿斯特馬唑(astemazole)和降阿斯特馬唑(norastemazole)。表面抗原的組之間的差異還可以基于化合物結(jié)構(gòu)的不相關(guān)性，如煙堿和脫氧麻黃堿。

在其他實施方案中，合成納米載體的群之間的差異可以基于表面抗原的組之間基于表面抗原的組之間的免疫學(xué)差異的差異。在實施方案中，表面抗原的組可以由它們體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力來定義。舉例來說，一個表面抗原的組可能具有體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的高親和力抗體產(chǎn)生所關(guān)心的抗原的能力，而第二組表面抗原可能不體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的高親和力抗體產(chǎn)生該抗原。作為另一個實例，第一組表面抗原可以具有產(chǎn)生對第一組表面抗原的抗原具有特異性的抗體滴度的能力，而第二組表面抗原可以具有產(chǎn)生對第二組表面抗原的抗原具有特異性的抗體滴度的能力。在實施方案中，第二組表面抗原產(chǎn)生對第二組表面抗原的抗原而不是對第一組抗原具有特異性的抗體滴度。

本發(fā)明組合物和相關(guān)方法

合成納米載體可以使用本領(lǐng)域已知的多種多樣的方法來制備。舉例來說，合成納米載體可以由如以下的方法形成：納米沉淀、使用射流通道的流動聚焦、噴霧干燥、單一和雙重乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液工序、微制造、納米制造、犧牲層、簡單和復(fù)雜的凝聚、以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其他方法。可替代地或另外地，已經(jīng)描述了單分散半導(dǎo)體、傳導(dǎo)性、磁性、有機(jī)以及其他納米材料的水性和有機(jī)溶劑合成(普萊伊亞諾(pellegrino)等人，2005，微小(small)，1：48；默瑞(murray)等人，2000，材料科學(xué)評論年報(ann.rev.mat.sci.)，30：545；以及特林達(dá)迪(trindade)等人，2001，化學(xué)材料(chem.mat.)，13：3843)。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了另外的方法(參看例如達(dá)保羅(doubrow)編，“醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的微膠囊和納米粒子(microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy)，”crc出版社，博卡拉頓(bocaraton)，1992；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，控釋雜志(j.control.release)，5：13；馬西威茲等人，1987，反應(yīng)性聚合物(reactivepolymers)，6：275；以及馬西威茲等人，1988，應(yīng)用聚合物科學(xué)雜志(j.appl.polymersci.)，35：755，并且還參看美國專利5578325和6007845；保利賽利等人，“可以高效締合并且遞送病毒樣顆粒的經(jīng)過表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010))。

在實施方案中，本發(fā)明包括用于呈現(xiàn)多組表面抗原、優(yōu)選地多組單價的或低價的表面抗原的合成納米載體裝置。一個特別的本發(fā)明實施方案包括一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原、優(yōu)選地第一組單價的或低價的表面抗原的第一合成納米載體裝置；和一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原、優(yōu)選地第二組單價的或低價的表面抗原的第二合成納米載體裝置。用于呈現(xiàn)表面抗原的此類合成納米載體裝置在本披露中披露，并且涵蓋在此披露的實施方案。

希望時，可以使用多種方法將不同的材料封裝于合成納米載體中，這些方法包括但不限于阿斯特提(c.astete)等人，“plga納米顆粒的合成和表征(synthesisandcharacterizationofplgananoparticles)”生物材料雜志聚合物輯(j.biomater.sci.polymeredn)，第17卷，第3期，第247-289頁(2006)；阿溝司達(dá)奇斯(k.avgoustakis)“聚乙二醇化聚(丙交酯)與聚(丙交酯-共-乙交酯)納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能的應(yīng)用(pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation.propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery)”當(dāng)前藥物遞送(currentdrugdelivery)1：321-333(2004)；瑞斯(c.reis)等人，“納米封裝i.用于制備藥物負(fù)載的聚合的納米顆粒的方法(nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles)”納米醫(yī)學(xué)2：8-21(2006)；保利賽利等人，“可以高效締合并且遞送病毒樣顆粒的經(jīng)過表面修飾的基于plga的納米顆?！奔{米醫(yī)學(xué)，5(6)：843-853(2010)?？梢允褂眠m合用于將物質(zhì)(例如寡核苷酸)封裝在合成納米載體中的其他方法，包括但不限于在安格(unger)的美國專利6,632,671(2003年10月14日)中披露的方法。

在某些實施方案中，合成納米載體通過納米沉淀方法或噴霧干燥來制備?？梢愿淖冊谥苽浜铣杉{米載體中使用的條件以產(chǎn)生具有希望的大小或特性(例如疏水性、親水性、外部形態(tài)學(xué)、“黏性”、形狀等)的顆粒。制備合成納米載體的方法和使用的條件(例如溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)可以取決于有待偶合到合成納米載體上的物質(zhì)和/或該聚合物基質(zhì)的構(gòu)成。

如果通過任何上述方法制備的顆粒具有所希望范圍以外的尺寸范圍時，可例如使用篩網(wǎng)、差示離心或沉降來定顆粒尺寸。

本發(fā)明的合成納米載體的要素，如包含一個免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基質(zhì)、抗原、佐劑等等，可以例如通過一個或多個共價鍵偶合到合成納米載體上或可以借助一個或多個連接物偶合。使合成納米載體官能化的另外的方法可以由以下文獻(xiàn)改編而來：薩爾茨曼(saltzman)等人的公布的美國專利申請2006/0002852、德西蒙(desimone)等人的公布的美國專利申請2009/0028910、或默蒂(murthy)等人的公布的國際專利申請wo/2008/127532a1。

可替代地或另外地，合成納米載體可以直接地或間接地經(jīng)由非共價相互作用偶合到包含一個免疫特征表面的部分、靶向部分、佐劑、抗原和/或其他要素上。在非共價的實施方案中，通過非共價相互作用介導(dǎo)非共價偶合，這些非共價相互作用包括但但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。此類偶合可以安排在一種本發(fā)明合成納米載體的一個外表面或一個內(nèi)表面上。在實施方案中，封裝和/或吸附是偶合的一種形式。

根據(jù)本發(fā)明，可以使用多種多樣的合成納米載體。在一些實施方案中，合成納米載體是球形或球狀體。在一些實施方案中，合成納米載體是平坦的或板狀的。在一些實施方案中，合成納米載體是立方體或立方形。在一些實施方案中，合成納米載體是卵形或橢圓。在一些實施方案中，合成納米載體是圓筒、圓錐或金字塔。

在一些實施方案中，希望使用一群在大小、形狀、和/或構(gòu)成方面相對一致的合成納米載體，這樣每一合成納米載體具有類似特性。例如，基于合成納米載體的總數(shù)，至少80％、至少90％、或至少95％的合成納米載體可以具有落在合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內(nèi)的最小尺寸或最大尺寸。在一些實施方案中，一群合成納米載體就大小、形狀、和/或構(gòu)成而論可以是不均勻的。

合成納米載體可以是實心的或空心的，并且可以包括一個或多個層。在一些實施方案中，每一層相對于另一或其他層都具有獨(dú)特的構(gòu)成和獨(dú)特的特性。為了給出但是一個實例，合成納米載體可以具有一個核/殼結(jié)構(gòu)，其中核是一層(例如一個聚合物核)并且殼是一個第二層(例如一個脂質(zhì)雙層或單層)。合成納米載體可以包括多個不同的層。

在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包括一種或多種脂質(zhì)。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)體。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)雙層。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)單層。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種膠束。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一個核心，該核心包括一個由一種脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)環(huán)繞的聚合物基質(zhì)。在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一個非聚合核心(例如金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒性顆粒、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等等)，該核心由一個脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)環(huán)繞。

在一些實施方案中，合成納米載體可以包括一種或多種聚合物。在一些實施方案中，此類聚合物可以由一個涂層(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)單層、膠束等)環(huán)繞。在一些實施方案中，這些合成納米載體的不同的要素可以與聚合物偶合。

在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或低聚核苷酸可以與一個聚合物基質(zhì)共價締合。在一些實施方案中，共價締合通過連接物介導(dǎo)。在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或低聚核苷酸可以與一個聚合物基質(zhì)非共價締合。例如，在一些實施方案中，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑和/或低聚核苷酸可以被封裝在聚合物基質(zhì)內(nèi)、被聚合物基質(zhì)環(huán)繞、和/或被分散遍及聚合物基質(zhì)。可替代地或另外地，一個免疫特征表面、靶向部分、抗原、佐劑、和/或寡核苷酸可以通過疏水性相互作用、電荷相互作用、范德華力等與聚合物基質(zhì)締合。

多種多樣的聚合物和用于從其形成聚合物基質(zhì)的方法常規(guī)地是已知的。總體來說，一種聚合物基質(zhì)包括一種或多種聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。在序列方面，共聚物可以是無規(guī)的、嵌段的，或包含無規(guī)的和嵌段的序列的組合。根據(jù)本發(fā)明的聚合物典型地是有機(jī)聚合物。

適合用于本發(fā)明的聚合物的實例包括但不限于聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚富馬酸丙酯、聚酰胺(例如聚己內(nèi)酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物、聚(乙亞胺)、聚(乙亞胺)-peg共聚物、以及聚磷嗪。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括根據(jù)21c.f.r.§177.2600已經(jīng)由美國食品與藥品管理局(fda)批準(zhǔn)用于人類的聚合物，包括但但不限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。

在一些實施方案中，聚合物可以是親水性的。舉例來說，聚合物可以包含陰離子基團(tuán)(例如磷酸酯基、硫酸酯基、羧酸酯基)；陽離子基團(tuán)(例如季胺基)；或極性基團(tuán)(例如羥基、硫醇基、胺基)。在一些實施方案中，包含親水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生親水性環(huán)境。在一些實施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些實施方案中，包含疏水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生疏水性環(huán)境。聚合物的親水性或疏水性的選擇可以對合并(例如偶合)在合成納米載體內(nèi)的物質(zhì)的性質(zhì)具有影響。

在一些實施方案中，聚合物可以用一個或多個部分和/或官能團(tuán)修飾。根據(jù)本發(fā)明，可以使用多種部分或官能團(tuán)。在一些實施方案中，可以用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來修飾聚合物(巴比索夫(papisov)，2001，acs研討會系列(acssymposiumseries)，786：301)?？梢允褂酶窭锓虻热说拿绹鴮＠?543158、或馮安德里安等人的wo公布wo2009/051837中的全部傳授內(nèi)容進(jìn)行某些實施方案。

在一些實施方案中，聚合物可以用脂質(zhì)或脂肪酸基團(tuán)修飾。在一些實施方案中，脂肪酸基團(tuán)可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸或二十四烷酸中的一種或多種。在一些實施方案中，脂肪酸基團(tuán)可以是棕櫚烯酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一種或多種。

在一些實施方案中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在此統(tǒng)稱為“plga”；和包含乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“pga”；和包含乳酸單元的均聚物，如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯以及聚-d，l-丙交酯，在此統(tǒng)稱為“pla”。在一些實施方案中，示例性的聚酯包括例如多羥基酸；peg共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物，例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物以及它們的衍生物。在一些實施方案中，聚酯包括例如聚(己內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯-共-l-賴氨酸)、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]以及它們的衍生物。

在一些實施方案中，聚合物可以是plga。plga是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的plga特征在于乳酸：乙醇酸的比率。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸、或d，l-乳酸。可以通過改變?nèi)樗幔阂掖妓岬谋嚷收{(diào)整plga的降解速率。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明，將使用的plga特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85的乳酸∶乙醇酸比率。

在一些實施方案中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物。在某些實施方案中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合。丙烯酸聚合物可以包含丙烯酸和甲基丙烯酸酯與低含量季銨基團(tuán)的全聚合共聚物。

在一些實施方案中，聚合物可以是陽離子型聚合物。通常，陽離子型聚合物能夠縮合和/或保護(hù)核酸(例如dna、或它的衍生物)的帶負(fù)電的鏈。包含胺的聚合物(如聚(賴氨酸)(澤納(zauner)等人，1998，先進(jìn)藥物遞送評論(adv.drugdel.rev.)，30：97；和卡巴諾夫(kabanov)等人，1995，生物共軛化學(xué)(bioconjugatechem.)，6：7)、聚(亞乙基亞胺)(pei；博塞夫(boussif)等人，1995，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.)，美國，1995,92：7297)和聚(酰胺基胺)樹枝狀聚合物(庫沃斯卡-拉塔羅(kukowska-latallo)等人，1996，美國國家科學(xué)院院刊，美國，93：4897；唐(tang)等人，1996，生物共軛化學(xué)，7：703；和漢斯勒(haensler)等人，1993，生物共軛化學(xué)，4：372))在生理ph下帶正電，與核酸形成離子對，并且在多種細(xì)胞系中介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。在實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽離子型聚合物。

在一些實施方案中，聚合物可以是帶有陽離子側(cè)鏈的可降解聚酯(普特南(putnam)等人，1999，大分子(macromolecules)，32：3658；巴雷拉(barrera)等人，1993，美國化學(xué)會志(j.am.chem.soc.)，115：11010；權(quán)(kwon)等人，1989，大分子，22：3250；林(lim)等人，1999，美國化學(xué)會志，121：5633；以及周(zhou)等人，1990，大分子，23：3399)。這些聚合物的實例包括聚(l-丙交酯l-賴氨酸共聚物)(巴雷拉等人，1993，美國化學(xué)會志，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(周等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(普特南等人，1999，大分子，32：3658；以及林等人，1999，美國化學(xué)會志，121：5633)、以及聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(普特南等人，1999，大分子，32：3658；以及林等人，1999，美國化學(xué)會志，121：5633)。

，這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參看，例如美國專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；王(wang)等人，2001，美國化學(xué)會志，123：9480；林等人，2001，美國化學(xué)會志，123：2460；朗格爾(langer)，2000，化學(xué)研究評述，33：94；朗格爾，1999，控釋雜志，62：7；以及烏利希(uhrich)等人，1999，化學(xué)評論，99：3181)。更總體而言，聚合物科學(xué)以及聚合物胺和銨鹽的簡明百科全書(conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts)，由戈薩爾斯(goethals)編，培格曼出版社(pergamonpress)，1980；聚合原理(principlesofpolymerization)，奧迪安(odian)，約翰威利父子出版公司(johnwiley&sons)，第四版，2004；當(dāng)代聚合物化學(xué)(contemporarypolymerchemistry)，奧科克(allcock)等人，普倫蒂斯霍爾出版社(prentice-hall)，1981；戴明(deming)等人，1997，自然(nature)，390：386；以及美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446以及6,818,732中描述用于合成某些適合聚合物的多種方法。

在一些實施方案中，聚合物可以是直鏈或分支鏈聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以是樹枝狀聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以彼此實質(zhì)上交聯(lián)。在一些實施方案中，聚合物可以實質(zhì)上不交聯(lián)。在一些實施方案中，聚合物可根據(jù)本發(fā)明使用而不進(jìn)行交聯(lián)步驟。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明的合成納米載體可以包括嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何以上及其他聚合物的加合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到在此列出的聚合物代表可根據(jù)本發(fā)明使用的聚合物的示例性不詳盡清單。

在一些實施方案中，合成納米載體包含一種或多種聚合物。因此，聚合的合成納米載體還可以包括馮安德里安(vonandrian)等人的wo公布wo2009/051837中描述的聚合的合成納米載體，包括但不限于具有一種或多種親水性組分的那些。優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己內(nèi)酯。更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含或另外包含偶合到親水性聚合物(如聚醚)上的聚酯。在實施方案中，該聚醚包含聚乙二醇。再更優(yōu)選地，一種或多種聚合物包含聚酯和偶合到親水性聚合物(如聚醚)上的聚酯。在其他實施方案中，一種或多種聚合物被偶合到一種或多種抗原和/或一種或多種佐劑上。在實施方案中，至少一些聚合物被偶合到這種或這些抗原上，和/或至少一些聚合物被偶合到這種或這些佐劑上。優(yōu)選地，當(dāng)存在大于一種類型的聚合物時，一種類型的聚合物被偶合到這種或這些抗原上。在實施方案中，一種其他類型的聚合物被偶合到這種或這些佐劑上。舉例來說，在實施方案中，當(dāng)納米載體包含聚酯和偶合到親水性聚合物(如聚醚)上的聚酯時，該聚酯被偶合到該佐劑上，而該偶合到親水性聚合物(如聚醚)上的聚酯被偶合到這種或這些抗原上。在實施方案中，如果納米載體包含通用t細(xì)胞抗原，如t輔助細(xì)胞抗原，那么通用t細(xì)胞抗原可以封裝在納米載體中。

在一些實施方案中，合成納米載體不包含一種聚合組分。在一些實施方案中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒等等。在一些實施方案中，非聚合的合成納米載體是非聚合組分的聚集體，如金屬原子(例如金原子)的聚集體。

在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實體。在一些實施方案中，兩親實體可以促進(jìn)具有增加的穩(wěn)定性、改良的均勻性或增加的粘性的合成納米載體的制造。在一些實施方案中，兩親實體可以與脂質(zhì)膜(例如脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等)的內(nèi)表面締合。本領(lǐng)域中已知的多種兩親實體適用于制備根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體。這樣的兩親實體包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)；二油烯基磷脂?；掖及?dope)；二油烯基氧丙基三乙基銨(dotma)；二油?；字Ｄ憠A；膽固醇；膽固醇酯；二?；视?；二酰基甘油琥珀酸酯；二磷脂?；视?dppg)；十六烷醇；脂肪醇(例如聚乙二醇(peg))；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性脂肪酸(例如棕櫚酸或油酸)；脂肪酸；脂肪酸甘油單酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脫水山梨糖醇三油酸酯(85)甘氨膽酸酯；脫水山梨糖醇單月桂酸酯(20)；聚山梨醇酯20(20)；聚山梨醇酯60(60)；聚山梨醇酯65(65)；聚山梨醇酯80(80)；聚山梨醇酯85(85)；聚氧乙烯單硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；脫水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脫水山梨糖醇三油酸酯)；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)；心磷脂；磷脂酸；腦苷脂；雙十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙?；貦八狨ィ槐吐橛退岣视王?；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸異丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性劑特性的合成的和/或天然的洗滌劑；脫氧膽酸酯；環(huán)糊精；離液序列高的鹽；離子對試劑；以及它們的組合。兩親實體組分可以是不同兩親實體的混合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到這是具有表面活性劑活性的物質(zhì)的示例性的非詳盡清單。任何兩親實體都可以用于制造根據(jù)本發(fā)明使用的合成納米載體中。

在一些實施方案中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些實施方案中，碳水化合物包括單糖或二糖，包括但但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸。在某些實施方案中，碳水化合物是一種多糖，包括但但不限于：支鏈淀粉、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥基纖維素(hc)、甲基纖維素(mc)、右旋糖酐、環(huán)葡聚糖、糖原、羥乙基淀粉、卡拉膠、多聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、n，o-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質(zhì)、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質(zhì)酸、凝膠多糖、以及黃原膠。在實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體不包含(或特別排除)碳水化合物，如多糖。在某些實施方案中，碳水化合物可以包含碳水化合物衍生物，如糖醇，包括但不限于甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇以及乳糖醇。

根據(jù)本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的合成納米載體以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑，如防腐劑、緩沖劑、生理鹽水或磷酸鹽緩沖的生理鹽水。組合物可以使用常規(guī)的藥物制造和配合技術(shù)獲得有用劑型來制備。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在無菌的供注射生理鹽水溶液中。

在實施方案中，當(dāng)制備合成納米載體作為針對抗原和/或佐劑的載體以用于疫苗中時，用于將抗原和/或佐劑偶合到合成納米載體上的方法可以是有用的。如果抗原和/或佐劑是小分子，那么在組裝合成納米載體之前將抗原和/或佐劑連接到聚合物上可能具有優(yōu)勢。在實施方案中，制備具有用于將抗原和/或佐劑偶合到合成納米載體上的表面基團(tuán)的合成納米載體也可能是一個優(yōu)勢，該制備通過使用這些表面基團(tuán)而不是將抗原和/或佐劑連接到聚合物上并且然后在建構(gòu)合成納米載體時使用此聚合物結(jié)合物來進(jìn)行。

表面抗原可以通過多種方法偶合到合成納米載體上。在實施方案中，表面抗原共價地或非共價地偶合到合成納米載體的一個外表面上。

在某些實施方案中，偶合可以是經(jīng)由共價連接物。在實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的表面抗原和/或佐劑可以經(jīng)由1，2，3-三唑連接物共價偶合到外表面上，該連接物通過納米載體表面上的疊氮基與包含炔基的表面抗原或佐劑進(jìn)行1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)或通過納米載體表面上的炔與包含疊氮基的表面抗原或佐劑進(jìn)行1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)形成。此類環(huán)加成反應(yīng)優(yōu)選在銅(i)催化劑以及適合的cu(i)-配體和將cu(ii)化合物還原成催化活性的cu(i)化合物的還原劑存在下執(zhí)行。此類cu(i)催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)(cuaac)也可以稱為點(diǎn)擊反應(yīng)。

另外，共價偶合可以包含共價連接物，它包含酰胺連接物、二硫基連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物以及磺酰胺連接物。

酰胺連接物經(jīng)由一種組分(如肽)上的胺與第二組分(如納米載體)的羧酸基團(tuán)之間的酰胺鍵形成。連接物中的酰胺鍵可以用被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸或肽與被活化的羧酸(如被n-羥基丁二酰亞胺活化的酯)使用任何常規(guī)酰胺鍵形成反應(yīng)制備。

二硫基連接物經(jīng)由在例如r1-s-s-r2的形式的兩個硫原子之間形成二硫(s-s)鍵制備。二硫鍵可以通過包含硫醇基/巰基(-sh)的表面抗原和/或佐劑與聚合物或納米載體上另一被活化的硫醇基或包含硫醇基/巰基的納米載體與包含被活化的硫醇基的抗原和/或佐劑進(jìn)行硫醇交換來形成。

三唑連接物(特別是r1和r2可以是任何化學(xué)實體的形式的1，2，3-三唑)通過連接于第一組分(如納米載體)上的疊氮與連接于第二組分(如抗原和/或佐劑)上的末端炔的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)來制備。1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)在有或無催化劑的情況下、優(yōu)選在有經(jīng)由1，2，3-三唑官能團(tuán)連接兩個組分的cu(i)催化劑的情況下執(zhí)行。這種化學(xué)方法詳細(xì)地描述在夏普勒斯(sharpless)等人，德國應(yīng)用化學(xué)(angew.chem.int.ed.)，41(14)，2596，(2002)和梅爾達(dá)爾(meldal)等人，化學(xué)評論(chem.rev.)，2008，108(8)，2952-3015中，并且經(jīng)常稱為“點(diǎn)擊”反應(yīng)或cuaac。

在實施方案中，制備一種聚合物，它在聚合物鏈末端包含疊氮基或炔基。然后使用這種聚合物制備合成納米載體，以此方式使得多個炔或疊氮基安置在該納米載體的表面上?？商娲?，合成納米載體可以通過另一種途徑制備，并且隨后用炔或疊氮基官能化?？乖?或佐劑在炔基(如果聚合物包含疊氮基)或疊氮基(如果聚合物包含炔基)存在下制備。然后在有或無催化劑下允許抗原和/或佐劑與納米載體經(jīng)由1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)，該催化劑將抗原和/或佐劑經(jīng)由1，4-二取代的1，2，3-三唑連接物共價偶合到顆粒上。

硫醚連接物通過以例如r1-s-r2的形式形成硫-碳(硫醚)鍵制備。硫醚可以通過用第二組分(如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(如鹵基或環(huán)氧基)烷基化一種組分(如抗原和/或佐劑)上的硫醇基/巰基(-sh)制備。硫醚連接物還可以通過將一種組分(如抗原和/或佐劑)上的硫醇基/巰基與作為邁克爾受體的第二組分(如包含順丁烯二酰亞胺基或乙烯砜基的聚合物)上的缺電子烯基進(jìn)行邁克爾加成來形成。以另一種方式，硫醚連接物可以通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的硫醇基/巰基與第二組分(如聚合物或納米載體)上的烯基進(jìn)行自由基硫醇-烯反應(yīng)來制備。

腙連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的酰肼基與第二組分(如納米載體)上的醛/酮基進(jìn)行反應(yīng)來制備。

酰肼連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的肼基與第二組分(如納米載體)上的羧酸基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來形成。此類反應(yīng)總體上使用類似于形成酰胺鍵的化學(xué)方法(其中羧酸用活化試劑活化)執(zhí)行。

亞胺或肟連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺或n-烷氧基胺基(或氨氧基)與第二組分(如納米載體)上的醛或酮基進(jìn)行反應(yīng)來形成。

脲或硫脲連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺基與第二組分(如納米載體)上的異氰酸酯或異硫氰酸酯基進(jìn)行反應(yīng)來制備。

脒連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺基與第二組分(如納米載體)上的酰亞胺酯基進(jìn)行反應(yīng)來制備。

胺連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺基與第二組分(如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(如鹵基、環(huán)氧基或磺酸酯基)進(jìn)行烷基化反應(yīng)來制備?？商娲兀愤B接物還可以通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺基與第二組分(如納米載體)上的醛或酮基在適合的還原試劑(如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)存在下進(jìn)行還原胺基化來制備。

磺酰胺連接物通過一種組分(如抗原和/或佐劑)上的胺基與第二組分(如納米載體)上的磺酰基鹵化物(如磺酰氯或磺酰氟)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來制備。砜連接物通過親核試劑與乙烯砜進(jìn)行邁克爾加成來制備。乙烯砜或親核試劑可以位于納米顆粒的表面上或連接到抗原或佐劑上。

抗原或佐劑還可以與納米載體經(jīng)由非共價結(jié)合方法來結(jié)合。舉例來說，帶負(fù)電的抗原或佐劑可以與帶正電的納米載體通過靜電吸附結(jié)合。包含金屬配體的抗原或佐劑還可以與包含金屬復(fù)合物的納米載體經(jīng)由金屬-配體復(fù)合物結(jié)合。

在實施方案中，抗原或佐劑可以在組裝合成納米載體之前連接到聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)上，或可以形成合成納米載體而使得反應(yīng)性或可活化基團(tuán)在它的表面上。在后一情況下，可以制備抗原或佐劑以使其具有與由合成納米載體的表面呈現(xiàn)的連接化學(xué)結(jié)構(gòu)相容的基團(tuán)。在其他實施方案中，可以使用適合的連接物將肽抗原連接到vlp或脂質(zhì)體上。連接物是能夠?qū)蓚€分子偶合在一起的化合物或試劑。在一個實施方案中，連接物可以是同雙官能或雜雙官能試劑，如海爾曼森(hermanson)2008中所述。舉例來說，可以在edc存在下用同雙官能連接物己二酸二酰肼(adh)處理表面上包含羧基的vlp或脂質(zhì)體合成納米載體，形成具有adh連接物的相應(yīng)合成納米載體。然后使所得被adh連接的合成納米載體與包含酸基的肽抗原和/或佐劑經(jīng)由nc上的adh連接物的另一端結(jié)合，產(chǎn)生相應(yīng)的vlp或脂質(zhì)體肽結(jié)合物。

對于可用的結(jié)合方法的詳細(xì)描述，參看海爾曼森(hermansongt)，“生物結(jié)合技術(shù)”，第2版，由學(xué)術(shù)出版公司(academicpress，inc.)出版，2008。除共價連接以外，抗原和/或佐劑還可以通過吸附于預(yù)成型的合成納米載體上來偶合，或它/它們可以通過在形成合成納米載體期間進(jìn)行封裝來偶合。

在實施方案中，表面抗原可以使用不同的非共價相互作用非共價偶合到合成納米載體上，這些非共價相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或它們的組合。在實施方案中，封裝是偶合的一種形式。當(dāng)偶合帶電的表面抗原時，合成納米載體可以在表面活性劑的存在下制造，這些表面活性劑吸附到合成納米載體的表面上，并且這樣之后，它們賦予合成納米載體電荷。帶電的表面抗原隨后可以通過電荷-電荷相互作用非共價地連接到帶電的合成納米載體上(參看例如奧哈根(o’hagen)wo2000006123a1)。

在實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以與一種或多種佐劑通過混合在同一媒劑或遞送系統(tǒng)中來組合。這樣的佐劑可以包括但不限于在此提供的佐劑，如礦物鹽(如明礬，與腸道細(xì)菌(例如大腸埃希氏桿菌、明尼蘇達(dá)沙門茵、鼠傷寒沙門茵、或弗氏志賀茵)的單磷酰脂質(zhì)(mpl)a組合的明礬或分別與(as04)、以上提到的細(xì)菌的mpla特異性組合的明礬)、皂苷(如qs-21、quil-a、iscoms、iscomatrix^tm)、乳液(如mf59^tm、isa51和isa720)、as02(qs21+角鯊烯+)、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體配制品(如as01)、as15、合成的或特別制備的微粒和微載體(如淋病奈瑟茵(n.gonorrheae)、沙眼衣原體和其他細(xì)菌的源于細(xì)菌的外膜泡(omv))、或殼聚糖顆粒、貯存形成劑(depot-formingagent)(如嵌段共聚物)、特異性修飾或制備的肽(如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(如rc529)、或蛋白質(zhì)(如細(xì)菌類毒素或毒素片段)。此類其他佐劑的劑量可以使用常規(guī)劑量范圍研究來確定。

在實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體可以與分別地在不同時間點(diǎn)和/或在不同身體部位和/或通過不同的免疫路徑給予的與偶合到納米載體上的那些不同、類似或相同的其他抗原(有或無佐劑，利用或不利用另一種遞送媒劑)組合或與分別地在不同時間點(diǎn)和/或在不同身體部位和/或通過不同的免疫路徑給予的另一種攜帶抗原和/或佐劑的合成納米載體組合。

合成納米載體的群可以使用傳統(tǒng)的藥物混合方法組合以形成根據(jù)本發(fā)明的劑型。這些方法包括液體-液體混合，其中兩種或更多種各自包含一個或多個納米載體子組的懸浮液直接組合或經(jīng)由一個或多個包含稀釋劑的容器集合在一起。因為合成納米載體還可以用粉末形式制造或儲存，所以可以執(zhí)行干燥的粉末-粉末混合，因為可以將兩種或更多種粉末再懸浮于共同的介質(zhì)中。取決于納米載體的特性和它們的相互作用勢，一種或另一種混合途徑可能也有優(yōu)勢。

包含合成納米載體的典型的發(fā)明的組合物可以包括無機(jī)或有機(jī)緩沖劑(例如磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調(diào)節(jié)劑(例如鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如聚山梨醇20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如鹽類或糖類)、抗細(xì)菌劑(例如苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、防沫劑(例如聚二甲基硅酮)、防腐劑(例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如甘油、聚乙二醇、乙醇)。

根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與藥物學(xué)上可接受的賦形劑或載體組合的本發(fā)明的合成納米載體。組合物可以使用常規(guī)的藥物制造和配合技術(shù)獲得有用的劑型來制備。適合用于實施本發(fā)明的技術(shù)可以在工業(yè)混合手冊：科學(xué)和慣例(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，由愛德華l.保羅(edwardl.paul)，維克多a.阿蒂莫-奧本格(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊妮m.克里斯塔(suzannem.kresta)編，2004約翰威利父子公司；和制藥學(xué)：劑型設(shè)計科學(xué)(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign)，第2版由奧頓(m.e.auten)編，2001，邱吉爾利文斯通公司(churchilllivingstone)中找到。在一個實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在無菌的供注射生理鹽水溶液中。

劑型的劑量包含不同量的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體的群。本發(fā)明的劑型中所存在的合成納米載體的量可以隨表面抗原的組的性質(zhì)、欲實現(xiàn)的治療益處以及其他此類參數(shù)而變化。在實施方案中，可以執(zhí)行劑量范圍研究以確立劑型中存在的合成納米載體的最佳治療量。在實施方案中，第一和第二群的存在量在給予受試者后有效對第一組表面抗原和第二組表面抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。有可能使用常規(guī)劑量范圍研究和技術(shù)確定有效在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的第一、第二和/或后續(xù)群的量。本發(fā)明的劑型可以在多種頻率下給予。在一個優(yōu)選實施方案中，至少一次給予劑型足夠產(chǎn)生藥理學(xué)有關(guān)的應(yīng)答。在更優(yōu)選的實施方案中，利用劑型的至少兩次給予、至少三次給予或至少四次給予來確保藥理學(xué)有關(guān)的應(yīng)答。

應(yīng)理解，本發(fā)明的組合物可以用任何適合的方式制備，并且本發(fā)明決不限于可以使用在此說明的方法制造的組合物。適當(dāng)方法的選擇可能要求注意相締合的特別部分的特性。在實施方案中，制造方法包括制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；并且將該第一和該第二群合成納米載體組合于一個藥物劑型中；其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上或在免疫上不同。

在一些實施方案中，本發(fā)明的合成納米載體在無菌條件下制造并且最后殺菌。此可以確保所得組合物是無菌的并且是非感染性的，因此當(dāng)與非無菌的組合物相比時，提高安全性。這提供了有價值的安全措施，特別是當(dāng)接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染，和/或?qū)Ω腥久舾袝r。在一些實施方案中，取決于配制策略，本發(fā)明的合成納米載體可以凍干并且儲存在懸浮液中或呈凍干粉末形式歷經(jīng)較長時間而無活性損失。

本發(fā)明的組合物可以通過多種給藥途徑來給予，包括但不限于腸胃外(如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))；經(jīng)口；經(jīng)鼻、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、舌下、直腸、眼用、透皮、經(jīng)皮或通過這些途徑的組合。

在此說明的組合物和方法可以用于誘導(dǎo)、增強(qiáng)、調(diào)節(jié)、刺激、抑制、引導(dǎo)或重新引導(dǎo)免疫應(yīng)答。在此說明的組合物和方法可以用于診斷、預(yù)防和/或治療多種病癥，如癌癥、感染性疾病、代謝性疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、免疫疾病、或其他失調(diào)和/或病癥。在此說明的組合物和方法還可以用于預(yù)防或治療成癮，如煙堿或麻醉藥成癮。在此說明的組合物和方法還可以用于預(yù)防和/或治療由于暴露于毒素、有害物質(zhì)、環(huán)境毒素、或其他有害介質(zhì)而導(dǎo)致的病癥。

在此提供的受試者可以罹患或有風(fēng)險罹患對濫用的或上癮的物質(zhì)的成癮。

在此提供的受試者可以罹患或有風(fēng)險罹患癌癥。癌癥包括但不限于乳癌；膽道癌；膀胱癌；腦癌，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；子宮頸癌；絨膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；血液學(xué)贅瘤，包括急性淋巴細(xì)胞性和骨髓性白血病，例如b細(xì)胞cll；t細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤；毛細(xì)胞白血病；慢性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤；aids相關(guān)白血病和成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤；上皮內(nèi)贅瘤，包括博文氏病(bowen′sdisease)和佩吉特氏病(paget′sdisease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括何杰金氏病(hodgkin′sdisease)和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細(xì)胞癌瘤；卵巢癌，包括從上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的那些；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤以及骨肉瘤)；皮膚癌，包括黑色素瘤、梅克爾細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤、基底細(xì)胞癌以及鱗狀細(xì)胞癌；睪丸癌，包括生殖瘤，如精原細(xì)胞瘤、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤、絨膜癌)、基質(zhì)腫瘤以及生殖細(xì)胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓樣癌；以及腎癌，包括腺癌和維爾姆斯氏瘤。

在此提供的受試者可以罹患或有風(fēng)險罹患感染或感染性疾病。感染或感染性疾病包括但不限于病毒性感染性疾病，如aids、禽痘(水痘)、普通感冒、細(xì)胞肥大病毒感染、科羅拉多蜱傳熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純性皰疹、帶狀皰疹、hpv、流形性感冒(flu)、拉沙熱、麻疹、馬爾堡出血熱、感染性單核細(xì)胞增多癥、腮腺炎、諾如病毒(norovirus)、脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病、狂犬病、風(fēng)疹、sars、天痘(天花)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅病以及黃熱?。患?xì)菌性感染性疾病，如炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、肉毒中毒、布魯氏菌病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷寒、淋病、膿皰病、軍團(tuán)病、麻瘋病(漢森病)、鉤端螺旋體病、李斯特菌病、萊姆病、類鼻疽、風(fēng)濕熱、mrsa感染、諾卡氏菌病、百日咳(pertussis/whoopingcough)、瘟疫、肺炎球菌肺炎、鸚鵡熱、q熱、落磯山斑疹熱(rmsf)、沙門菌病、猩紅熱、志賀氏桿病、梅毒、破傷風(fēng)、沙眼、肺結(jié)核、土拉菌病、傷寒、斑疹傷寒以及尿路感染；寄生蟲感染性疾病，如非洲睡眠病、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝蟲病、恰加斯氏病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絳蟲病、麥地那龍線蟲病、棘球蚴病、蟯蟲病、片吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自由生活阿米巴感染、賈第鞭毛蟲病、顎口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢子球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病(trichinellosis/trichinosis)、鞭蟲病、滴蟲病以及錐蟲??；真菌感染性疾病，如曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、香港腳(腳癬)以及股癬；朊病毒感染性疾病，如阿爾珀斯病、致死性家族性失眠、杰茨曼-斯脫司勒-史菌克綜合征(gerstmann--scheinkersyndrome)、庫魯癥以及變異的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(variantcreutzfeldt-jakobdisease)

實例

本發(fā)明參考以下實例將更容易理解，這些實例僅出于說明本發(fā)明的某些方面和實施方案的目的被包括且不作為限制。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可對剛才描述過的實施方案的不同的改寫和修改進(jìn)行配置，而無須偏離本發(fā)明的范圍和精神。本領(lǐng)域中已知的其他適合技術(shù)和方法可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以眾多特定模式并且根據(jù)在此所描述的本發(fā)明的描述而加以應(yīng)用。

因此，應(yīng)理解，本發(fā)明可不同于在此確切描述的來實施。以上描述旨在為說明性的，并且沒有限制性。在審閱以上描述后，多種其他實施方案對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是清楚的。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該參考所附權(quán)利要求以及此類權(quán)利要求所有權(quán)獲得的等效物的全部范圍來確定。

實例1：配制第一群納米載體(預(yù)示的)

經(jīng)由一種雙重乳液方法制備合成納米載體，這些合成納米載體包含plga-r848結(jié)合物(佐劑)、pla-peg-n3結(jié)合物(到肽抗原的連接物)以及卵清蛋白肽(t細(xì)胞抗原)，其中卵清蛋白肽封裝于合成納米載體中。在輕緩攪拌下向合成納米載體的懸浮液(10mg/ml于pbs(ph7.4緩沖液)中，5ml，含有約12.5mg(mw：20,000；0.000625mmol)pla-peg-n3)中添加包含乙炔連接物的hpvl1-肽(33mg)。添加抗壞血酸鈉的溶液(100mm于h2o中，0.3ml)，然后添加cuso4溶液(10mm于水中，0.6ml)。在20c下攪拌所得淡黃色懸浮液15小時并且添加另外的cuso4溶液(0.3ml)和抗壞血酸鈉溶液(0.15ml)。在20c下攪拌懸浮液5小時，并且用pbs緩沖液(ph7.4)稀釋到10ml并且進(jìn)行離心以去除上清液。用pbs緩沖液洗滌殘余納米載體球粒兩次。然后將洗滌過的nc再懸浮于5mlpbs緩沖液中并且進(jìn)行冷凍儲存。通過消化過的合成納米載體的hplc分析和通過生物分析來證實合成納米載體表面上的l1肽的結(jié)合。

實例2：配制第二群納米載體(預(yù)示的)

使用以上實例1中的通用程序概述，制備包含pla-r848、pla-peg-n3以及封裝的卵清蛋白肽的合成納米載體，并且將這些合成納米載體與hpvl2肽進(jìn)行結(jié)合以提供經(jīng)過l2肽結(jié)合的合成納米載體。

實例3：配制組合第一和第二群納米載體(預(yù)示的)

將來自以上實例1和2的合成納米載體制劑解凍并且于pbs中稀釋到每毫升5mg納米載體的最終濃度。組合各制劑的相同等分試樣(0.5ml)以提供含有hpvl1和l2肽兩者的納米載體群。

實例4：制備納米載體

制備nc-nic-ova

在普林斯頓全球合成中心(princetonglobalsynthesis)(喬治帕特森路300號206室(300georgepattersondrive#206)，布里斯托爾(bristol)，賓夕法尼亞州(pa)19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造具有約5,000da的peg嵌段和約21,000da的pla嵌段的pla-peg-煙堿(s-642)，即聚-d/l丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羥基甲基煙堿醚。通過使dl-丙交酯與具有dl-丙交酯的ho-peg-順丁烯二酰亞胺進(jìn)行開環(huán)聚合來產(chǎn)生pla嵌段，從商業(yè)起始物質(zhì)合成pla-peg-順丁烯二酰亞胺，該pla-peg-順丁烯二酰亞胺是由約22000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和約2900da的聚乙二醇(peg)嵌段組成并且由順丁烯二酰亞胺官能團(tuán)封端的嵌段共聚物。從emd化學(xué)公司(emdchemicalsinc.)(民主南路480號(480southdemocratroad)吉布斯鎮(zhèn)(gibbstown)，新澤西州(nj)08027，件號(partnumber)4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1：0.13nhcl于純化過的水中。

溶液2：通過將每種聚合物分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后組合2份plga-r848溶液與1份每種pla-peg-煙堿溶液和pla-peg-順丁烯二酰亞胺溶液，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848、25mg/mlpla-peg-煙堿以及25mg/mlpla-peg-順丁烯二酰亞胺。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀(bransondigitalsonifier)250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理40秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將納米載體懸浮液冷凍儲存于-20c下直到再使用。

表4：nc-nic-ova表征

(1)在表面上具有peg-煙堿和peg-mal的nc，如上制備；于pbs緩沖液中的6.5mg/ml懸浮液。

(2)ova蛋白質(zhì)(來自蛋白的卵白蛋白)：沃辛頓(worthington)，批號pok12101’mw：46000。

(3)特勞特氏試劑(traut′sreagent)(2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽)：mp生物醫(yī)學(xué)(mpbiomedical)，批號8830ka，mw：137.6

(4)ph8緩沖液(磷酸鈉，20mm，具有0.5mmedta)。

(5)ph71xpbs緩沖液。

將ova蛋白質(zhì)(10mg)溶解于1mlph8緩沖液中。將新鮮制造的特勞特氏試劑于ph8緩沖液中的溶液(0.25ml，2mg/ml)添加到ova蛋白質(zhì)溶液中。在暗處在氬氣下攪拌所得溶液1.5小時。用mwco3k透濾管對溶液進(jìn)行透濾，并且用ph8緩沖液洗滌兩次。在氬氣下將所得具有硫醇基的修飾過的ova溶解于1mlph8緩沖液中。對nc懸浮液(3ml，6.5mg/ml)進(jìn)行離心以去除上清液。然后將修飾過的ova溶液與nc球?；旌稀Ｔ诎堤幵跉鍤庀略谑覝叵聰嚢杷脩腋∫?2小時。然后用ph7pbs將nc懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心。用2×10mlph7pbs洗滌所得nc球粒。然后將nc-nic-ova結(jié)合物在儲存于4℃下的ph7pbs中(約6mg/ml，3ml)進(jìn)行再懸浮。

制備nc-ova

在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。通過使dl-丙交酯與ho-peg-順丁烯二酰亞胺進(jìn)行開環(huán)聚合來產(chǎn)生pla嵌段，從商業(yè)起始物質(zhì)合成pla-peg-順丁烯二酰亞胺，該pla-peg-順丁烯二酰亞胺是由約22000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和約2900da的聚乙二醇(peg)嵌段組成并且由順丁烯二酰亞胺官能團(tuán)封端的嵌段共聚物。從emd化學(xué)公司(民主南路480號，吉布斯鎮(zhèn)，新澤西州08027，件號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1∶0.13nhcl于純化過的水中。

溶液2：通過將每種聚合物分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后組合1份plga-r848溶液與1份pla-peg-順丁烯二酰亞胺溶液，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848和50mg/mlpla-peg-順丁烯二酰亞胺。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理40秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將納米載體懸浮液冷凍儲存于-20℃下直到再使用。

表5：nc-ova表征

(1)在表面上具有peg-mal的nc，如上制備；于pbs緩沖液中的6mg/ml懸浮液。

(2)ova蛋白質(zhì)(來自蛋白的卵白蛋白)：沃辛頓，批號pok12101，mw：46000。

(3)特勞特氏試劑(2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽)：mp生物醫(yī)學(xué)，批號8830ka，mw：137.6。

(4)ph8緩沖液(磷酸鈉，20mm，具有0.5mmedta)。

(5)ph71xpbs緩沖液。

將ova蛋白質(zhì)(20mg)溶解于1mlph8緩沖液中。將新鮮制造的特勞特氏試劑于ph8緩沖液中的溶液(0.5ml，2mg/ml)添加到ova蛋白質(zhì)溶液中。在暗處在氬氣下攪拌所得溶液1.5小時。用mwco3k透濾管對溶液進(jìn)行透濾，并且用ph8緩沖液洗滌兩次。在氬氣下將所得具有硫醇基的修飾過的ova溶解于1mlph8緩沖液中。對nc懸浮液(4ml，6mg/ml)進(jìn)行離心以去除上清液。然后將修飾過的ova溶液與nc球粒混合。在暗處在氬氣下在室溫下攪拌所得懸浮液12小時。然后用ph7pbs將nc懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心。用2×10mlph7pbs洗滌所得nc球粒。然后將nc-ova結(jié)合物在儲存于4℃下的ph7pbs中(約6mg/ml，4ml)進(jìn)行再懸浮。

制備nc-ha5

從巴亨美洲公司(bachemamericasinc.)(柏市街3132號(3132kashiwastreet)，托倫斯(torrance)加利福尼亞州(ca)90505，產(chǎn)品代碼4065609)購買卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。通過使dl-丙交酯與ho-peg-順丁烯二酰亞胺進(jìn)行開環(huán)聚合來產(chǎn)生pla嵌段，從商業(yè)起始物質(zhì)合成pla-peg-順丁烯二酰亞胺，該pla-peg-順丁烯二酰亞胺是由約22000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和約2900da的聚乙二醇(peg)嵌段組成并且由順丁烯二酰亞胺官能團(tuán)封端的嵌段共聚物。從emd化學(xué)公司(民主南路480號吉布斯鎮(zhèn)，新澤西州08027，件號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1：在室溫下在0.13nhcl中制備20mg/ml卵白蛋白肽323-339。

溶液2：通過將每種聚合物分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后組合1份plga-r848溶液與1份pla-peg-順丁烯二酰亞胺溶液，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848和50mg/mlpla-peg-順丁烯二酰亞胺。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理40秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將納米載體懸浮液冷凍儲存于-20℃下直到再使用。

表6：nc-ha5表征

(1)在表面上具有peg-mal的nc，如上制備；于pbs緩沖液中的6.7mg/ml懸浮液。

(2)ha5蛋白質(zhì)：重組血球凝集素，a/越南(vietnam)/1203/2004，mw：72000，以于ph7pbs-吐溫(tween)緩沖液中之溶液(0.55mg/ml)形式提供。

(3)特勞特氏試劑(2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽)：mp生物醫(yī)學(xué)，批號8830ka，mw：137.6。

(4)ph8緩沖液(磷酸鈉，20mm，具有0.5mmedta)。

(5)ph71xpbs緩沖液。

用ph8緩沖液將ha5蛋白質(zhì)(0.21g于0.38mlph7.1pbs-吐溫緩沖液中)稀釋到0.5ml。將新鮮制造的特勞特氏試劑于ph8緩沖液中的溶液(0.02ml，2mg/ml)添加到ha5蛋白質(zhì)溶液中。在暗處在氬氣下攪拌所得溶液1.5小時。用mwco3k透濾管對溶液進(jìn)行透濾，并且用ph8緩沖液洗滌兩次。在氬氣下將所得具有硫醇基的修飾過的ha5蛋白質(zhì)溶解于0.5mlph8緩沖液中。對nc懸浮液(3ml，6.7mg/ml)進(jìn)行離心以去除上清液。然后將修飾過的ha5溶液與nc球?；旌稀Ｔ诎堤幵跉鍤庀略谑覝叵聰嚢杷脩腋∫?2小時。然后用ph7pbs將nc懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心。用2×10mlph7pbs洗滌所得nc球粒。然后將nc-ha5結(jié)合物再懸浮于儲存于4℃下的ph7pbs中(約6mg/ml，3ml)。

制備nc-l2、nc-m2e或nc-m2e-l2

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯加利福尼亞州90505，產(chǎn)品代碼4065609)購買卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。通過使ho-peg-cooh結(jié)合到氨基-c6h12-疊氮基上并且然后通過使所得ho-peg-c6-n3與d1-丙交酯進(jìn)行開環(huán)聚合來產(chǎn)生pla嵌段，從而合成pla-peg-c6-n3，該pla-peg-c6-n3是由約23000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和約2000da的聚乙二醇(peg)嵌段組成并且由連接到疊氮基上的結(jié)合酰胺的c6h12連接物封端的嵌段共聚物。從emd化學(xué)公司(民主南路480號，吉布斯鎮(zhèn)，新澤西州08027，件號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1：在室溫下在0.13nhcl中制備20mg/ml卵白蛋白肽323-339。

溶液2：通過各自分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后以相同體積份組合，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848和50mg/mlpla-peg-c6-n3。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理40秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。產(chǎn)生兩個相同批次并且然后組合以形成單個均勻懸浮液，將它冷凍儲存于-20℃下直到再使用。

表7：nc-l2、nc-m2e或nc-m2e-l2表征

(1)具有表面peg-c6-n3并且含有plga-r848和卵清蛋白肽的納米載體，如上制備，于pbs中的7mg/ml懸浮液。

(2)以連接于c端lys氨基的炔連接物修飾的hpv16l2肽；巴亨美洲公司，批號b06055，mw2595，tfa鹽；序列：

h-ala-thr-gln-leu-tyr-lys-thr-cys-lys-gln-ala-gly-thr-cys-pro-pro-asp-ile-ile-pro-lys-val-lys(5-己酰基)-nh2(具有cys-cys二硫鍵)。

(3)催化劑：cuso4，100mm于去離子水中；thpta配體，200mm于去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm于新鮮制備的去離子水中。

(4)ph7.4pbs緩沖液。

通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮到約1ml體積。添加l2肽(20mg)于2mlpbs緩沖液中的溶液。添加0.2mlcuso4(100mm)與0.2mlthpta配體(200mm)的預(yù)混合的溶液，然后添加0.4ml抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下攪拌所得淡黃色懸浮液18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心以去除上清液。將nc-l2結(jié)合物進(jìn)一步制粒，用10mlpbs緩沖液洗滌兩次，并且將它們以約6mg/ml(約4ml)的最終濃度再懸浮于ph7.4緩沖液中，并且儲存于4℃下。

(1)具有表面peg-c6-n3并且含有plga-r848和卵清蛋白肽的納米載體，如上制備，于pbs中的7mg/ml懸浮液。

(2)以連接于c端gly的炔連接物修飾的m2e肽；csbio公司(csbioco)，目錄號cs4956，批號：h308，mw2650，tfa鹽；序列：

h-met-ser-leu-leu-thr-glu-val-glu-thr-pro-thy-arg-asn-glu-trp-glu-cys-arg-cys-ser-asp-gly-gly-nhch2cch。

(3)催化劑：cuso4，100mm于去離子水中；thpta配體，200mm于去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm于新鮮制備的去離子水中。

(4)ph7.4pbs緩沖液。

通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，4ml)濃縮到約1ml體積。添加m2e肽(20mg)于2mlpbs緩沖液中的溶液。添加0.2mlcuso4(100mm)與0.2mlthpta配體(200mm)的預(yù)混合的溶液，然后添加0.4ml抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下攪拌所得淡黃色懸浮液18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心以去除上清液。用10mlpbs緩沖液進(jìn)一步洗滌nc-m2e結(jié)合物球粒兩次，并且將它們以約6mg/ml(約4ml)的最終濃度再懸浮于ph7.4緩沖液中，并且儲存于4℃下。

(1)具有表面peg-c6-n3并且含有plga-r848和卵清蛋白肽的納米載體，如上制備，于pbs中的7mg/ml懸浮液。

(2)以連接于c端lys氨基的炔連接物修飾的hpv16l2肽；巴亨美洲公司，批號b06055，mw2595，tfa鹽；序列：

h-ala-thr-gln-leu-tyr-lys-thr-cys-lys-gln-ala-gly-thr-cys-pro-pro-asp-ile-ile-pro-lys-val-lys(5-己?；?-nh2(具有cys-cys二硫鍵)。

(3)以連接于c端gly的炔連接物修飾的m2e肽；csbio公司，目錄號cs4956，批號：h308，mw2650，tfa鹽；序列：

h-met-ser-leu-leu-thr-glu-val-glu-thr-pro-thy-arg-asn-glu-trp-glu-cys-arg-cys-ser-asp-gly-gly-nhch2cch。

(4)催化劑：cuso4，100mm于去離子水中；thpta配體，200mm于去離子水中；抗壞血酸鈉，200mm于新鮮制備的去離子水中。

(5)ph7.4pbs緩沖液。

通過離心將nc懸浮液(7mg/ml，2ml)濃縮到約0.5ml體積。添加l2肽(5mg)和m2e肽(5mg)于1mlpbs緩沖液中的混合物。添加0.2mlcuso4(100mm)與0.2mlthpta配體(200mm)的預(yù)混合的溶液，然后添加0.4ml抗壞血酸鈉(200mm)。在暗處在環(huán)境室溫下攪拌所得淡黃色懸浮液18小時。然后用pbs緩沖液將懸浮液稀釋到10ml，并且進(jìn)行離心以去除上清液。用10mlpbs緩沖液進(jìn)一步洗滌nc-m2e-l2結(jié)合物球粒兩次，并且將它們以約6mg/ml(約2ml)的最終濃度再懸浮于ph7.4緩沖液中，并且儲存于4℃下。

實例5：用兩種單價抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對這兩種抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-nic和nc-ova(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗煙堿(深灰色柱狀圖)和抗卵白蛋白(淺灰色柱狀圖)抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖1中示出(針對聚賴氨酸-煙堿或卵白蛋白蛋白質(zhì)的ellsa)(組1：未免疫的；組2：用nc-nic和nc-ova免疫過的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-nic(在外表面上展現(xiàn)煙堿并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)和100μgnc-ova(在外表面上展現(xiàn)卵白蛋白并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗煙堿和抗卵白蛋白抗體滴度。示出了如通過針對聚賴氨酸-煙堿或卵白蛋白蛋白質(zhì)的elisa所測量的抗煙堿和抗卵白蛋白抗體滴度(ec50)(圖1)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。結(jié)果證實，用兩種單價抗原納米載體(nc-nic和nc-ova)的組合免疫過的小鼠針對這兩種抗原產(chǎn)生抗體。

實例6：用單價和二價抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對所有三種抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-nic-ova和nc-l2(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗煙堿、抗卵白蛋白以及抗l2肽抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖2中示出(針對聚賴氨酸-煙堿、卵白蛋白蛋白質(zhì)或pla-peg-l2肽的elisa)(組1：未免疫的；組2：用nc-nic-ova和nc-l2免疫過的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-nic-ova(在外表面上展現(xiàn)煙堿和卵白蛋白并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)和100μgnc-l2(在外表面上展現(xiàn)hpvl2肽(aa17-36)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗煙堿、抗卵白蛋白以及抗l2肽抗體滴度。示出了如通過針對聚賴氨酸-煙堿、卵白蛋白蛋白質(zhì)以及l(fā)2肽的elisa所測量的抗煙堿、抗卵白蛋白以及抗l2肽抗體滴度(ec50)(圖2)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。結(jié)果證實，用一種單價抗原納米載體和一種二價抗原納米載體(nc-nic-ova和nc-l2)的組合免疫過的小鼠針對所有三種抗原產(chǎn)生抗體。

實例7：用兩種二價抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對所有四種抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-nic-ova和nc-m2e-l2(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗煙堿、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖3中示出(針對聚賴氨酸-煙堿、卵白蛋白蛋白質(zhì)、pla-peg-m2e肽或pla-peg-l2肽的elisa)(組1：未免疫的；組2：用nc-nic-ova和nc-m2e-l2免疫過的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-nic-ova(在外表面上展現(xiàn)煙堿和卵白蛋白并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)和100μgnc-m2e-l2(在外表面上展現(xiàn)流感m2e肽(aa2-27)和hpvl2肽(aa17-36)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗煙堿、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。示出了如通過針對聚賴氨酸-煙堿、卵白蛋白蛋白質(zhì)、m2e肽以及l(fā)2肽的elisa所測量的抗煙堿、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度(ec50)(圖3)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。結(jié)果證實，用兩種二價抗原納米載體(nc-nic-ova和nc-m2e-l2)的組合免疫過的小鼠針對所有四種抗原產(chǎn)生抗體。

實例8：用兩種單價肽抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對這兩種肽抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-m2e和nc-l2(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗m2e肽和抗l2肽抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖4中示出(針對pla-peg-m2e肽或pla-peg-l2肽的elisa)(組1：未免疫的；組2：用nc-m2e和nc-l2免疫過的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-m2e(在外表面上展現(xiàn)流感m2e肽(aa2-27)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)和100μgnc-l2(在外表面上展現(xiàn)hpvl2肽(aa17-36)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗m2e肽和抗l2肽抗體滴度。示出了如通過針對m2e肽和l2肽的elisa所測量的抗m2e肽和抗l2肽抗體滴度(ec50)(圖4)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。這些結(jié)果證實，用兩種單價肽抗原納米載體(nc-m2e和nc-l2)的組合免疫過的小鼠針對這兩種肽抗原產(chǎn)生抗體。

實例9：用兩種單價蛋白質(zhì)抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對這兩種蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-ha5和nc-ova(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗ha5蛋白質(zhì)和抗卵白蛋白蛋白質(zhì)抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖5中示出(針對h5n1ha蛋白質(zhì)或卵白蛋白蛋白質(zhì)的elisa)(組1：未免疫的；組2：用nc-ha5和nc-ova免疫的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-ha5蛋白質(zhì)(在外表面上展現(xiàn)流感h5n1ha蛋白質(zhì)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)和100μgnc-ova(在外表面上展現(xiàn)卵白蛋白并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗ha5和抗卵白蛋白抗體滴度。示出了如通過針對h5n1ha蛋白質(zhì)和卵白蛋白蛋白質(zhì)的elisa所測量的抗ha5和抗卵白蛋白抗體滴度(ec50)(圖5)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。這些結(jié)果證實，用兩種單價蛋白質(zhì)抗原納米載體(nc-ha5和nc-ova)的組合免疫過的小鼠針對這兩種蛋白質(zhì)抗原產(chǎn)生抗體。

實例10：用兩種單價抗原納米載體和一種二價抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對所有四種抗原的免疫應(yīng)答

測量未免疫的小鼠和注射過nc-ha5、nc-ova以及nc-m2e-l2(如實例4中所制備)的小鼠(5只動物/組；皮下，每次注射100μg每種nc，以3周為間隔進(jìn)行2次)的抗ha、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。用nc進(jìn)行免疫后第33天的滴度在圖6中示出(針對ha蛋白質(zhì)、卵白蛋白蛋白質(zhì)、pla-peg-m2e肽或pla-peg-l2肽的elisa)(組1：未免疫的；組2：用nc-ha5、nc-ova以及nc-m2e-l2免疫過的)。

以3周為間隔(第0天和第21天)給小鼠注射100μgnc-ha5蛋白質(zhì)(在外表面上展現(xiàn)流感h5n1ha蛋白質(zhì)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)、100μgnc-ova(在外表面上展現(xiàn)卵白蛋白并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)以及100μgnc-m2e-l2(在外表面上展現(xiàn)流感m2e肽(aa2-27)和hpvl2肽(aa17-36)并且在nc中含有op-ii輔助肽和r848佐劑的納米載體)(皮下，后肢)。在用nc進(jìn)行免疫后第33天測量血清抗ha、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度。示出了如通過針對ha蛋白質(zhì)、卵白蛋白蛋白質(zhì)、m2e肽以及l(fā)2肽的elisa所測量的抗ha、抗卵白蛋白、抗m2e肽以及抗l2肽抗體滴度(ec50)(圖6)。還示出了未免疫的對照小鼠的滴度。這些結(jié)果證實，用兩種單價抗原納米載體和一種二價抗原納米載體(nc-ha5、nc-ova以及nc-m2e-l2)的組合免疫過的小鼠針對所有四種抗原產(chǎn)生抗體。

實例11：用兩種單價抗原納米載體和一種二價抗原納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對所有四種抗原的免疫應(yīng)答

測量用nc-m2e、nc-l2肽以及nc-煙堿-卵白蛋白的組合(如實例4中所制備)免疫過的小鼠的抗體滴度。nc-m2e和nc-l2肽含有op-iit輔助肽(對應(yīng)地為2.0％和2.4％)和r848佐劑(對應(yīng)地為3.6％和4.3％)；nc-煙堿-卵白蛋白含有r848佐劑(4.2％)。圖7的每個柱狀圖表示針對抗原的滴度。通過每次注射120μg每種nc對每組五只動物進(jìn)行皮下免疫，以3周為間隔進(jìn)行2次。示出了第一次免疫后第33天的滴度(對應(yīng)地針對pla-peg-m2e、pla-peg-l2、卵白蛋白以及聚賴氨酸-煙堿進(jìn)行的elisa)。

這些結(jié)果證實，用各自攜帶一種不同肽抗原的兩種nc與攜帶另外兩種抗原的一種nc一起的組合進(jìn)行的免疫導(dǎo)致針對所有四種nc攜帶的抗原產(chǎn)生抗體。當(dāng)使用相同量的三種nc(第一種含有來自a型流感病毒的表面m2e肽(m2基質(zhì)蛋白質(zhì)的胞外域，氨基酸2-27)，第二種含有來自hpv病毒的表面l2肽(來自hpv-16的l2衣殼蛋白的氨基酸17-36)，并且第三種攜帶表面煙堿和卵白蛋白蛋白質(zhì))進(jìn)行動物免疫時，在所有動物中都誘導(dǎo)了針對所有四種nc偶合的抗原的強(qiáng)體液應(yīng)答(圖7)。在預(yù)免疫小鼠的血清中沒有檢測到反應(yīng)性。

實例12：用在不同空間定向上具有抗原的兩種單價納米載體進(jìn)行的免疫導(dǎo)致對這兩種定向的免疫應(yīng)答

制備nc-3′-煙堿

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯加利福尼亞州90505，產(chǎn)品代碼4065609)購買卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。在普林斯頓全球合成中心(300喬治帕特森路206號，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造具有約5,000da的peg嵌段和約21,000da的pla嵌段的pla-peg-煙堿(s-642)，即聚-d/l丙交酯-嵌段-聚(乙二醇)-(±)-反-3′-羥基甲基煙堿醚。從emd化學(xué)公司(民主南路480號吉布斯鎮(zhèn)，新澤西州08027，件號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1：在室溫下在0.13nhcl中制備20mg/ml卵白蛋白肽323-339。

溶液2：通過將每種聚合物分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后組合2份plga-r848溶液與1份每種pla-peg-煙堿溶液和pla溶液，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848、25mg/mlpla-peg-煙堿以及25mg/mlpla。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理40秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將納米載體懸浮液冷凍儲存于-20℃下直到再使用。

表8：nc-3′-煙堿表征

制備nc-1′-煙堿

從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯加利福尼亞州90505，產(chǎn)品代碼4065609)購買卵白蛋白肽323-339酰胺乙酸鹽。在普林斯頓全球合成中心(喬治帕特森路300號206室，布里斯托爾，賓夕法尼亞州19007)專門制造約7,000da的plga-r848(聚-d/l-丙交酯-共-乙交酯，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-1h-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇酰胺)，該plga-r848是由3∶1丙交酯與乙交酯比率的plga制造并且具有約8.5％w/w的結(jié)合瑞喹莫德含量。合成pla-peg-1′-nic，即由約23000da的聚-d/l-丙交酯(pla)嵌段和約2000da的聚乙二醇(peg)嵌段組成并且經(jīng)由連到煙堿上的1′氨基的4-碳鍵與煙堿結(jié)合的嵌段共聚物。簡言之，通過與環(huán)氧乙烷聚合而將在1′位置處具有丁醇連接物的煙堿制成ho-peg-1′-nic，并且然后通過使ho-peg-1′-nic與dl-丙交酯進(jìn)行開環(huán)聚合而產(chǎn)生pla加長部分。從塞莫迪克斯藥物公司(surmodicspharmaceuticals)(湯姆馬丁路756號(756tommartindrive)，伯明翰(birmingham)，阿拉巴馬州(al)35211，產(chǎn)品代碼100dl2a)購買具有0.22dl/g的固有黏度的pla。從emd化學(xué)公司(民主南路480號吉布斯鎮(zhèn)，新澤西州08027，件號4-88)購買聚乙烯醇pheur，usp(85％-89％水解的，黏度是3.4-4.6mpa.s)。

溶液如下制備：

溶液1：在室溫下在0.13nhcl中制備20mg/ml卵白蛋白肽323-339。

溶液2：通過將每種聚合物分別地以100mg/ml溶解于二氯甲烷中，然后組合2份plga-r848溶液與1份每種pla-peg-1′-nic溶液和pla溶液，制備于二氯甲烷中的50mg/mlplga-r848、25mg/mlpla-peg-1′-nic以及25mg/mlpla。

溶液3：于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

溶液4：70mm磷酸鹽緩沖液，ph8。

首先使用溶液1和溶液2產(chǎn)生一種初級(w1/o)乳液。將溶液1(0.2ml)和溶液2(1.0ml)組合于一個小玻璃壓力管中，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。然后通過添加溶液3(2.0ml)到初級乳液中，渦旋以產(chǎn)生一種過程分散體，并且然后使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒，從而形成二級(w1/o/w2)乳液。

添加二級乳液到含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的一個50ml開口燒杯中，并且在室溫下攪拌2小時以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且納米載體形成于懸浮液中。通過將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，以21,000rcf旋轉(zhuǎn)45分鐘，去除上清液，并且將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中，借此洗滌一部分懸浮的納米載體。重復(fù)此洗滌程序，并且然后將球粒再懸浮于磷酸鹽緩沖生理鹽水中以獲得具有以聚合物計10mg/ml的標(biāo)稱濃度的納米載體懸浮液。將納米載體懸浮液冷凍儲存于-20℃下直到再使用。

表9：nc-1′-煙堿表征

免疫和結(jié)果

測量用nc-3′-煙堿與nc-1′-煙堿的組合免疫過的小鼠的抗體滴度。nc-3′-煙堿和nc-1′-煙堿含有op-iit輔助肽(2.1％)和r848佐劑(4.2％)。圖8的每個柱狀圖表示針對抗原的滴度。通過每次注射120μg每種nc對每組五只動物進(jìn)行皮下免疫，以3周為間隔進(jìn)行2次。示出了第一次免疫后第33天的滴度(對應(yīng)地針對聚賴氨酸-煙堿進(jìn)行的elisa)。

這些結(jié)果顯示，用各自攜帶相同抗原但處于不同空間定向上的兩種nc的組合進(jìn)行的免疫導(dǎo)致針對相同抗原的這些不同定向兩者都產(chǎn)生抗體。使用相同量的兩種nc(第一種含有在3′位置處連接于nc的表面煙堿，并且第二種在1′位置處連接于nc)進(jìn)行動物免疫時，在所有動物中都誘導(dǎo)了針對煙堿的兩種定向的強(qiáng)體液應(yīng)答(圖8)。在預(yù)免疫小鼠的血清中沒有檢測到反應(yīng)性。

實例13：制備聚合物和納米載體

制備plga-r848

如下通過使含有酸端基的plga聚合物與r848在存在諸如hbtu的偶合劑的情況下反應(yīng)來制備plga-r848。在氬氣下在室溫下攪拌plga(湖岸聚合物公司(lakeshorespolymers)，mw約5000，7525dlg1a，酸值0.7mmol/g，10g，7.0mmol)和hbtu(5.3g，14mmol)于無水etoac(160ml)中的混合物50分鐘。添加化合物r848(2.2g，7mmol)，然后添加二異丙基乙胺(dipea)(5ml，28mmol)。在室溫下攪拌混合物6小時，并且隨后在50℃至55℃下攪拌一整夜(約16小時)。在冷卻之后，用etoac(200ml)稀釋混合物，并且用飽和nh4cl溶液(2×40ml)、水(40ml)以及鹽水溶液(40ml)進(jìn)行洗滌。經(jīng)na2so4(20g)干燥溶液，并且將它濃縮為膠狀殘余物。然后添加異丙醇(ipa)(300ml)，并且聚合物結(jié)合物從溶液中沉淀析出。然后用ipa(4×50ml)洗滌聚合物以去除殘余試劑，并且在35℃-40℃下在真空下干燥3天而成為白色粉末(10.26g，通過gpc測得mw是5200，通過hplc測得r848負(fù)載是12％)。

以類似方式，通過使pla-co2h(具有酸端基的聚丙交酯)與r848反應(yīng)來制備pla-r848。

制備pla-peg-co2h

在60℃下在真空下干燥于一個100ml圓底燒瓶中的ho-peg-co2h(mw：2000，1.0g，0.5mmol)、dl-丙交酯(10.8g，75mmol)以及na2so4(15g)的混合物2天。添加無水甲苯(30ml)，并且在氬氣下加熱混合物到回流。添加sn(oct)2(0.162ml，0.5mmol)。在氬氣下回流混合物一整夜并且冷卻到環(huán)境室溫。用ch2cl2(200ml)稀釋混合物，并且經(jīng)由硅藻土(celite.)墊進(jìn)行過濾。將濾液濃縮為稠的粘性殘余物。在劇烈攪拌下添加含10％meoh的乙醚(200ml)以使聚合物沉淀析出。用含10％meoh的乙醚(100ml)進(jìn)一步洗滌聚合物并且在30℃下在真空下進(jìn)行干燥，以得到呈灰白色泡沫固體狀的pla-peg-co2h共聚物(10.0g，cdcl3的hnmr顯示聚合物具有21000的mw)。

制備pla-peg-nh2

在60℃下在真空下干燥于一個100ml圓底燒瓶中的ho-peg-nh2.hcl(mw：3500，1.0g，0.28mmol)、dl-丙交酯(6.1g，42mmol)以及na2so4(10g)的混合物1天。添加無水甲苯(30ml)，并且在氬氣下加熱混合物到90℃。添加sn(oct)2(0.1ml，0.28mmol)。在氬氣下回流混合物一整夜并且冷卻到環(huán)境室溫。用乙酸乙酯(200ml)稀釋混合物，并且經(jīng)由硅藻土墊進(jìn)行過濾。將濾液濃縮為稠的粘性殘余物。在劇烈攪拌下添加含10％meoh的叔丁基甲基醚(mtbe)(200ml)以使聚合物沉淀析出。用含5％meoh的mtbe(50ml)和mtbe(50ml)進(jìn)一步洗滌聚合物并且在30℃下在真空下進(jìn)行干燥，以得到呈灰白色泡沫固體狀的pla-peg-nh2.hcl共聚物(5.0g，cdcl3的hnmr顯示聚合物具有18000的mw)。

制備pla-peg-peg3-n3

如下通過使ho-peg-疊氮基與dl-丙交酯在存在例如sn(oct)2的催化劑的情況下進(jìn)行開環(huán)聚合來制備pla-peg-n3聚合物。在存在于無水dcm(10ml)中的dcc(mw206，0.117g，0.57mmol)和nhs(mw115，0.066g，0.57mmol)的情況下用nh2-peg3-n3(mw218.2，0.1g，0.458mmol)處理ho-peg-co2h(mw3500，1.33g，0.38mmol)一整夜。在進(jìn)行過濾以去除不溶性副產(chǎn)物(dcc-脲)后，對溶液進(jìn)行濃縮，并且然后用乙醚進(jìn)行稀釋以使聚合物ho-peg-peg3-n3(1.17g)沉淀析出。在干燥后，在一個100ml燒瓶中將ho-peg-peg3-n3(mw3700，1.17g，0.32mmol)與dl-丙交酯(從etoac再結(jié)晶的，mw144，6.83g，47.4mmol)和na2so4(10g)混合。在45℃下在真空下干燥固體混合物一整夜并且添加無水甲苯(30ml)。在氬氣下加熱所得懸浮液到110℃并且添加sn(oct)2(mw405，0.1ml，0.32mmol)。在回流下加熱混合物18小時并且冷卻到室溫。用dcm(50ml)稀釋混合物并且進(jìn)行過濾。在濃縮為油狀殘余物之后，添加mtbe(200ml)以使聚合物沉淀析出，用100ml含10％meoh的mtbe和50mlmtbe洗滌該聚合物一次。在干燥后，獲得呈白色泡沫狀的pla-peg-peg3-n3(7.2g，通過hnmr測得平均mw：23,700)。

制備pla-peg-c6-n3

在存在于無水dcm(10ml)中的dcc(mw206，0.118g，0.57mmol)和nhs(mw115，0.066g，0.57mmol)的情況下用6-疊氮基-1-己胺(h2n-c6-n3)(mw142，0.081g，0.57mmol)處理ho-peg-co2h(mw3500，1.00g，0.29mmol)一整夜。在進(jìn)行過濾以去除不溶性副產(chǎn)物(dcc-脲)后，對溶液進(jìn)行濃縮，并且然后用mtbe進(jìn)行稀釋以使聚合物沉淀析出，然后用mtbe洗滌該聚合物兩次并且在30℃下在真空下干燥一整夜，以得到ho-peg-c6-n3聚合物(1.1g)。將ho-peg-c6-n3聚合物(1.1g，0.29mmol)和dl-丙交酯(6.5g，45mmol)混合于無水甲苯(60ml)中。加熱混合物到回流，同時通過共沸物蒸餾來去除30ml甲苯。冷卻所得溶液到100℃并且添加sn(oct)2(0.095ml，0.29mmol)。在氬氣下在回流下加熱溶液一整夜并且冷卻到室溫。然后將溶液添加到150ml2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用2-丙醇(100ml)洗滌該聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到呈灰白色固體狀的pla-peg-c6-n3共聚物(6.8g，通過gpc測得mw是27000，dpi是1.5)。

制備pla-peg(5k)-conh2nh2

在室溫下攪拌ho-peg(5k)-co2h(鍵凱技術(shù)(jenkemtechnology)，美國(usa))(mw：5000，1.0g，0.2mmol))、肼基甲酸叔丁酯(boc-酰肼)(mw：132，0.053g，0.4mmol))、dcc(mw206，0.083g，0.4mmol)以及n-羥基丁二酰亞胺(nhs)(mw115，0.05g，0.4mmol)于無水dcm(15ml)中的混合物25小時。通過過濾去除不溶性dcc-脲并且濃縮濾液。將殘余物添加到50mlmtbe中以使聚合物沉淀析出，用40mlmtbe洗滌該聚合物兩次并且在真空下干燥2天，以得到呈白色粉末狀的ho-peg(5k)-conhnhtboc(1.07g)。將ho-peg(5k)-conhnhtboc聚合物(1.07g，0.20mmol)和dl-丙交酯(4.32g，30mmol)混合于無水甲苯(70ml)中。加熱混合物到回流，同時通過共沸物蒸餾來去除50ml甲苯。冷卻所得溶液到100℃并且添加sn(oct)2(0.065ml，0.20mmol)。在氬氣下在回流下加熱溶液22小時并且冷卻到室溫。然后將溶液添加到150ml2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用2-丙醇(60ml)洗滌該聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到呈白色固體塊狀的pla-peg(5k)-conhnhtboc共聚物。將聚合物溶解于50ml無水dcm中并且用冰水進(jìn)行冷卻。添加三氟乙酸(tfa)(15ml)并且在室溫下攪拌所得溶液一整夜。將微黃色的溶液濃縮到干燥。將殘余物添加到200ml2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用100ml2-丙醇洗滌該聚合物。在真空下在30℃下干燥聚合物以得到所希望的聚合物，即pla-peg(5k)-conhnh2(3.4g，通過nmr測得mw：24000)。制備pla-peg-mal

在一個100ml燒瓶中將ho-peg(3k)-順丁烯二酰亞胺(ho-peg-mal)(萊桑生物公司(laysanbio，inc))(mw：3000，0.6g，0.2mmol)與dl-丙交酯(從etoac再結(jié)晶的，mw144，4.32g，30mmol)和na2so4(4g)混合。在60℃下在真空下干燥固體混合物一整夜并且添加無水甲苯(20ml)。在氬氣下加熱所得懸浮液到110℃并且添加sn(oct)2(mw405，0.065ml，0.2mmol)。在回流下加熱混合物20小時并且冷卻到室溫。用dcm(50ml)稀釋混合物并且進(jìn)行過濾。在濃縮為油狀殘余物之后，添加含10％meoh的乙醚(80ml)以使聚合物沉淀析出，用80ml含10％meoh的乙醚和60ml乙醚洗滌該聚合物一次。在真空下在30℃下干燥一整夜后，獲得呈白色泡沫狀的pla-peg(3k)-mal(3.26g，通過hnmr測得平均mw：24,000)。

制備pla-peg-sh(預(yù)示的)

根據(jù)文獻(xiàn)(尼莎c.卡拉瑞卡爾(nishac.kalarickal)等人；巨分子(macromolecules)2007，40：1874-1880)制備pla-peg-sh共聚物。簡言之，進(jìn)行以下步驟。

步驟-1.制備tbus-peg：將無水thf(22ml)、萘鉀(potassiumnaphthalene)(于thf中的0.2m溶液，12ml)以及tbu-sh(0.54ml，4.8mmol)裝到一個密封的100ml圓底燒瓶中。攪拌這些組分至少15分鐘以確保形成硫醇鹽，這時使用一個兩頭的針添加液體環(huán)氧乙烷(eo)(11.5ml，0.230mol)。進(jìn)行聚合反應(yīng)48小時，并且通過在冷乙醚中沉淀來回收產(chǎn)物。通過gpc測得聚合物的mw是約2100。

步驟-2.制備(peg-s)2：將來自步驟-1的tbu-s-peg(1.0g)溶解于dmso(19ml)中，然后添加tfa(106ml，15/85v/v)以達(dá)到8mg/ml的最終聚合物濃度。攪拌反應(yīng)物20分鐘，此后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來去除tfa。然后將殘余物沉淀于冷乙醚中兩次以回收粗peg二硫化物。通過分步沉淀來進(jìn)一步純化粗(peg-s)2。因此，將聚合物(1.0g)溶解于二氯甲烷(100ml)中，并且然后在攪拌下逐步添加冷乙醚直到出現(xiàn)沉淀。進(jìn)一步攪拌溶液30分鐘，并且通過過濾將沉淀的物質(zhì)分離并且在真空中進(jìn)行干燥。在兩到三個分步沉淀結(jié)束時，peg二硫化物(peg-s)2的回收產(chǎn)率在55％-60％范圍中。

步驟-3.通過使dl-丙交酯進(jìn)行開環(huán)聚合來制備(pla-b-peg-s)2：將(peg-s)2(0.4g，0.10mmol)和dl-丙交酯(4.32g，30mmol)混合于無水甲苯(70ml)中。加熱混合物到回流，同時通過共沸物蒸餾來去除50ml甲苯。冷卻所得溶液到100℃并且添加sn(oct)2(0.065ml，0.20mmol)。在氬氣下在回流下加熱溶液18-20小時并且冷卻到室溫。然后將溶液添加到150ml2-丙醇中以使聚合物沉淀析出，用2-丙醇(60ml)和乙醚(60ml)洗滌該聚合物并且在30℃下在真空下干燥2天，以得到(pla-peg-s)2(約4.0g，mw：46000)。

步驟-4.通過還原(pla-peg-s)2來制備pla-peg-sh：將來自步驟-3的(pla-peg-s)2(3.2g，0.07mmol)溶解于經(jīng)過去氧的thf(25ml)中，并且添加bu3p(1.7ml，7.0mmol，就二硫化物單元而論是100當(dāng)量)。在室溫下在氬氣下攪拌反應(yīng)混合物一整夜。通過在冷乙醚中進(jìn)行沉淀然后在氬氣氛下進(jìn)行過濾來回收被還原的硫醇化的聚合物，并且在真空下進(jìn)行進(jìn)一步干燥，以得到呈灰白色塊狀固體狀的pla-peg-sh(約3.0，mw：23000)。

制備具有表面peg-x并且含有封裝的卵清蛋白肽的納米載體

經(jīng)由一種雙重乳液方法制備納米載體，這些納米載體包含plga-r848、pla-peg-x(其中x＝羧酸(co2h)、胺(nh2)、c6-疊氮基(c6-n3)或peg3-疊氮基(peg3-n3)、酰肼(conhnh2)、順丁烯二酰亞胺(mal)、硫醇(sh)以及次氮基三乙酸基團(tuán)(nta))并且含有卵清蛋白肽，其中卵清蛋白肽封裝于納米載體中。從jt貝克(jtbaker)購買聚乙烯醇(mw＝11kd-31kd，87％-89％部分水解的)。在這個相同實例中，從巴亨美洲公司(柏市街3132號，托倫斯加利福尼亞州90505)獲得卵白蛋白肽323-339(序列：h-ile-ser-gln-ala-val-his-ala-ala-his-ala-glu-ile-asn-glu-ala-gly-arg-nh2，乙酸鹽，批號b06395)，從塞莫迪克斯藥物公司(湯姆馬丁路756號，伯明翰，阿拉巴馬州35211)獲得具有酸端基的pla(100dl2a)；如上文所述制備plga-r848和pla-peg-x結(jié)合物。

使用以上物質(zhì)來制備以下溶液：

1.于二氯甲烷中的100mg/mlpla-r848結(jié)合物，

2.于二氯甲烷中的100mg/mlpla-peg-x，

3.于二氯甲烷中的100mg/mlpla(100dl2a)，

4.于0.13nhcl中的70mg/ml卵白蛋白肽323-339，以及

5.于100mm磷酸鹽緩沖液(ph8)中的50mg/ml聚乙烯醇。

在一個小容器中組合1號溶液(0.50ml)、2號溶液(0.25ml)以及3號溶液(0.25ml)，并且添加于0.13nhcl中的4號溶液(0.1ml)，并且使用一個必能信數(shù)字式超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒。添加5號溶液(2.0ml)到此乳液中，并且使用必能信數(shù)字式超聲波儀250在30％振幅下對第二種乳液進(jìn)行聲處理40秒。然后將這個乳液添加到一個含有70mm磷酸鹽緩沖溶液(ph8)(30ml)的攪拌燒杯中，并且在室溫下攪拌此混合物2小時以形成納米載體。

為了洗滌納米載體，將一部分納米載體分散液(26.5ml)轉(zhuǎn)移到一個50ml離心管中，并且在4℃下在9500rpm(13,800g)下旋轉(zhuǎn)一小時。去除上清液，并且將球粒再懸浮于26.5ml磷酸鹽緩沖生理鹽水中。重復(fù)離心程序，并且將球粒再懸浮于8.3g磷酸鹽緩沖生理鹽水中，以獲得約10mg/ml的含有封裝的卵清蛋白肽的最終納米載體分散液。

制備具有表面peg-x并且不具有封裝的卵清蛋白肽的納米載體

以與上文剛描述過的程序類似的方式制備不具有卵清蛋白肽的納米載體，其中在制備中刪除4號溶液。

實例14：具有獲得的抗原相較于衍生的抗原的納米載體(預(yù)示的)

具有pth的納米載體：如上文實例13中所述制備具有表面peg-conhnh2酰肼基團(tuán)的納米載體。在存在edc的情況下用4-甲?；?苯甲酸經(jīng)由賴氨酸氨基對pth(副甲狀腺素)蛋白質(zhì)進(jìn)行?；?。使用hcl和nhs以產(chǎn)生含有苯甲醛基團(tuán)的pth。在經(jīng)由用一個mwco1k過濾器進(jìn)行透濾而純化后，使修飾過的pth在pbs緩沖液(ph8-9)中與在表面上含有酰肼的nc進(jìn)行結(jié)合。在通過用pbs緩沖液洗滌球粒而純化后，將所得nc-修飾過的pth結(jié)合物懸浮于ph7.4緩沖液中。

具有修飾過的pth的納米載體：如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs。然后將溶解于同一pbs緩沖液中的修飾過的pth添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-修飾過的pth結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合相等份的兩種納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例15：具有來自相同感染物的屬的抗原的單價和二價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的人類a型流感病毒ha蛋白質(zhì)三聚體和ham2e蛋白質(zhì)添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-ha蛋白質(zhì)三聚體/m2e蛋白質(zhì)結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

以相同方式使用單體人類a型流感病毒ha蛋白質(zhì)來制備nc-ha單體蛋白質(zhì)結(jié)合物。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例16：具有來自不同感染物的屬的抗原的單價和二價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的人類a型流感病毒ha蛋白質(zhì)三聚體和ham2e蛋白質(zhì)添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-ha蛋白質(zhì)三聚體/m2e蛋白質(zhì)結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

以相同方式使用失活的感染性鮭魚貧血病毒來制備nc-感染性鮭魚貧血病毒結(jié)合物。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例17：具有來自相同感染物的種的抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將麻疹血球凝集素抗原(含有麻疹血球凝集素免疫顯性區(qū)的重組片段，氨基酸106-114和519-550)溶解于ph6.0緩沖液中，并且然后添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-麻疹血球凝集素結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

以相同方式使用麻疹融合蛋白的片段(對應(yīng)于麻疹大融合蛋白的氨基酸399-525的重組片段)制備nc-麻疹融合抗原結(jié)合物。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例18：具有來自不同感染物的種的抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的人類a型流感病毒ha蛋白質(zhì)三聚體添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-ha蛋白質(zhì)三聚體結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中以供進(jìn)一步測試。

選擇鏈球茵肺炎多糖(pnps)6b作為代表性pnps血清型。將純化過的天然(即沒有純化后減小尺寸)pnps-6b溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的pnps-6b溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文實例13中所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的nc中。震蕩所得nc和pnps-6b懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps-6b結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例19：具有來自相同感染物的株的抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

如下制備在表面上具有peg-x的納米載體。通過如文獻(xiàn)((1)“單分散形狀特定納米生物材料的直接制造與收集(directfabricationandharvestingofmonodisperse，shapespecificnano-biomaterials)”，羅蘭，j.p.(rollandj.p.)；梅諾，b.w.(maynor，b.w.)；尤里斯；l.e.(euliss，l.e.)；?？怂辜{；a.e.(exner，a.e.)；丹尼森，g.m.(denison，g.m.)；德西蒙，j.m(desimone，j.m)，美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)2005，127，10096；(2)“靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的納米顆粒的多價在癌癥療法中的復(fù)合作用(thecomplexroleofmultivalencyinnanoparticlestargetingthetransferrinreceptorforcancertherapies)”；王金(jinwang)，田少敏(shaomintian)，羅比a.彼得斯(robbya.petros)，瑪麗e.納比爾(marye.napier)以及約瑟夫m.德西蒙(josephm.desimone)；美國化學(xué)學(xué)會期刊，2010，132(32)，第11306-11313頁)中所述的在不潤濕模板中的顆粒復(fù)制(print)方法來制備單分散print納米載體(printnc)，這些納米載體包含plga-r848、pla-peg-x(其中x＝羧酸(co2h)、胺(nh2)、c6-疊氮基(c6-n3)或peg3-疊氮基(peg3-n3)、酰肼(conhnh2)、順丁烯二酰亞胺(mal)以及硫醇(sh))并且含有卵清蛋白肽。在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將具有表面peg-co2h基團(tuán)的print-nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的肺炎球菌表面蛋白質(zhì)a(pspa)添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pspa結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

將純化過的天然pnps-6b溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的pnps-6b溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的printnc中。震蕩所得nc和pnps-6b懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps-6b結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例20：具有來自不同感染物的株的抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

將純化過的天然pnps-6b溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的pnps-6b溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文實例13中所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的nc中。震蕩所得nc和pnps-6b懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps-6b結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

將純化過的天然pnps14溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的pnps14溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的printnc中。震蕩所得printnc和pnps14懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得printnc-pnps14結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

如下制備具有表面peg-x(其中x＝羧酸(co2h)、胺(nh2)、疊氮基(n3)、酰肼(conhnh2)以及醛(cho))的金nc。

步驟1.形成金nc(aunc)：在配備有一個冷凝器的一個1l圓底燒瓶中在劇烈攪拌下加熱500ml的1mmhaucl4水溶液到回流，持續(xù)10分鐘。然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm檸檬酸三鈉溶液。保持所得深酒紅色溶液處在回流下25-30分鐘，并且撤消加熱并且將溶液冷卻到室溫。然后經(jīng)由一個0.8μm薄膜過濾器過濾該溶液，以得到aunc溶液。使用可見光譜學(xué)和透射電子顯微術(shù)來表征aunc。aunc具有約20nm直徑，由檸檬酸鹽封端，在520nm處具有峰值吸收。

步驟-2.使用hs-peg-x經(jīng)過peg-x官能化的aunc：如下用hs-peg-x(mw范圍：1500-5000)(其中x＝羧酸(co2h)、胺(nh2)、疊氮基(n3)、酰肼(conhnh2)以及醛(cho))對aunc進(jìn)行官能化。將150μl的hs-peg-x(10μm于10mm碳酸鹽緩沖液(ph9.0)中)的溶液添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽封端的金納米載體(1.16nm)中以產(chǎn)生2500：1的硫醇與金的摩爾比率。在氬氣下在室溫下攪拌混合物1小時以允許硫醇與金納米載體上的檸檬酸鹽完全交換。然后通過在12,000g下離心30分鐘來純化在表面上具有peg-x的aunc。傾析出上清液并且將含有aunc-peg-x的球粒再懸浮于適當(dāng)pbs緩沖液中以供與生物分子進(jìn)行進(jìn)一步生物結(jié)合。將純化過的天然pnps-19f溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的pnps-19f溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的aunc中。震蕩所得aunc和pnps-19f懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得aunc-pnps-19f結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例21：具有相同抗原但不同定向的單價納米載體(預(yù)示的)

如上文所述從衍生自反-3′-羥基甲基煙堿(3-ho-menic)的pla-peg-3-ho-menic共聚物、plga-r848以及卵清蛋白肽制備具有經(jīng)由3′位置連接的表面煙堿類似物的printnc。將所得的含有表面3′取代的煙堿類似物的printnc懸浮于ph7.4緩沖液中。

以類似方式，如上文所述從衍生自1′-丁基煙堿(1-丁基-nic)的pla-peg-1-丁基-nic共聚物、plga-r848以及卵清蛋白肽制備具有經(jīng)由1′位置連接的表面煙堿類似物的printnc。將所得的含有表面1′取代的煙堿類似物的printnc懸浮于ph7.4緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例22：具有相同抗原但不同構(gòu)象的單價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的麻疹病毒血球凝集素套索表位(hne，h379-410，完整二硫化物)添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-hne結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

麻疹病毒的高度保守的血球凝集素套索表位(hne，h379-410)含有三個半胱氨酸殘基，這些殘基中的兩個(cys386和cys394)形成一個二硫橋鍵。使用含于pbs緩沖液中的二硫蘇糖醇(dtt)將含有二硫橋鍵的hne肽還原以得到被還原的hne。如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的nc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后在存在dtt的情況下在氬氣下將溶解于ph6.0緩沖液中的被還原的hne添加到所得nc懸浮液中。在氬氣下在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-被還原的hne結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例23：具有具備不同結(jié)構(gòu)的小分子抗原的單價和二價納米載體(預(yù)示的)

如上文所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的aunc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將aunc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將含于ph6.0緩沖液中的從可商購的4-可鐵寧羧酸(美國專利申請：us2007/0129551a1)制備的反-3′-氨基甲基煙堿添加到活化過的aunc中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得aunc-煙堿結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

如文獻(xiàn)(“通過使用疊氮基-炔點(diǎn)擊化學(xué)的直接結(jié)合而對病毒樣顆粒進(jìn)行表面官能化(surfacefunctionalizationofvirus-likeparticlesbydirectconjugationusingazide-alkyneclickchemistry)”，基達(dá)g.帕特爾(kedarg.patel)和詹姆斯r.斯瓦茲(jamesr.swartz)；生物結(jié)合化學(xué)(bioconjugatechem.)，2011，22(3)，第376-387頁)中所述來制備具有表面官能團(tuán)(如用于cuaac點(diǎn)擊化學(xué)的疊氮基或炔)的vlp。根據(jù)文獻(xiàn)程序來制備含有炔或疊氮基連接物的可卡因類似物以及含有炔或疊氮基連接物的脫氧麻黃堿類似物作為表面b細(xì)胞抗原表位。在標(biāo)準(zhǔn)cuaac條件下用含有表面炔基團(tuán)的vlp來處理具有疊氮基連接物的可卡因類似物與脫氧麻黃堿類似物的等摩爾混合物，以得到vlp-可卡因-脫氧麻黃堿結(jié)合物。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例24：具有具備不同結(jié)構(gòu)的寡糖抗原的二價納米載體(預(yù)示的)

用稀酸或在聲處理下對純化過的pnps-6b進(jìn)行尺寸減小以得到寡聚pnps-6b，將該寡聚pnps-6b溶解于2mnacl中。類似地，用稀酸或在聲處理下對純化過的pnps-3進(jìn)行尺寸減小以得到寡聚pnps-3，將該寡聚pnps-3溶解于2mnacl中。從這些溶液制備寡聚pnps-6b與pnps-3的等摩爾混合溶液。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.5mg/mg)到混合的pnps溶液中。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的寡聚pnps-6b/pnps-3溶液添加到含于ph9緩沖液中的如上文所述制備的具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的aunc中。震蕩所得aunc和活化過的pnps-6b/pnps-3懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得aunc-pnps-6b/3結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將在表面上含有羧酸(co2h)基團(tuán)的vlp活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的vlp球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將這些vlp懸浮于ph6.0緩沖液中。用稀酸或在聲處理下對純化過的pnps-4進(jìn)行尺寸減小以得到寡聚pnps-4，將該寡聚pnps-4溶解于2mnacl中。類似地，用稀酸或在聲處理下對純化過的pnps-19f進(jìn)行尺寸減小以得到寡聚pnps-19f，將該寡聚pnps-19f溶解于2mnacl中。從這些溶液制備寡聚pnps-4與pnps-19f的等摩爾混合溶液。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.5mg/mg)到混合的pnps溶液中。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的混合的pnps-4/19f溶液中?；旌纤萌芤?小時，并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅，并且通過透析來進(jìn)行純化。然后將含于ph6.0緩沖液中的具有adh連接物的純化過的寡聚pnps-4/19f添加到含于ph6.0緩沖液中的活化過的vlp中，并且在4℃下混合所得懸浮液一整夜，并且通過透析或球粒洗滌來進(jìn)行純化，以得到vlp-pnps-4/19f結(jié)合物以供進(jìn)一步測試。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例25：具有具備不同結(jié)構(gòu)的多糖抗原的二價納米載體(預(yù)示的)

將純化過的天然pnps-6b溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的pnps-6b溶液中?；旌纤萌芤?小時，并且通過透析來進(jìn)行純化。將具有adh連接物的純化過的pnps-6b溶解于ph6.0緩沖液中以用于nc結(jié)合。

將純化過的腦膜炎奈瑟菌腦膜炎球菌多糖血清群a(nma)溶解于1mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/nma的比率：1.5mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的nma溶液中。混合所得溶液1-2小時，并且通過透析來進(jìn)行純化。將具有adh連接物的純化過的nma溶解于ph6.0緩沖液中以用于nc結(jié)合。

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的nc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將具有adh連接物的pnps-6b與具有adh連接物的nma于ph6.0緩沖液中的等摩爾混合溶液添加到活化過的nc溶液中，并且在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps6b/nma結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

將純化過的天然pnps-19f溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.0mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的pnps-19f溶液中?；旌纤萌芤?小時，并且通過透析來進(jìn)行純化。將具有adh連接物的純化過的pnps-19f溶解于ph6.0緩沖液中以用于nc結(jié)合。

將純化過的腦膜炎奈瑟菌腦膜炎球菌多糖血清群c(nmc)溶解于1mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/nmc的比率：1.5mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的nmc溶液中?；旌纤萌芤?-2小時，并且通過透析來進(jìn)行純化。將具有adh連接物的純化過的nmc溶解于ph6.0緩沖液中以用于nc結(jié)合。

如上文實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的nc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將具有adh連接物的pnps-19f與具有adh連接物的nmc于ph6.0緩沖液中的等摩爾混合溶液添加到活化過的nc溶液中，并且在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps-19f/nmc結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例26：具有不同定向上的小分子抗原的二價和單價納米載體(預(yù)示的)

如上文實例13中所述制備具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)的納米載體，并且在4℃下將這些納米載體懸浮于ph6.0緩沖液中。根據(jù)一種報道過的程序(“與分裂的腺病毒偶合的可卡因類似物：引起針對上癮藥物的高滴度免疫性的一種疫苗策略(cocaineanalogcoupledtodisruptedadenovirus：avaccinestrategytoevokehigh-titerimmunityagainstaddictivedrugs)”馬丁j?？怂?martinjhicks)等人，分子療法(molther)2011，19：612-619)來制備一種可卡因類似物gnc(6-(2r，3s)-3-(苯甲酰氧基)-8-甲基-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-2-羰氧基-己酸)。用含于dmf中的edc/nhs活化這種化合物，并且分離活化過的gnc-nhs酯并且進(jìn)行純化以用于nc結(jié)合。根據(jù)一種報道過的程序(“半抗原中的位置連接物對可卡因免疫藥物療法的作用(positionallinkereffectsinhaptensforcocaineimmunopharmacotherapy)”，阿基拉伊諾(akiraino)，托賓j.迪克森(tobinj.dickerson)以及金姆d.簡達(dá)(kimd.janda)；生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)17(2007)4280-4283)來制備另一種可卡因類似物ai1，并且用如上edc/nhs進(jìn)行活化。將與nc表面peg-酰肼相比過量的等摩爾部分的每一種活化過的可卡因類似物與含于ph6.0緩沖液中的nc進(jìn)行混合。在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-gnc/ai1可卡因結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

用丁二酸酐處理去甲可卡因(norcocaine)以得到含有丁二酸連接物的可卡因snc，并且然后根據(jù)一種報道過的程序(福克斯bs(foxbs)，坎塔克km(kantakkm)，愛德華ma(edwardsma)等人，治療性可卡因疫苗在嚙齒動物模型中的功效(efficacyofatherapeuticcocainevaccineinrodentmodels)，自然醫(yī)學(xué)(nat.med.)2(10)，1129-1132(1996))用edc/nhs進(jìn)行活化。如上文實例13中所述制備具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)的nc，并且在4℃下將這些nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將過量的活化過的可卡因類似物snc添加到nc中。在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-snc可卡因結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例27：具有具備不同附著物的肽抗原的二價和單價納米載體(預(yù)示的)

根據(jù)實例13制備具有表面peg-疊氮基(peg-n3)的納米載體，并且將這些納米載體懸浮于用氬氣脫氣過的ph7緩沖液中。通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法來制備具有c端炔丙酰胺基(c-炔基團(tuán))的卵白蛋白(325-336)肽，并且在氬氣下將所得純化過的卵(325-336)-c-炔肽溶解于ph7緩沖液中。通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法來制備具有用5-己炔酸進(jìn)行?；^的n端胺(n端炔基團(tuán))的卵白蛋白(325-336)肽，并且在氬氣下將所得純化過的卵(325-336)-n-炔肽溶解于ph7緩沖液中。在氬氣下將具有表面peg-n3的nc與等摩爾量的每一種卵-c-炔和n-炔肽混合于ph7緩沖液中，并且使所得懸浮液根據(jù)一種報道過的方案(“銅催化的疊氮基-炔環(huán)加成反應(yīng)在生物結(jié)合中的分析與最佳化(analysisandoptimizationofcopper-catalyzedazide-alkynecycloadditionforbioconjugation)”，弘v(hongv)，普瑞蘇爾斯基si(presolskisi)，馬c(mac)，芬恩mg.(finnmg.)；德國應(yīng)用化學(xué)(angewchemintedengl)，2009；48(52)：9879-83)來進(jìn)行cuaac點(diǎn)擊反應(yīng)。通過用ph7緩沖液進(jìn)行球粒洗滌來純化所得nc-卵清蛋白肽-c-鍵聯(lián)的/卵清蛋白肽-n-鍵聯(lián)的結(jié)合物，并且懸浮于ph7緩沖液中。

根據(jù)一種標(biāo)準(zhǔn)程序制備重組病毒樣顆粒(vlp)。具體地說，如馬修皮西(matthewpeacey)等人((1)皮西m(peaceym)，威爾遜s(wilsons)，貝爾德ma(bairdma)，華德vk(wardvk)，“通用rhdv病毒樣顆粒：通過基因修飾和化學(xué)結(jié)合來合并抗原(versatilerhdvvirus-likeparticles：incorporationofantigensbygeneticmodificationandchemicalconjugation)”生物技術(shù)與生物工程(biotechnolbioeng)；2007；98∶968-77；(2)皮西m，威爾遜s，佩雷特r(perretr)，龍凱塞f(ronchesef)，華德vk，楊v(youngv)，楊s(youngs)，貝爾德ma，“來自兔出血性疾病病毒的病毒樣顆?？梢哉T導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答(virus-likeparticlesfromrabbithemorrhagicdiseaseviruscaninduceananti-tumorresponse)”疫苗(vaccine)；2008；26：5334-5337)所述，制備來自兔出血性疾病病毒的vlp，并且經(jīng)由如4-(n-順丁烯二酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-甲酸磺基丁二酰亞胺基酯(磺基-smcc)的異質(zhì)雙官能連接物將這些vlp與卵(323-339)肽進(jìn)行結(jié)合。純化所得vlp-卵清蛋白肽結(jié)合物并且懸浮于ph7緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例28：具有在蛋白質(zhì)上的不同附著點(diǎn)(活化的相較于蛋白質(zhì)標(biāo)簽)處偶合的蛋白質(zhì)抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

如實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。然后將溶解于ph6.0緩沖液中的麻疹血球凝集素蛋白質(zhì)(mhp)添加到所得nc懸浮液中。在4℃下允許結(jié)合進(jìn)行一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-mhp結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

如實例13中所述制備具有表面peg-nta基團(tuán)的納米載體用于ni-his標(biāo)簽復(fù)合。然后用nicl2于結(jié)合緩沖液(50mm磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，300mmnacl，10mm咪唑，ph8.0)中的溶液處理nc以形成具有表面nta-ni復(fù)合物的nc。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，在氬氣下將所得nc懸浮于結(jié)合緩沖液中。將加了his6標(biāo)簽的重組麻疹血球凝集素蛋白質(zhì)于結(jié)合緩沖液中的溶液添加到nc懸浮液中，并且在氬氣下在4℃下培育懸浮液一整夜。用ph7緩沖液洗滌所得nc-nta-his6-mhp結(jié)合物球粒，并且懸浮于pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例29：具有在不同附著點(diǎn)(活化羥基相較于連接物)處偶合的寡糖抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

如實例13中所述制備具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的納米載體，并且在氬氣下將這些納米載體懸浮于ph9緩沖液中。用稀酸或在聲處理下對純化過的pnps-6b進(jìn)行尺寸減小以得到寡聚pnps-6b，將寡聚pnps-6b溶解于2mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/pnps的比率：1.5mg/mg)到pnps-6b溶液中。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將所得活化過的寡聚pnps-6b溶液添加到具有表面peg-conhnh2(peg-酰肼)基團(tuán)的nc中。震蕩所得nc和活化過的pnps-6b懸浮液1小時并且用2m甘氨酸溶液進(jìn)行淬滅。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-pnps-6b結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

如實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的納米載體。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。根據(jù)一種報道過的方法(“合成的6b二糖、三糖以及四糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物含有肺炎球菌6a和6b型共同和6b特異性表位，在小鼠中引出保護(hù)性抗體(synthetic6bdi-，tri-，andtetrasaccharide-proteinconjugatescontainpneumococcaltype6aand6bcommonand6b-specificepitopesthatelicitprotectiveantibodiesinmice)”，詹森wtm(jansenwtm)等人，感染與免疫(infectimmun)，2001；69(2)：787-793)來制備具有3-氨基丙基連接物的寡pnps-6b。將含于ph6緩沖液中的寡聚pnps-6b-3-丙胺添加到活化過的nc中。在氬氣下在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將nc-pnps-6b結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

實例30：具有在多糖上的不同附著點(diǎn)處偶合的多糖抗原的單價納米載體(預(yù)示的)

經(jīng)由用cdap活化過的羥基將nma在多個附著點(diǎn)處連接到nc上。將純化過的腦膜炎奈瑟茵腦膜炎球菌多糖血清群a(nma)溶解于1mnacl中。添加四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶(cdap)于ch3cn(100mg/ml)中的溶液(cdap/nma的比率：1.5mg/mg)。用0.2met3n水溶液或naoh溶液稀釋液將所得溶液的ph調(diào)節(jié)到9。在3-4分鐘之后，將己二酸二酰肼(adh)連接物于ph9緩沖液中的溶液添加到活化過的nma溶液中?；旌纤萌芤?-2小時，并且通過透析來進(jìn)行純化。將具有adh連接物的純化過的nma溶解于ph6.0緩沖液中以用于nc結(jié)合。

如實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的nc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。將具有adh連接物的nma于ph6.0緩沖液中的溶液添加到活化過的nc溶液中，并且在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-nma結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

經(jīng)由末端氨基將nma連接到nc上。如實例13中所述制備具有表面peg-co2h基團(tuán)的nc。然后在4℃下用含于ph6pbs緩沖液中的過量edc/nhs將nc活化1-2小時。然后用ph6.0緩沖液洗滌活化過的nc球粒以去除未反應(yīng)的edc/nhs，并且將nc懸浮于ph6.0緩沖液中。根據(jù)一種報道過的程序(“針對a和c型腦膜炎球菌的一種結(jié)合物疫苗的開發(fā)與1期臨床測試(developmentandphase1clinicaltestingofaconjugatevaccineagainstmeningococcusaandc)”，科斯坦蒂諾p(costantinop)，維蒂s(vitis)，迫達(dá)a(poddaa)，威爾蒙特ma(velmontema)，能喬尼l(nencionil)，拉波利r(rappuolir)，疫苗(vaccine)1992；10(10)：691-8)用含于ph7緩沖液中的nh4cl和氰基硼氫化鈉(nacnbh3)對純化過的nma進(jìn)行還原胺化以得到氨基-nma。然后將氨基-nma添加到活化過的nc懸浮液中，并且在4℃下混合所得懸浮液一整夜。在用pbs緩沖液洗滌球粒后，將所得nc-nma結(jié)合物懸浮于ph7.4pbs緩沖液中。

然后可以組合這些納米載體以形成nc懸浮液以供進(jìn)一步測試。

本發(fā)明還涉及以下實施方案：

1.一種組合物，包含：

一個劑型，包含：

一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；

一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及

一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

2.如實施方案1所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。

3.如實施方案1或2所述的組合物，其中該第二組表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。

4.如實施方案1-3中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性屬獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性屬獲得或衍生的抗原。

5.如實施方案4所述的組合物，其中該第一感染性屬與該第二感染性屬相同。

6.如實施方案1-5中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性種獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性種獲得或衍生的抗原。

7.如實施方案6所述的組合物，其中該第一感染性種與該第二感染性種相同。

8.如實施方案1-7中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性病毒株獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性病毒株獲得或衍生的抗原。

9.如實施方案8所述的組合物，其中該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株相同。

10.如實施方案1-9中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下科的病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒科、細(xì)小核糖核酸病毒科、皰疹病毒科、嗜肝dna病毒科、黃病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭瘤病毒科、彈狀病毒科、披膜病毒科或細(xì)小病毒科。

11.如實施方案10所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒、柯薩奇病毒、a型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、埃-巴二氏病毒、人類巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒、b型肝炎病毒、c型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西方尼耳病毒、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、人類偏肺病毒、人類乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風(fēng)疹病毒、人類博卡病毒或細(xì)小病毒b19。

12.如實施方案11所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：vi、vii、e1a、e3-19k、52k、vp1、表面抗原、3a蛋白質(zhì)、衣殼蛋白、核衣殼、表面突出物、跨膜蛋白、ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、早期抗原、衣殼抗原、pp65、gb、p52、潛伏的核抗原-1、ns3、包膜蛋白、包膜蛋白e2結(jié)構(gòu)域、gp120、p24、脂肽gag(17-35)、gag(253-284)、nef(66-97)、nef(116-145)、pol(325-355)、神經(jīng)氨酸酶、核衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶、糖蛋白、e6、e7、包膜脂蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(ns)。

13.如實施方案1-9中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下屬的細(xì)菌獲得或衍生的抗原：博德特氏茵屬、疏螺旋體屬、布魯氏茵屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬和披衣茵屬、梭茵屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬、弗朗西斯氏茵屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、鉤端螺旋體屬、李斯特茵屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟茵屬、假單胞茵屬、立克次體屬、沙門氏茵屬、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬弧茵屬或耶爾森氏茵屬。

14.如實施方案13所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳桿菌、伯氏疏螺旋茵、牛布魯氏菌、狗布魯氏茵、羊布魯氏菌、豬布魯氏菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡披衣菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、白喉棒狀桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希氏桿菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團(tuán)桿菌、問號鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特茵、麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟茵、綠膿假單胞菌、立氏立克次體、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌或鼠疫耶爾森氏菌。

15.如實施方案14所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳毒素(pt)、絲狀血球凝集素(fha)、百日咳粘附素(prn)、菌毛(fim2/3)、vlse；dbpa、ospa、hia、prpa、mlta、l7/l12、d15、0187、virj、mdh、afua、l7/l12、外膜蛋白、lps、a型抗原、b型抗原、c型抗原、d型抗原、e型抗原、fiic、flid、cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氫鹽-醛縮酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)、延伸因子-g(ef-g)、假定蛋白(hp)、t毒素、類毒素抗原、莢膜多糖、蛋白質(zhì)d、mip、核蛋白(np)、rd1、pe35、ppe68、esxa、esxb、rd9、esxv、hsp70、脂多糖、表面抗原、sp1、sp2、sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引導(dǎo)蛋白質(zhì)、莢膜蛋白質(zhì)(f1)或v蛋白質(zhì)。

16.如實施方案1-9中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下真菌獲得或衍生的抗原：念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、組織胞漿菌屬、肺囊蟲屬或葡萄穗霉菌屬。

17.如實施方案16所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：白色念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、新型隱球菌、羅氏隱球菌、淺白隱球菌、加特隱球菌、莢膜組織胞漿菌、伊氏肺囊蟲或黑葡萄穗霉。

18.如實施方案17所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：表面抗原、莢膜糖蛋白、yps3p、hsp60、主要表面蛋白質(zhì)、msgc1、msgc3、msgc8、msgc9或schs34。

19.如實施方案1-3中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含從一種濫用的或上癮的物質(zhì)獲得或衍生的抗原。

20.如實施方案19所述的組合物，其中該濫用的或上癮的物質(zhì)是可卡因或煙堿。

21.如實施方案1-20中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含相同的表面抗原，并且其中該第一組表面抗原的至少一種抗原所呈現(xiàn)的定向與該第二組表面抗原中所呈現(xiàn)的不同。

22.如實施方案1-20中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原包含相同的表面抗原，并且其中該第一組表面抗原的至少一種抗原所呈現(xiàn)的構(gòu)象與該第二組表面抗原中所呈現(xiàn)的不同。

23.如實施方案1-20中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原的分子結(jié)構(gòu)與該第二組表面抗原的不同。

24.如實施方案1-23中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

25.如實施方案1-24中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含表面抗原，這些表面抗原包含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子。

26.如實施方案25所述的組合物，其中該第一組表面抗原的至少一種表面抗原和/或該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

27.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含肽的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

28.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含肽的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

29.如實施方案28所述的組合物，其中該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

30.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

31.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含蛋白質(zhì)的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

32.如實施方案31所述的組合物，其中該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

33.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

34.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含寡糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

35.如實施方案34所述的組合物，其中該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

36.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

37.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含多糖的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

38.如實施方案37所述的組合物，其中該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

39.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含分子量小于10,000da的表面抗原。

40.如實施方案24-26中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含含小分子的表面抗原，并且該第二組表面抗原包含含肽、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖和/或小分子的表面抗原。

41.如實施方案40所述的組合物，其中該第二組表面抗原的至少一種表面抗原的分子量小于10,000da。

42.如實施方案1-41中任何一項所述的組合物，另外包含一種或多種佐劑。

43.如實施方案42所述的組合物，其中該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到這些合成納米載體上的佐劑。

44.如實施方案42或43所述的組合物，其中該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到這些合成納米載體上的佐劑并且該組合物包含一種或多種混合的佐劑。

45.如實施方案42-44中任何一項所述的組合物，其中該一種或多種佐劑各自包含礦物鹽、明礬、與腸細(xì)菌的單磷酰脂質(zhì)(mpl)a、(as04)組合的明礬、as15、皂甙、qs-21、quil-a、iscoms、iscomatrix^tm、mf59^tm、isa51、isa720、as02、脂質(zhì)體或脂質(zhì)體配制品、as01、as15、合成的或特別制備的微粒和微載體、淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的衍生自細(xì)菌的外膜泡、殼聚糖顆粒、貯存形成劑、嵌段共聚物、特異性修飾或制備的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、rc529、細(xì)菌類毒素、毒素片段、toll樣受體2、3、4、5、7、8或9的激動劑、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性dna、免疫刺激性rna、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、1，2-橋接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、針對dc表面分子cd40的激動劑、類型i干擾素、聚i：c、細(xì)菌性脂多糖(lps)、vsv-g、hmgb-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含cpg的免疫刺激性dna分子、從壞死細(xì)胞釋放的促發(fā)炎刺激物、尿酸鹽晶體、補(bǔ)體級聯(lián)的活化組分、免疫復(fù)合物的活化組分、補(bǔ)體受體激動劑、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體激動劑。

46.如實施方案43-45中任何一項所述的組合物，其中這些佐劑是不同的。

47.如實施方案43-46中任何一項所述的組合物，其中該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含tlr-2、-3、-4、-7、-8或-9激動劑。

48.如實施方案47所述的組合物，其中該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、mpl、咪喹莫特或瑞喹莫德。

49.如實施方案44-48中任何一項所述的組合物，其中該混合的佐劑是包含cpg的免疫刺激性核酸、as01、as02、as04、as15、qs-21、皂甙、明礬或mpl。

50.如實施方案1-49中任何一項所述的組合物，其中該第一和該第二群合成納米載體的存在量有效在一位受試者中對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。

51.如實施方案50所述的組合物，其中該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

52.如實施方案1-51中任何一項所述的組合物，另外包含一種或多種另外的群的合成納米載體，其中各另外的群的合成納米載體包含一組表面抗原，該組表面抗原在結(jié)構(gòu)上與該組合物中的其他組表面抗原不同。

53.如實施方案52所述的組合物，其中該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個另外包含一種偶合到其上的佐劑。

54.如實施方案53所述的組合物，其中該偶合到該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個上的佐劑與該組合物中的其他佐劑不同。

55.如實施方案1-54中任何一項所述的組合物，其中各組表面抗原是單價或低價組的表面抗原。

56.如實施方案52-55中任何一項所述的組合物，其中這些群的合成納米載體的存在量有效對各組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。

57.如實施方案56所述的組合物，其中該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對各組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

58.如實施方案1-57中任何一項所述的組合物，其中該第一和/或該第二群的合成納米載體另外包含一種偶合到其上的通用的t細(xì)胞抗原。

59.如實施方案58所述的組合物，其中該通用的t細(xì)胞抗原包含一種t輔助細(xì)胞抗原。

60.如實施方案59所述的組合物，其中該t-輔助細(xì)胞抗原包含一種從卵白蛋白獲得或衍生的肽。

61.如實施方案60所述的組合物，其中該從卵白蛋白獲得或衍生的肽包含如seqidno：1中所闡明的序列。

62.如實施方案58-61中任何一項所述的組合物，其中該通用的t細(xì)胞抗原通過封裝來偶合。

63.一種組合物，包含：

一個劑型，包含：

一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；

一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及

一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

64.如實施方案63所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。

65.如實施方案63或64所述的組合物，其中該第二組表面抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種類型的抗原。

66.如實施方案63-65中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性屬獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性屬獲得或衍生的抗原。

67.如實施方案66所述的組合物，其中該第一感染性屬與該第二感染性屬相同。

68.如實施方案63-67中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性種獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性種獲得或衍生的抗原。

69.如實施方案68所述的組合物，其中該第一感染性種與該第二感染性種相同。

70.如實施方案63-69中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原包含從第一感染性病毒株獲得或衍生的抗原，并且該第二組表面抗原包含從第二感染性病毒株獲得或衍生的抗原。

71.如實施方案70所述的組合物，其中該第一感染性病毒株與該第二感染性病毒株相同。

72.如實施方案63-71中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下科的病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒科、細(xì)小核糖核酸病毒科、皰疹病毒科、嗜肝dna病毒科、黃病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳頭瘤病毒科、彈狀病毒科、披膜病毒科或細(xì)小病毒科。

73.如實施方案72所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下病毒獲得或衍生的抗原：腺病毒、柯薩奇病毒、a型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、埃-巴二氏病毒、人類巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒、b型肝炎病毒、c型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西方尼耳病毒、hiv、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、人類偏肺病毒、人類乳頭瘤病毒、狂犬病病毒、風(fēng)疹病毒、人類博卡病毒或細(xì)小病毒b19。

74.如實施方案73所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：vi、vii、e1a、e3-19k、52k、vp1、表面抗原、3a蛋白質(zhì)、衣殼蛋白、核衣殼、表面突出物、跨膜蛋白、ul6、ul18、ul35、ul38、ul19、早期抗原、衣殼抗原、pp65、gb、p52、潛伏的核抗原-1、ns3、包膜蛋白、包膜蛋白e2結(jié)構(gòu)域、gp120、p24、脂肽gag(17-35)、gag(253-284)、nef(66-97)、nef(116-145)、pol(325-355)、神經(jīng)氨酸酶、核衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白、磷蛋白、融合蛋白、血球凝集素、血球凝集素-神經(jīng)氨酸酶、糖蛋白、e6、e7、包膜脂蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(ns)。

75.如實施方案63-71中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下屬的細(xì)菌獲得或衍生的抗原：博德特氏菌屬、疏螺旋體屬、布魯氏菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬和披衣菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、鉤端螺旋體屬、李斯特菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟菌屬、假單胞菌屬、立克次體屬、沙門氏菌屬、志賀氏桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬弧菌屬或耶爾森氏菌屬。

76.如實施方案75所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳桿菌、伯氏疏螺旋菌、牛布魯氏菌、狗布魯氏菌、羊布魯氏菌、豬布魯氏菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡披衣菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、白喉棒狀桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希氏桿菌、土拉弗朗西斯氏菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團(tuán)桿菌、問號鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、綠膿假單胞菌、立氏立克次體、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、蒼白密螺旋體、霍亂弧菌或鼠疫耶爾森氏菌。

77.如實施方案76所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：百日咳毒素(pt)、絲狀血球凝集素(fha)、百日咳粘附素(prn)、菌毛(fim2/3)、vlse；dbpa、ospa、hia、prpa、mlta、l7/l12、d15、0187、virj、mdh、afua、l7/l12、外膜蛋白、lps、a型抗原、b型抗原、c型抗原、d型抗原、e型抗原、flic、flid、cwp84、α-毒素、θ-毒素、果糖1，6-磷酸氫鹽-醛縮酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)、丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)、延伸因子-g(ef-g)、假定蛋白(hp)、t毒素、類毒素抗原、莢膜多糖、蛋白質(zhì)d、mip、核蛋白(np)、rd1、pe35、ppe68、esxa、esxb、rd9、esxv、hsp70、脂多糖、表面抗原、sp1、sp2、sp3、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜蛋白、陪伴-引導(dǎo)蛋白質(zhì)、莢膜蛋白質(zhì)(f1)或v蛋白質(zhì)。

78.如實施方案63-71中任何一項所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下真菌獲得或衍生的抗原：念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、組織胞漿菌屬、肺囊蟲屬或葡萄穗霉菌屬。

79.如實施方案78所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：白色念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、新型隱球菌、羅氏隱球菌、淺白隱球菌、加特隱球菌、莢膜組織胞漿菌、伊氏肺囊蟲或黑葡萄穗霉。

80.如實施方案79所述的組合物，其中該第一組表面抗原和/或該第二組表面抗原包含從以下獲得或衍生的抗原：表面抗原、莢膜糖蛋白、yps3p、hsp60、主要表面蛋白質(zhì)、msgc1、msgc3、msgc8、msgc9或schs34。

81.如實施方案63-80中任何一項所述的組合物，另外包含一種或多種佐劑。

82.如實施方案81所述的組合物，其中該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到該合成納米載體上的佐劑。

83.如實施方案81或82所述的組合物，其中該第一群合成納米載體和/或該第二群合成納米載體另外包含一種偶合到該合成納米載體上的佐劑并且該組合物包含一種或多種混合的佐劑。

84.如實施方案81-83中任何一項所述的組合物，其中該一種或多種佐劑各自包含礦物鹽、明礬、與腸細(xì)菌的單磷酰脂質(zhì)(mpl)a、(as04)組合的明礬、as15、皂甙、qs-21、quil-a、iscoms、iscomatrix^tm、mf59^tm、isa51、isa720、as02、脂質(zhì)體或脂質(zhì)體配制品、as01、合成的或具體制備的微粒和微載體、淋病奈瑟茵或沙眼衣原體的衍生自細(xì)菌的外膜泡、殼聚糖顆粒、貯存形成劑、嵌段共聚物、特異性修飾或制備的肽、胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、rc529、細(xì)菌類毒素、毒素片段、toll樣受體2、3、4、5、7、8或9的激動劑、腺嘌呤衍生物、免疫刺激性dna、免疫刺激性rna、咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、1，2-橋接咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、瑞喹莫德、針對dc表面分子cd40的激動劑、類型i干擾素、聚i：c、細(xì)菌性脂多糖(lps)、vsv-g、hmgb-1、鞭毛蛋白或其部分或衍生物、包含cpg的免疫刺激性dna分子、從壞死細(xì)胞釋放的促發(fā)炎刺激物、尿酸鹽晶體、補(bǔ)體級聯(lián)的活化組分、免疫復(fù)合物的活化組分、補(bǔ)體受體激動劑、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體激動劑。

85.如實施方案82-84中任何一項所述的組合物，其中這些佐劑是不同的。

86.如實施方案82-85中任何一項所述的組合物，其中該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含一種tlr-2、-3、-4、-7、-8或-9激動劑。

87.如實施方案86所述的組合物，其中該偶合到該第一群合成納米載體上的佐劑和/或該偶合到該第二群合成納米載體上的佐劑包含免疫刺激性核酸、咪唑并喹啉、氧代腺嘌呤、mpl、咪喹莫特或瑞喹莫德。

88.如實施方案83-87中任何一項所述的組合物，其中該混合的佐劑是包含cpg的免疫刺激性核酸、as01、as02、as04、as15、qs-21、皂甙、明礬或mpl。

89.如實施方案63-88中任何一項所述的組合物，其中該第一和該第二群合成納米載體的存在量有效在一位受試者中對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。

90.如實施方案89所述的組合物，其中該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對該第一組表面抗原和該第二組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

91.如實施方案63-90中任何一項所述的組合物，另外包含一種或多種另外的群的合成納米載體，其中各另外的群的合成納米載體包含一組表面抗原，該組表面抗原在免疫上與該組合物中的其他組表面抗原不同。

92.如實施方案91所述的組合物，其中該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個另外包含一種偶合到其上的佐劑。

93.如實施方案92所述的組合物，其中該偶合到該一個或多個另外的群的合成納米載體中的至少一個上的佐劑與該組合物中的其他佐劑不同。

94.如實施方案63-93中任何一項所述的組合物，其中各組表面抗原是單價或低價組的表面抗原。

95.如實施方案91-94中任何一項所述的組合物，其中這些群的合成納米載體的存在量有效對各組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。

96.如實施方案95所述的組合物，其中該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對各組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

97.如實施方案63-96中任何一項所述的組合物，其中該第一和/或該第二群的合成納米載體另外包含一種偶合到其上的通用的t細(xì)胞抗原。

98.如實施方案97所述的組合物，其中該通用的t細(xì)胞抗原包含一種t輔助細(xì)胞抗原。

99.如實施方案98所述的組合物，其中該t-輔助細(xì)胞抗原包含一種從卵白蛋白獲得或衍生的肽。

100.如實施方案99所述的組合物，其中該從卵白蛋白獲得或衍生的肽包含如seqidno：1中所闡明的序列。

101.如實施方案97-100中任何一項所述的組合物，其中該通用的t細(xì)胞抗原通過封裝來偶合。

102.如實施方案1-101中任何一項所述的組合物，其中該藥物學(xué)上可接受的賦形劑包含防腐劑、緩沖劑、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、著色劑或穩(wěn)定劑。

103.如實施方案1-102中任何一項所述的組合物，其中各合成納米載體的群的合成納米載體包含基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹狀聚合物、巴克球(buckyball)、納米線、病毒樣顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物納米顆粒、球狀納米顆粒、立方形納米顆粒、金字塔形納米顆粒、長方形納米顆粒、圓柱形納米顆?；颦h(huán)形納米顆粒。

104.如實施方案103所述的組合物，其中各合成納米載體的群包含一種或多種聚合物。

105.如實施方案104所述的組合物，其中該一種或多種聚合物包含一種聚酯。

106.如實施方案104或105所述的組合物，其中該一種或多種聚合物包含或另外包含一種偶合到親水聚合物上的聚酯。

107.如實施方案105或106所述的組合物，其中該聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚己內(nèi)酯。

108.如實施方案106或107所述的組合物，其中該親水聚合物包含一種聚醚。

109.如實施方案108所述的組合物，其中該聚醚包含聚乙二醇。

110.一種組合物，包含：

一個劑型，包含：

一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；

一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及

一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

111.如實施方案110所述的組合物，其中：

該第一組表面抗原包含第一組單價或低價的表面抗原；以及

該第二組表面抗原包含第二組單價或低價的表面抗原。

112.一種組合物，包含：

一個劑型，包含：

一個用于呈現(xiàn)第一組表面抗原的第一合成納米載體裝置；

一個用于呈現(xiàn)第二組表面抗原的第二合成納米載體裝置；以及

一種藥物學(xué)上可接受的賦形劑；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

113.如實施方案112所述的組合物，其中：

該第一組表面抗原包含第一組單價或低價的表面抗原；以及

該第二組表面抗原包含第二組單價或低價的表面抗原。

114.一種方法，包括：

給予一位受試者如實施方案1-113中任何一項所述的組合物。

115.如實施方案114所述的方法，其中該受試者罹患或有風(fēng)險罹患一種感染或感染性疾病。

116.如實施方案114所述的方法，其中該受試者罹患或有風(fēng)險罹患癌癥。

117.如實施方案114所述的方法，其中該受試者罹患或有風(fēng)險罹患一種成癮。

118.如實施方案114-117中任何一項所述的方法，其中該組合物通過經(jīng)口、皮下、經(jīng)肺、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予來給藥。

119.一種方法，包括：

制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；

制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及

將該第一和該第二群的合成納米載體組合于一個劑型中；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

120.一種方法，包括：

制備一個第一群包含第一組表面抗原的合成納米載體；

制備一個第二群包含第二組表面抗原的合成納米載體；以及

將該第一和該第二群的合成納米載體組合于一個劑型中；

其中該第一組表面抗原和該第二組表面抗原在免疫上不同。

121.如實施方案119或120所述的方法，另外包括給予一位受試者該劑型。

122.如實施方案121所述的方法，另外包括確定是否對各組表面抗原產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答。

123.如實施方案122所述的方法，其中該免疫應(yīng)答是產(chǎn)生對各組表面抗原具有特異性的抗體滴度。

124.如實施方案121-123中任何一項所述的方法，另外包括確定有效對各組表面抗原產(chǎn)生該免疫應(yīng)答的量。

125.一種用于制造組合物的劑型的方法，該方法包括如實施方案119-124中任何一項中所定義的方法步驟。

126.如實施方案1-113中任何一項所述的組合物，用于治療或預(yù)防中。

127.如實施方案1-113中任何一項所述的組合物，用于如實施方案114-118和/或121-124中任何一項中所定義的方法中。

128.如實施方案1-113中任何一項所述的組合物，用于治療或預(yù)防感染或感染性疾病的方法中。

129.如實施方案1-113中任何一項所述的組合物，用于治療或預(yù)防癌癥的方法中。

130.如實施方案1-113中任何一項所述的組合物，用于治療或預(yù)防成癮的方法中。

131.如實施方案128-130中任何一項所述的組合物，其中該方法包括通過經(jīng)口、皮下、經(jīng)肺、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予來給予該組合物。

132.一種如實施方案1-113中任何一項所述的組合物的用途，用于制造供在如實施方案114-118、121-124或128-131中任何一項中所定義的方法中使用的藥劑。

序列表

<110>西萊克塔生物科技公司

<120>多價的合成納米載體疫苗

<130>s1681.70014wo00

<150>us61/348,713

<151>2010-05-26

<150>us61/348,717

<151>2010-05-26

<150>us61/348,728

<151>2010-05-26

<150>us61/358,635

<151>2010-06-25

<160>1

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>原雞

<400>1

ileserglnalavalhisalaalahisalagluileasnglualagly

151015

arg