本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及IRF5作為藥物靶標(biāo)在篩選治療缺血性腦卒中的藥物中應(yīng)用，以及IRF5的抑制劑在制備治療缺血性腦卒中疾病的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦卒中是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，目前已成為世界范圍內(nèi)首要致死和致殘的原因[1,2]。腦卒中主要分缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性卒中占卒中患者總數(shù)的60％～80％[3]。缺血性腦卒中系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。缺血性腦卒中的病理生理改變主要涉及以下幾個因素：興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡。在缺血性卒中發(fā)生后，腦組織由于能量代謝障礙而導(dǎo)致興奮性氨基酸如谷氨酸大量且迅速的釋放，并伴有興奮性氨基酸的再攝取障礙。大量聚集的谷氨酸過度激活一系列下游的信號通路，包括鈣超載、活性氧的產(chǎn)生。活性氧物質(zhì)比如過氧化氫、羥自由基、超氧根離子等會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、線粒體和DNA損傷、激活或抑制許多炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死相關(guān)的信號通路[4]。與此同時，缺血的腦組織會釋放損傷相關(guān)模式分子如熱休克蛋白、ATP、硫酸乙酰肝素、DNA、RNA等，進而在趨化因子和粘附分子的調(diào)節(jié)下產(chǎn)生無菌性炎癥反應(yīng)[5,6]。缺血性腦卒中其病因可分為以下5類：大動脈粥樣硬化、心源性、穿支動脈疾病、其他病因、病因不確定[7]。缺血性腦卒中的治療主要包括：溶栓、抗血小板、抗凝、降纖、擴容等，但由于其有效治療時間窗短，目前臨床治療效果并不盡如人意[2]。IRF家族是一大類對IFN起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。IRF家族有10個成員，其中，IRF1-9普遍表達于哺乳動物中，IRF10則特異性地在鳥類和魚類中表達[8,9]。在結(jié)構(gòu)上，IRF家族成員的N末端含有相對保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain，DBD)，C末端包含有IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域(IRFassociateddomain，IAD)、自我抑制結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點等，提示著IRF家族成員生物學(xué)功能的統(tǒng)一性和特異性[10]。IRF家族在天然免疫網(wǎng)絡(luò)中起著重要調(diào)控作用，在所有的IRF家族成員中，IRF5與自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、系統(tǒng)性硬化等[11]。最近的研究顯示，IRF5可通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥參與心肌梗死的病理過程[12]。參考文獻：[1]MozaffarianD,BenjaminEJ,GoAS,etal.HeartDiseaseandStrokeStatistics-2016Update:AReportFromtheAmericanHeartAssociation[J].Circμlation.2016,133(4):e38-e360.[2]RothwellPM,AlgraA,AmarencoP.Medicaltreatmentinacuteandlong-termsecondarypreventionaftertransientischaemicattackandischaemicstroke[J].Lancet.2011,377(9778):1681-1692.[3]中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志.2015,48(4):246-257.[4]ChamorroA,DirnaglU,UrraX,etal.Neuroprotectioninacutestroke:targetingexcitotoxicity,oxidativeandnitrosativestress,andinflammation[J].LancetNeurol.2016,15(8):869-881.[5]ChenGY,NunezG.Sterileinflammation:sensingandreactingtodamage[J].NatRevImmunol.2010,10(12):826-837.[6]GelderblomM,LeypoldtF,SteinbachK,etal.Temporalandspatialdynamicsofcerebralimmunecellaccumμlationinstroke[J].Stroke.2009,40(5):1849-1857.[7]AdamsHJ,BendixenBH,KappelleLJ,etal.Classificationofsubtypeofacuteischemicstroke.Definitionsforuseinamμlticenterclinicaltrial.TOAST.TrialofOrg10172inAcuteStrokeTreatment[J].Stroke.1993,24(1):35-41.[8]ZhangXJ,ZhangP,LiH.Interferonregμlatoryfactorsignalingsincardiometabolicdiseases[J].Hypertension.2015,66(2):222-247.[9]LiS,LuLF,FengH,etal.IFNregμlatoryfactor10isanegativeregμlatoroftheIFNresponsesinfish[J].JImmunol.2014,193(3):1100-1109.[10]ChenW,RoyerWJ.Structuralinsightsintointerferonregμlatoryfactoractivation[J].CellSignal.2010,22(6):883-887.[11]EamesHL,CorbinAL,UdalovaIA.Interferonregμlatoryfactor5inhumanautoimmunityandmurinemodelsofautoimmunedisease[J].TranslRes.2016,167(1):167-182.[12]CourtiesG,HeidtT,SebasM,etal.InvivosilencingofthetranscriptionfactorIRF5reprogramsthemacrophagephenotypeandimprovesinfarcthealing[J].JAmCollCardiol.2014,63(15):1556-1566.技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決臨床防治腦卒中疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是確定IRF5基因的表達與腦卒中疾病之間的相互關(guān)系。提供一種以IRF5作為藥物靶標(biāo)在篩選防治腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用，進而提供一種IRF5的抑制劑在制備防治腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明以神經(jīng)元特異性IRF5基因敲除小鼠以及IRF5基因過表達小鼠為實驗對象，通過小鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷造成腦卒中模型，研究IRF5基因與腦卒中的關(guān)系，結(jié)果表明與對照組小鼠相比，IRF5基因敲除小鼠梗死體積明顯降低，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；IRF5基因過表達小鼠梗死體積明顯增加，神經(jīng)功能明顯惡化，死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多。體外細(xì)胞實驗表明，腺病毒介導(dǎo)的IRF5干擾可抑制原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生缺氧/復(fù)氧損傷，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。這提示IRF5具有惡化神經(jīng)功能的作用，能加重促進腦卒中的發(fā)展，將為研究預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。因此，IRF5基因可作為藥物靶點，構(gòu)建IRF5基因過表達的體外細(xì)胞模型或動物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物；IRF5基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計并制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達到預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的目的。例如以IRF5為靶基因，設(shè)計可干擾IRF5表達的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使IRF5基因沉默來治療腦卒中疾??；還可以設(shè)計并構(gòu)建IRF5的突變體，注射后進入細(xì)胞，競爭IRF5原形的作用底物，從而抑制IRF5的功能，起到治療目的；此外，還可以以IRF5為靶點設(shè)計小分子化合物抑制劑，利用IRF5基因過表達的體外細(xì)胞模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制IRF5的分子，從而為腦卒中疾病的治療提供新的治療策略。針對IRF5的上述功能，提供IRF5作為藥物靶標(biāo)在篩選保護神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。針對IRF5的上述功能，提供IRF5作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。針對IRF5的上述功能，提供IRF5的抑制劑在治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。一種預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物，包含IRF5的抑制劑。所述的IRF5的抑制劑優(yōu)選為IRF5基因的siRNA、IRF5基因的RNA干擾載體，IRF5的抗體及其他能夠抑制IRF5表達的抑制劑。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF5的新功能，即IRF5具有惡化腦卒中疾病的作用。(2)基于IRF5在惡化腦卒中疾病中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物提供靶標(biāo)。(3)IRF5的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物。附圖說明圖1是神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠和神經(jīng)元特異性IRF5敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定結(jié)果圖A為神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建圖；B為神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果圖；C為神經(jīng)元特異性IRF5敲除小鼠的構(gòu)建圖；D為神經(jīng)元特異性IRF5敲除小鼠的鑒定結(jié)果圖；圖2是NTG小鼠和IRF5-TG4小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估結(jié)果圖(*：p＜0.05vsNTG對照組)。A為TTC染色結(jié)果圖；B為腦梗體積統(tǒng)計柱狀圖；C為神經(jīng)功能評分統(tǒng)計柱狀圖；圖3IRF5flox/flox和IRF5-KO小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估結(jié)果圖(*：p＜0.05vsIRF5flox/flox對照組)。A為TTC染色結(jié)果圖；B為腦梗體積統(tǒng)計柱狀圖；C為神經(jīng)功能評分統(tǒng)計柱狀圖；圖4是NTG和IRF5-TG4小鼠FluoroJadeB小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果圖(*：p＜0.05vsNTG組)。圖中A為FluoroJadeB檢測顯示圖和統(tǒng)計結(jié)果圖；圖中B為TUNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計結(jié)果圖；圖5是IRF5flox/flox和IRF5-KO小鼠FluoroJadeB小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果圖(*：p＜0.05vsWT組)。圖中A為FluoroJadeB檢測顯示圖和統(tǒng)計結(jié)果圖；圖中B為TUNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計結(jié)果圖；圖6是經(jīng)腺病毒AdshIRF5轉(zhuǎn)染后OGD處理的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對活性和乳酸脫氫酶釋放的結(jié)果圖。圖中A為神經(jīng)元細(xì)胞相對活性統(tǒng)計結(jié)果圖；圖中B為乳酸脫氫酶釋放量統(tǒng)計結(jié)果圖；具體實施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實驗用動物及飼養(yǎng)實驗動物：選用雄性，8-12周齡，體重在24-27g，背景為C57BL/6的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號：949431)、神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF5-TG，由武漢大學(xué)李紅良教授實驗室構(gòu)建)、非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，同窩對照非轉(zhuǎn)基因小鼠)、IRF5flox/flox小鼠(IRF5flox/flox，由武漢大學(xué)李紅良教授實驗室構(gòu)建)及神經(jīng)元特異性IRF5基因敲除(IRF5-KO)小鼠(由IRF5flox/flox小鼠與CaMKIIα-Cre(購自JacksonLaboratory,StockNo.005359)小鼠雜交得到)為實驗對象。(1)神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1A)：用上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGAACCACTCAGCCCCA-3’；下游引物：5’-GCTCTAGATTATTGCATGCCAACTGGGT-3’擴增小鼠IRF5(NCBI,GeneID:27056,NM_012057.4)基因cDNA，把擴增的IRF5基因cDNA和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實驗室提供，制備過程參見參考文獻：KimT,ZhelyabovskaO,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs),57.)經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeⅠ(NEB，R0145L)酶切后連接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-IRF5-hGHpA載體。IRF5的表達由CAG啟動子驅(qū)動得到。將構(gòu)建的載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF5-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠由IRF5-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和CaMKIIα-Cre小鼠雜交繁殖得到。通過蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)實驗檢測不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織中IRF5蛋白的表達量：提取不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗證IRF5過表達，我們構(gòu)建了幾株神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF5-TG1、2、4、6)，在不同轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)IRF5蛋白表達含量相對于NTG小鼠有不同程度提高(圖1B)。為了反映病理生理狀態(tài)下IRF5的改變，我們選擇了IRF5-TG4小鼠進行實驗，WesternBlot及定量分析顯示，其腦組織中IRF5表達量約為正常組織3.42倍。(2)神經(jīng)特異性IRF5基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1C)：利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)特異性IRF5基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設(shè)計工具(http://crispr.mit.edu)分別在內(nèi)含子2和3中各設(shè)計一個CRISPR的打靶位點，靶序列分別為：IRF5sgRNA1：GGCAGTGGTAATGAAGAAGCACCTGGIRF5sgRNA2：GGCAAGCAGGTACAATCTCAAAGG此外還設(shè)計了一個用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒，它包括兩側(cè)同源臂它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XbaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實驗。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT；loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA；loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體(DonorVector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計如下引物(表1)，以小鼠gDNA為模板，擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。上述擴增得到的產(chǎn)物及pBluescriptSK(+)-2loxp載體經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后一一連接，得到供體載體。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對應(yīng)酶切位點引物名稱引物序列酶切位點IRF5LA-FCCGCTCGAGAGTGCCTTTCTGTGGAGAGCXhoIIRF5LA-RATGGACGTCTTGAGGCCAAGCAGACCAAAAatIIIRF5M-FTCTACCGGTATTGTACCTGCTTGCCCTCCAgeIIRF5M-RGGCGATATCCCTCACCCCACTCCCAGATAEcoRVIRF5RA-FGGACTAGTCCTTTGCCTGCTGCTTCTTGSpeIIRF5RA-RATAAGAATGCGGCCGCCTCCCCAGTTCAGCCTTGACNotI④打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體pST1374-Cas9(Addgene44758)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。⑤IRF5flox/flox條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得IRF5flox/flox純合小鼠。⑤神經(jīng)特異性IRF5基因敲除小鼠的制作將上述IRF5flox/flox小鼠與神經(jīng)細(xì)胞特異性CaMKIIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到IRF5flox/flox/CaMKIIα-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到神經(jīng)細(xì)胞特異性IRF5基因敲除小鼠。通過蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)實驗檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性IRF5基因敲除小鼠腦組織中IRF5蛋白的表達量：提取腦、脂肪、肺、腎臟組織蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗證IRF5表達，結(jié)果見圖1D，在小鼠脂肪、肺、腎臟組織中，WT型小鼠和基因敲除小鼠IRF5蛋白表達含量變化不大，而在腦組織中，相比于WT型小鼠，基因敲除小鼠IRF5蛋白表達含量明顯降低。飼養(yǎng)環(huán)境：所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級實驗動物中心。SRF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水?dāng)z食。【實施例1】小鼠腦梗死模型獲得1.實驗動物分組：小鼠腦梗死模型由大腦中動脈缺血再灌注(I/R)獲得。動物被隨機分為4組，每組10只小鼠，分別為對照組：非轉(zhuǎn)基因同窩對照I/R術(shù)組(NTGI/R)、IRF5flox/floxI/R術(shù)組(IRF5flox/floxI/R)以及神經(jīng)元特異性IRF5轉(zhuǎn)基因I/R術(shù)組(IRF5-TG4I/R)、神經(jīng)元特異性IRF5基因敲除I/R術(shù)組(IRF5-KOI/R)2.線栓法腦梗死I/R手術(shù)MCAO(middlecerebralarteryocclusion，大腦中動脈閉塞)模型操作流程：(1)抓取小鼠，使用3％異氟烷麻醉小鼠，8％硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術(shù)剪迅速剪掉，3％活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75％酒精脫碘1次。(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2mm、左側(cè)5mm的部位。(3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA，在ECA遠心端結(jié)扎和剪一小口，將線栓由剪口送入ICA，當(dāng)線栓進入深度在9-11mm左右至血流下降遇阻力停，整個過程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5℃。(4)從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時開始計時，45min后將線栓拔出，并將ECA近心端結(jié)扎，迅速松開CCA處動脈夾。注意觀察血流恢復(fù)情況，選擇血流下降75％以上，血流恢復(fù)達70％以上的小鼠納入實驗。(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放在溫箱中，箱溫維持在28℃，給水和飼料，分別在24h、72h取材。【實施例2】小鼠腦梗死模型腦梗死體積測定腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)主要包括大腦梗死體積和神經(jīng)功能評分，這些指標(biāo)均與缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。(1)分別在手術(shù)后24h、72h取材前進行神經(jīng)功能及行為學(xué)評分；基于Berderson神經(jīng)功能評分改進方法(9分制)：0分：無神經(jīng)受損的癥狀；1分：提尾時對側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達患側(cè)前肢；2分：提尾時對側(cè)肩膀內(nèi)收；3分：平推：向?qū)?cè)推動時阻力下降；4分：可自發(fā)的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎；5分：自發(fā)運動時轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)；6分：無自主運動，只在刺激時運動；7分：無自主運動，刺激時也無運動；8分：與腦缺血有關(guān)的死亡。(2)抓取小鼠，腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取腦。(3)將取下的腦組織放入1mm小鼠腦模，置于-20℃冰箱凍存。(4)腦組織2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloricej，TTC)染色：從-20℃冰箱取出腦組織，立即切成1mm厚的切片，共切7片。將切片立即置于10mL2％TTC溶液中，37℃恒溫孵育10min。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。(5)用10％中性福爾馬林溶液固定腦組織切片，大體拍照。(6)腦梗體積計算(Image-ProPlus6.0軟件)：梗死體積％＝(對側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)未梗死體積)/(對側(cè)大腦半球體積×2)×100％；總梗死體積為各自7張大腦切片結(jié)果數(shù)據(jù)之和。TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，呈蒼白色。NTG、IRF5-TG4組TTC染色結(jié)果如圖2A所示，經(jīng)過I/R缺血45min再灌注24小時后IRF5-TG4小鼠梗死體積較對照組小鼠增加，且這種作用在I/R術(shù)后72小時仍然持續(xù)(圖2B)；且I/R組IRF5-TG小鼠神經(jīng)功能評分在術(shù)后24小時、72小時均比對照組小升高(圖2C)。相反的，IRF5-KO小鼠I/R術(shù)后24h、72h梗死體積較對照組小鼠均減少(圖3A、B)，神經(jīng)功能評分比對照組小鼠低(圖3C)。這一結(jié)果表明IRF5基因的缺失可減少缺血再灌注損傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死體積，可保護神經(jīng)功能，即IRF5基因?qū)θ毖俟嘧p傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死以及神經(jīng)功能損傷具有惡化作用?！緦嵤├?】腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定1.腦組織冰凍切片制備(1)抓取小鼠，腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉小鼠。(2)開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺入左心室，同時剪開右心房。(3)用PBS(0.01M，pH7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變白后，用4％多聚甲醛灌流15min。(4)開顱迅速取出小鼠大腦，室溫4％多聚甲醛后固定6-8h。(5)切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先后兩個部分，用先前的固定液再固定15min。(6)隨后浸沒于含30％蔗糖的PBS(0.01M，pH7.4)中，4℃冰箱沉底過夜。(7)30％蔗糖與OCT包埋劑按1:1(v/v)混合后，倒適量到包埋框中，將前一步的組織取出，在紗布上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會兒，再將其轉(zhuǎn)入到先已加入2滴OCT的另一個包埋框中，調(diào)整組織的位置，使其正好位于包埋框的正中。(8)將盛組織的包埋框，移入干冰中，盡量使其處于水平位，稍待一會兒后，繼續(xù)加入OCT，浸沒組織一定的高度，待OCT凝固后，將其儲存于-80℃的冰箱中。(9)用冰凍切片機的標(biāo)準(zhǔn)程序切5μm的冰凍切片備用。2.FJB(FluoroJadeB)染色(1)將冰切組織切片在烘箱中烘干1小時；(2)1％NaOH+80％無水乙醇5min；(3)70％無水乙醇2min；(4)ddH2O2min；(5)FlouroJadeB稀釋液(AG310,Millipore,Billerica,MA)，室溫，避光20min；(6)ddH2O1min×3；(7)在烘箱中烘片5-10min；(8)二甲苯>1min；(9)封片，拍照。3、TUNEL試劑盒染色檢測凋亡用TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL試劑盒：PlusInSituApoptosisFluoresceinDetectionKit(S7111，Chemicon)):(1)將冰切組織切片置于(pH7.4)1％的多聚甲醛中，室溫固定水解10分鐘；(2)PBS洗兩次，每次5min；(3)置于預(yù)冷的乙醇：乙酸(2：1)溶液中，-20℃浸泡5分鐘，去除多余液體，但注意不要干燥；(4)PBS洗兩次，每次5min；(5)濾紙小心吸去多余液體，立即在切片上按75μl/5cm2直接加入平衡緩沖液，室溫孵育1-5min；(6)濾紙小心吸去多余液體，立即在切片上按55μl/5cm2直接加入TdT酶反應(yīng)液，置于避光保濕盒中作用1h(陰性對照加入不含TdT酶的反應(yīng)液)；(7)將切片置于終止/洗滌緩沖液中，輕輕搖動15sec，室溫孵育10min；此時準(zhǔn)備適量抗地高辛抗體，預(yù)熱至室溫，注意避光；(8)PBS洗三次，每次1min；(9)濾紙小心吸去多余液體，直接在切片上按65μl/5cm2加入抗地高辛抗體，室溫下于避光保溫濕盒中作用1h；(10)PBS洗四次，每次2min；(11)SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI(Invitrogen，S36939)封片；(12)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4℃保存。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，計數(shù)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。(若需保存，于暗濕盒中4℃保存)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果如圖4、圖5所示。圖4是是IRF5-TG4小鼠和NTG小鼠I/R術(shù)后24小時腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)luoroJadeB染色(A)和TUNEL染色(B)結(jié)果顯示IRF5-TG4小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均比NTG小鼠增大。圖5是IRF5-KO小鼠和對照組小鼠I/R術(shù)后24小時腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)luoroJadeB染色(A)和TUNEL染色(B)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示IRF5-KO小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比IRF5flox/flox組小鼠低。這些結(jié)果表明，減少IRF5基因的表達可以改善腦組織缺血/再灌注損傷，且可能與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；IRF5基因可惡化腦組織缺血/再灌注損傷的發(fā)生，促進神經(jīng)元細(xì)胞凋亡?！緦嵤├?】IRF5干擾(AdshIRF5)對缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響4.1新生SD乳鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)Sprague-Dawley乳鼠購買于武漢大學(xué)實驗動物中心。(1)準(zhǔn)備培養(yǎng)平皿，加入DMEM培養(yǎng)基，在冰上預(yù)冷。(2)將出生1天的SD乳鼠，75％乙醇浸泡消毒。(3)用小剪和鑷子逐層分離乳鼠皮膚及顱骨，取出腦放入平皿并在冰上分離皮層。(4)將腦皮層轉(zhuǎn)入置于冰上的盛有DMEM液的培養(yǎng)皿中，剪碎腦組織。(5)將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)入15mL離心管，將DMEM液吸盡，加入0.125％酶消化液5mL。(6)將離心管置于37℃水中消化20min左右，用含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。(7)1000r/min離心×5min，吸棄上清，加入4ml含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，用200目網(wǎng)篩過濾。(8)將細(xì)胞接種于10mg/L多聚賴氨酸過夜包被的培養(yǎng)皿。(9)4-6h后全量換成Neurobasal+B27培養(yǎng)基。(10)接種第2d，根據(jù)情況加入終濃度5μmol/L的阿糖胞苷處理24h后，全量換Neurobasal+B27培養(yǎng)液。(11)每隔兩天半量換液,第5d左右細(xì)胞進行后續(xù)試驗。4.2氧糖剝奪實驗(OGD)：將細(xì)胞培養(yǎng)皿Neurobasal+B27培養(yǎng)液棄去，換成無血清無糖的OGD液，放入95％N2和5％CO2低氧培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)1h，到時間后取出培養(yǎng)皿棄去ODG液換成Neurobasal+B27培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，到相應(yīng)的時間后，收集樣品。對照組在正常培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。4.3構(gòu)建腺病毒表達載體，轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞：(1)AdshRNA和AdshIRF5載體的構(gòu)建方法參見文獻：ChenK,GaoL,LiuY,etal.Vinexin-βprotectsagainstcardiachypertrophybyblockingtheAkt-dependentsignallingpathway[J].BasicResCardiol,2013,108(2):1-14.)。(2)腺病毒的包裝：1)用PacI處理重組的陽性質(zhì)粒，用乙醇沉淀后重懸于20μl無菌水中。2)使用VigoFect將6μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染匯合率為50～70％的293A細(xì)胞，8h后移除混合液，加入4ml含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液，觀察綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率。3)轉(zhuǎn)染后的7～10d，觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)時，用移液器將細(xì)胞吹下，移到50ml錐形離心管中。離心后用1mlPBS使細(xì)胞重懸。液氮凍結(jié)細(xì)胞，再用37℃水浴融化，并劇烈振蕩，重復(fù)4次。之后離心，取上清液，得到第一代病毒，-80℃保存。4)將293A細(xì)胞鋪在100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，匯合率為50～70％，加入含病毒的上清液0.5ml。2～3d可觀察到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象。感染后3～5d，當(dāng)1/3～1/2的細(xì)胞脫離時收集病毒，并按上述方法獲得病毒上清液。5)將獲得的病毒上清液感染100mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞，收集病毒，使其感染150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的293A細(xì)胞，進一步擴增，獲得足量病毒。6)將富集的病毒顆粒上清液滴加在CsCl梯度溶液上，30000rpm超速離心，4℃，16h。離心后出現(xiàn)兩個條帶，顏色弱、位置高的條帶為腺病毒空殼；顏色亮、位置低的條帶含活病毒顆粒，用16號針頭收集該條帶。7)之后在TBS中透析1h，再用含有10％甘油的TBS透析兩次，每次1h。將獲得的純化腺病毒裝進EP管中。用紫外分光光度計測定透析液中的總蛋白，1μg病毒蛋白≈4×109病毒顆粒。腺病毒短期保存在4℃冰箱，長期應(yīng)保存在-80℃超低溫冰箱。(3)腺病毒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞：通過梯度感染法確定所需病毒用量。感染原代神經(jīng)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(mμltiplicityofinfection,MOI)為100：1。將Ploybrene加入培養(yǎng)液，二者比例為1：1000。感染后8～12h換液，加入適量完全培養(yǎng)基。4.4細(xì)胞活性的測定：細(xì)胞活性檢測用CCK8試劑盒，其原理是WST-8在電子耦合劑存在時，可以被活細(xì)胞中的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物，進而可以反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。用CCK8試劑盒(CK04,Dojindo,Japan)檢測神經(jīng)細(xì)胞活性，具體操作步驟按照說明書：(1)在神經(jīng)元培養(yǎng)96孔板中，感染相應(yīng)腺病毒，并OGD處理指定時間后。(2)加入10μl/每孔CCK-8溶液，空白對照組加入相應(yīng)量的培養(yǎng)液。(3)將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h。(4)在450nm測定吸光度,同時使用630nm的波長作為參考波長進行波長測定。4.5細(xì)胞LDH釋放檢測：活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有乳酸脫氫酶(LDH)，正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。進而可以通過測定LDH的釋放來反應(yīng)細(xì)胞損傷毒性。用LDH試劑盒(G1782,Promega)檢測細(xì)胞釋放LDH，具體操作步驟按照說明書：(1)將培養(yǎng)的神經(jīng)元感染相應(yīng)病毒，并用OGD處理指定時間。(2)將待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出，放進離心機以250g,離心4分鐘。(3)分別移取50μl/孔上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細(xì)胞，同時注意做好標(biāo)記。(4)每孔分別加入50μl底物混合液，混勻，在室溫下孵育30分鐘，避免光照。(5)每孔分別加入50μl終止液。在波長490nm測定吸光度值。RF5干擾(AdshIRF5)對缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力結(jié)果如圖6所示。經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，AdshIRF5轉(zhuǎn)染的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對活力明顯高于AdshRNA對照組(A)，乳酸脫氫酶釋放明顯低于對照組(B)。說明體外敲低IRF5基因可保護原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞對抗缺氧/復(fù)氧損傷，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果表明，在大腦中動脈缺血再灌注引起的損傷中，IRF5敲除后的小鼠梗死體積顯著減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯減少；IRF5過表達小鼠梗死體積顯著增多，神經(jīng)功能明顯惡化，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯增加，體外利用AdshIRF5敲低IRF5基因表達獲得與載體動物實驗一致的結(jié)果，敲低IRF5基因表達的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)OGD處理后，細(xì)胞活里增加；這些結(jié)果說明IRF5在腦卒中疾病模型中有著重要的惡化作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>干擾素調(diào)節(jié)因子5及其抑制劑在腦卒中疾病中的應(yīng)用<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1gctctagagccaccatgaaccactcagcccca32<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>2gctctagattattgcatgccaactgggt28<210>3<211>26<212>DNA<213>人類<400>3ggcagtggtaatgaagaagcacctgg26<210>4<211>24<212>DNA<213>人類<400>4ggcaagcaggtacaatctcaaagg24<210>5<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>5agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>6atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>7<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>7gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>8<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>8ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>9ccgctcgagagtgcctttctgtggagagc29<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>10atggacgtcttgaggccaagcagaccaaa29<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>11tctaccggtattgtacctgcttgccctcc29<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>12ggcgatatccctcaccccactcccagata29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>13ggactagtcctttgcctgctgcttcttg28<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>14ataagaatgcggccgcctccccagttcagccttgac36當(dāng)前第1頁1 2 3