以苯硼酸酯為連接單元的嵌段聚合物及其合成方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)、納米醫(yī)藥及新材料領(lǐng)域，具體涉及以苯硼酸酯為連接 單元的兩嵌段聚合物的合成及其組裝及應(yīng)用于制備對(duì)肝癌細(xì)胞具有增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞特性的 智能納米膠束載體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)化療藥物在腫瘤的治療上取得很大成功，但有很多局限性限制了其臨床療效 的進(jìn)一步提高，如嚴(yán)重的毒副作用、選擇性差、腫瘤細(xì)胞易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性等。納米藥物載 體為實(shí)現(xiàn)化療藥物在腫瘤組織內(nèi)的定點(diǎn)和快速釋放，減少對(duì)正常組織器官的損傷，避免有 效藥物劑量不足導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性提供了一個(gè)有效途徑。智能納米藥物載體系統(tǒng)主 要是基于腫瘤組織與人體正常組織的微環(huán)境差異，如腫瘤組織具有乏氧、酸性pH值、溫度 稍高、有大量生長因子及水解蛋白酶等特點(diǎn)。利用實(shí)體瘤的高滲透和長滯留效應(yīng)（EPR效 應(yīng)），可使納米載體藥物在腫瘤組織富集，在腫瘤微環(huán)境作用下快速解體，迅速釋放出抗腫 瘤藥物"殺死"腫瘤細(xì)胞。
[0003] 苯硼酸與順式1，2-或1，3-二羥基化合物（如糖類、兒茶酚等）可形成硼酸酯鍵。 硼酸酯鍵在堿性和中性環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境發(fā)生裂解，證實(shí)了硼酸酯鍵非常適合 作為酸敏感的納米藥物載體構(gòu)筑單元。PavelA.Levkin教授用苯硼酸修飾葡聚糖得到兩親 性的聚合物B-Dex。B-Dex自組裝形成的納米粒在pH5. 0的酸性介質(zhì)中的藥物釋放速度是 在pH7. 4的介質(zhì)中的藥物釋放速度的5倍，顯示了非常好的酸敏感藥物釋放特性（Biomater ials，2013, 34, 8504-8510)。鐘振林教授課題組發(fā)現(xiàn)苯硼酸共價(jià)修飾聚乙烯亞胺后對(duì)Η印G2 細(xì)胞有更高的基因轉(zhuǎn)染效率，原因之一在于苯硼酸與HepG2細(xì)胞膜表面的寡聚糖（Sialyl LewisX)強(qiáng)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，基因載體系統(tǒng)更容易進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)生轉(zhuǎn)染 (ChemicalCommunication, 2010, 46, 5888-5890)，證實(shí)了苯硼酸可作為藥物載體系統(tǒng)的革巴 向基團(tuán)的潛力。
[0004] 傳統(tǒng)的嵌段聚合物構(gòu)筑的載藥膠束通常以聚乙二醇（PEG)作為親水鏈段，可充分 利用實(shí)體瘤的高滲透和長滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)），使藥物富集在腫瘤組織，但該類膠束由于 PEG殼層的存在不利于細(xì)胞內(nèi)吞，抗腫瘤藥物難以足劑量到達(dá)位于細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)，此類 膠束的細(xì)胞內(nèi)吞通常是將PEG端用葉酸、半乳糖等靶向基團(tuán)或抗體修飾來實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的 細(xì)胞內(nèi)吞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩 嵌段聚合物，以該兩嵌段聚合物構(gòu)筑的載藥膠束不僅在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長效循環(huán)，在腫瘤部位累 積后可脫去PEG殼層，避免PEG阻礙細(xì)胞內(nèi)吞的同時(shí)，露出的苯硼酸鍵可以增強(qiáng)其介導(dǎo)的 細(xì)胞內(nèi)吞過程，因此，本發(fā)明膠束的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)"長效循環(huán)、增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞"的新途徑。本發(fā) 明制備的兩嵌段聚合物可以用于構(gòu)筑納米膠束，具有較好的釋藥性，較低的細(xì)胞毒性和良 好的細(xì)胞吞噬性。
[0006] 本發(fā)明提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，其特征在于，所述兩 嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)式如式（I)所示，
[0008] 式（I)中：
[0009] X= 40-120
[0010] m=5-20〇
[0011] 其中，PEG的結(jié)構(gòu)式如式（1)所示：
[0012]
[0013] 其中，BC的結(jié)構(gòu)式如式（2)所示：
[0014]
[0015] 其中，PBLG的結(jié)構(gòu)式如式（3)所示：
[0016]
[0017] 本發(fā)明還提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的合成方法：其特征 在于，所述方法包括以下步驟：（1)合成PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3, 4-DA; (2)PEG-3, 4-DA 與3-氨基苯硼酸脫水縮合，得到PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC; (3)PEG-BC開環(huán)5-芐 酯-L-谷氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐BLG-NCA，即以PEG-BC作為大分子引發(fā)劑對(duì)5-芐酯-L-谷 氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐（BLG-NCA)進(jìn)行開環(huán)聚合，得到所述以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌 段聚合物PEG-BC-PBLG。
[0018] 本發(fā)明還提出了根據(jù)上述方法制備的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，所 述兩嵌段聚合物結(jié)構(gòu)如式（I)所示。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了將所述以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物用于制備藥 物載體的應(yīng)用。
[0020] 其中，所述藥物為脂溶性藥物。優(yōu)選地，所述脂溶性藥物包括阿霉素、吉西他濱、 SN38和紫杉醇。
[0021 ] 其中，所述載體為納米膠束載體，優(yōu)選地，所述納米膠束載體為酸敏感型。
[0022] 其中，所述納米膠束載體用于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞特性。
[0023] 其中，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
[0024] 其中，所述納米膠束載體的結(jié)構(gòu)為如圖1B所示。
[0025] 本發(fā)明利用苯硼酸酯對(duì)腫瘤微酸性環(huán)境的響應(yīng)性，以及苯硼酸對(duì)細(xì)胞膜表面的寡 聚糖具有非常強(qiáng)的結(jié)合能力的特點(diǎn)，以苯硼酸兒茶酚酯（BC)為連接單元合成聚乙二醇-聚 谷氨酸兩嵌段聚合物（PEG-BC-PBLG)，進(jìn)而構(gòu)建其載阿霉素膠束（PEG-BC0PBLG·Dox)。研 究該P(yáng)EG-BC0PBLG·?οχ膠束對(duì)腫瘤微環(huán)境的主動(dòng)有序響應(yīng)行為及快速釋藥過程，評(píng)價(jià)其體 外毒性及抗肝癌活性。該主動(dòng)有序響應(yīng)行為及快速釋藥過程具體可描述為：硼酸酯載體膠 束經(jīng)長效循環(huán)充分實(shí)現(xiàn)EPR效應(yīng)后富集于肝癌組織；硼酸酯鍵對(duì)胞外微酸性環(huán)境響應(yīng)而斷 裂脫去PEG殼層；裸露出苯硼酸，苯硼酸與細(xì)胞膜表面的寡聚糖結(jié)合實(shí)現(xiàn)苯硼酸介導(dǎo)增強(qiáng) 的主動(dòng)胞吞，釋放出被包裹的藥物。
[0026] 本發(fā)明所涉及的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)及載阿霉素納米 膠束PEG-BC0PBLG·Dox示意圖如圖1A所示，實(shí)施步驟如下：
[0027] 第一步：苯硼酸酯兩嵌段聚合物的合成與表征
[0028] (1)合成PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3, 4-DA; (2)PEG-3, 4-DA與3-氨基苯硼酸 脫水縮合，得到PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC; (3)PEG-BC開環(huán)5-芐酯-L-谷氨酸-N-羧 基環(huán)內(nèi)酸酐（BLG-NCA)，得到以苯硼酸酯為連接單元兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG，表征其結(jié) 構(gòu)；(4)合成用于對(duì)照研究的不含苯硼酸酯鍵的兩嵌段聚合物PEG-PBLG，及異硫氰酸熒光 素（FITC)標(biāo)記的PEG-BC-PBLG-FITC和PEG-PBLG-FITC。
[0029] 第二步：苯硼酸酯兩嵌段聚合物納米膠束系統(tǒng)的構(gòu)筑及表征
[0030] 用溶劑蒸發(fā)法制備PEG-BC0PBLG膠束及載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox，測(cè)定其 臨界膠束濃度；用透射電鏡（TEM)觀測(cè)其形貌，用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS)測(cè)定粒徑大小及分 布；用紫外吸收法測(cè)定載藥膠束的包封率和載藥量。
[0031] 所述PEG-BC0PBLG膠束的結(jié)構(gòu)如圖1B所示。
[0032] 兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG自組裝形成PEG-BC0PBLG膠束時(shí)，PEG端形成親水外 層，PBLG形成疏水球狀內(nèi)核（如圖1B所示），PEG和PBLG之間以苯硼酸酯為連接單元。在 酸性條件下苯硼酸酯鍵斷裂時(shí)，膠束脫去PEG外層，裸露出苯硼酸端，如圖1C所示；
[0033] 其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式（4)所示：
[0034]
[0035] 第三步：嵌段聚合物及納米膠束PEG-BC0PBLG的降解及釋藥性能
[0036] 用1HNMR的方法對(duì)嵌段聚合物PEG-BC-PBLG在模擬腫瘤微環(huán)境pH值（ρΗ6· 5,pH 6· 0,pH5· 0)及正常血液pH值（ρΗ7· 4)中的降解情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；用DLS追蹤PEG-BCO PBLG納米膠束在上述pH緩沖液中降解后粒徑變化情況；測(cè)定載藥膠束PEG-BC0PBLG·Dox 的釋藥性能。
[0037] 第四步：PEG-BC@PBLG納米膠束的細(xì)胞吞噬
[0038] 研究細(xì)胞表面SialylLewisX較多的Η印G2細(xì)胞對(duì)PEG-BC0PBLG膠束吞噬行為， 以不含硼酯鍵的PEG0PBLG膠束及細(xì)胞表面SialylLewisX較少的HL7702細(xì)胞作為對(duì)照。 在不同pH值條件下培養(yǎng)3h后，用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記膠束樣品的熒光值。
[0039] 第五步：載阿霉素PEG-BC0PBLG·Dox膠束的細(xì)胞毒性研究
[0040] 噻唑藍(lán)（MTT)比色法檢測(cè)PEG-BC0PBLG膠束，無硼酸酯連接單元的載阿霉素膠束 PEG0PBLG·Dox，以硼酸酯為連接單元的載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox及Dox在pH7. 4 和pH5. 0培養(yǎng)條件下Η印G2細(xì)胞毒性。
[0041] 第六步：載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox抑制裸鼠肝癌模型的生長活性評(píng)價(jià)
[0042] 評(píng)價(jià)PEG-BC0PBLG·Dox對(duì)裸鼠肝癌模型（HepG2)的生長抑制效果。
[0043] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明制備的嵌段聚合物可以用于構(gòu)筑納米膠束，具有 較好的釋藥性，較低的細(xì)胞毒性和良好的細(xì)胞吞噬性。
【附圖說明】
[0044] 圖1A為以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)及載阿霉素納米膠束 PEG-BC0PBLG·Dox示意圖；
[0045] 圖1B為PEG-BC0PBLG膠束的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0046] 圖1C為PEG-BC0PBLG膠束的結(jié)構(gòu)在酸性條件下苯硼酸酯鍵斷裂時(shí)，膠束脫去PEG 外層，裸露出苯硼酸端后的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0047] 圖2為以苯硼酸酯為連接單元的嵌段聚合物PEG-BC-PBLG在不同pH介質(zhì)中降解 的1HNMR譜圖。硼酸酯鍵斷裂后PBLG端不溶于DMS0-D6,而PEG端仍溶于DMS0-D6,圖中 PBLG端特征峰h，i，g處峰面積隨著pH的降低而減小，而PEG端特征峰f，e，d峰面積基本不 變。
[0048] 圖3為PEG-BC-PBLG嵌段聚合物透析純化前后的nBNMR譜圖。A:透析前硼譜，a 為硼酯峰，b為硼酸峰；B:透析后硼譜，只有硼酯峰a。
[0049] 圖4為PEG-BC0PBLG膠束的粒徑分布（DLS圖）及形貌圖（TEM圖）。
[0050] 圖5為PEG-BC0PBLG膠束在不同pH緩沖溶液中的粒徑變化圖。ρΗ7· 4中膠束 粒徑在l〇〇nm左右，相對(duì)穩(wěn)定，隨介質(zhì)pH降低，膠束的粒徑呈明顯增大的趨勢(shì)，分別達(dá)到 400, 950, 2100nm。
[0051] 圖6為PEG-BC0PBLG·Dox載藥膠束在不同pH緩沖溶液中的藥物釋放行為。在 pH7. 4介質(zhì)中，藥物釋放速度較慢，9h累積釋放量?jī)H約10%。隨著介質(zhì)pH降低釋藥量明顯 增加，在ρΗ5· 0介質(zhì)中，4hDox釋放高達(dá)85%，而對(duì)照載藥膠束PEG0PBLG·Dox在ρΗ5· 0 條件下釋藥量?jī)H為 4.8%。A:PEG-BC@PBLG.Dox(pH7.4);BPEG-BC@PBLG.Dox(pH6.5);C PEG-BC0PBLG·Dox(pH6. 0);DPEG-BC0PBLG·Dox(pH5. 0);EPEG0PBLG·Dox(pH5. 0)。
[0052] 圖7為Η印G2或HL7702細(xì)胞在不同pH條件下對(duì)FITC標(biāo)記的PEG-BC0PBLG膠束的 細(xì)胞吞噬行為熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。A)PEG0PBLG-FITC作用于Η印G2細(xì)胞，B)PEG-BCOPBLG-FITC 作用于ifepG2 細(xì)胞，C)PEG-BC@PBLG-FITC作用于HL7702 細(xì)胞。
[0053] 圖8為PEG-BC0PBLG膠束載體及載阿霉素（Dox)后在A:pH7. 4;B:pH5. 0培養(yǎng)基 中的細(xì)胞毒性。PEGOPBLG·Dox和PEG-BCOPBLG·Dox在pH7. 4條件下都顯示出低毒性，然 而在pH5. 0條件下PEG-BC0PBLG·Dox細(xì)胞毒性明顯增高且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。
[0054] 圖9為PEG-BC0PBLG·Dox對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤〇fepG2細(xì)胞）的生長抑制效果，A)生 理鹽水，B)Dox·HC1，C)PEG-BC@PBLG載體，D)PEG-BC@PBLG·Dox〇
[0055] 圖10為荷瘤裸鼠