本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺癌調(diào)節(jié)因子srsf5及其抑制劑與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

真核生物中95％的基因存在可變剪接，可變剪接決定了rna的多樣性并對蛋白質(zhì)的表達(dá)模式產(chǎn)生重要影響?？勺兗艚拥膭?dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由若干順式作用元件和反式作用因子組成：通常精氨酸絲氨酸富集剪接因子(srsf)結(jié)合在外顯子剪接增強(qiáng)子和內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子上，而核異質(zhì)核糖核蛋白(hnrnp)結(jié)合在外顯子剪接抑制子和內(nèi)含子剪接抑制子上，二者存在空間和時(shí)間上的相互競爭關(guān)系。經(jīng)典的剪接激活過程是由sr蛋白結(jié)合在相應(yīng)順式剪接元件上招募剪接小體的組成蛋白u(yù)1、u2及其相關(guān)輔助因子，進(jìn)而將可變剪接的外顯子釋放；而在剪接抑制過程中，核異質(zhì)核糖核蛋白在形成套索結(jié)構(gòu)后將可變剪接的外顯子切除。因此，剪接因子的活性和含量的精細(xì)調(diào)控對于剪接小體的組裝和功能發(fā)揮尤為重要。

srsf分為經(jīng)典型精氨酸絲氨酸富集型剪接因子和精氨酸絲氨酸富集類似型剪接因子兩大類，經(jīng)典型sr蛋白具有12個(gè)成員，其保守型的結(jié)構(gòu)域通常為位于n端的1-2個(gè)rna識別結(jié)構(gòu)域和位于c端的精氨酸絲氨酸富集區(qū)域，后者也被普遍認(rèn)為是sr蛋白的翻譯后修飾發(fā)生的高頻區(qū)域。目前多篇乙?；头核鼗揎椊M學(xué)數(shù)據(jù)集顯示：srsf5是唯一一個(gè)同時(shí)存在兩種翻譯后修飾且修飾位點(diǎn)高度重合的sr型剪接因子(修飾位點(diǎn)k125)，因此其功能特征和調(diào)節(jié)機(jī)制值得探討。異常調(diào)控的可變剪接是腫瘤細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志。然而，可變剪接中關(guān)鍵成分剪接因子的活性調(diào)節(jié)知之甚少。

ccar1廣泛的參與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)并受notch信號刺激，但迄今為止，ccar1的剪接活性調(diào)節(jié)關(guān)系知之甚少。ccar1作為srsf5的剪切底物，剪切產(chǎn)物共有長短兩種形式ccar1l和ccar1s，ccar1l保存了完整的轉(zhuǎn)錄本而ccar1s是ccar1第15-22個(gè)外顯子發(fā)生可變剪接之后的產(chǎn)物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制srsf5表達(dá)和/或活性的物質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了抑制srsf5表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制備具有如下(1)-(3)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

(1)治療和/或預(yù)防腫瘤；

(2)抑制腫瘤細(xì)胞的生長；

(3)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中ccar1可變剪接產(chǎn)物含量。

上述應(yīng)用中，所述抑制腫瘤細(xì)胞的生長體現(xiàn)在降低腫瘤細(xì)胞的重量和/或減小腫瘤細(xì)胞的體積和/或提高原位凋亡腫瘤細(xì)胞的比例。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控腫瘤細(xì)胞中ccar1可變剪接產(chǎn)物含量體現(xiàn)在提高腫瘤細(xì)胞中ccar1長形式可變剪切產(chǎn)物的含量和/或降低腫瘤細(xì)胞中ccar1短形式可變剪切產(chǎn)物的含量和/或提高腫瘤細(xì)胞中ccar1長形式可變剪切產(chǎn)物與ccar1短形式可變剪切產(chǎn)物的比例。

上述應(yīng)用中，所述抑制srsf5表達(dá)和/或活性的物質(zhì)為抗srsf5抗體、srsf5小分子抑制劑、srsf5可溶性蛋白或干擾srsf5表達(dá)的rna分子。

上述應(yīng)用中，所述干擾srsf5表達(dá)的rna分子為干擾srsf5表達(dá)的shrna。

上述應(yīng)用中，所述干擾srsf5表達(dá)的shrna為序列1或序列2所示的rna分子。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為抑制srsf5表達(dá)和/或活性的物質(zhì)，所述產(chǎn)品的用途為如下(1)-(3)中至少一種：

(1)治療和/或預(yù)防腫瘤；

(2)抑制腫瘤細(xì)胞的生長；

(3)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中ccar1可變剪接產(chǎn)物含量。

上述產(chǎn)品中，所述抑制腫瘤細(xì)胞的生長體現(xiàn)在降低腫瘤細(xì)胞的重量和/或減小腫瘤細(xì)胞的體積和/或提高原位凋亡腫瘤細(xì)胞的比例。

上述產(chǎn)品中，所述調(diào)控腫瘤細(xì)胞中ccar1可變剪接產(chǎn)物含量體現(xiàn)在提高腫瘤細(xì)胞中ccar1長形式可變剪切產(chǎn)物的含量和/或降低腫瘤細(xì)胞中ccar1短形式可變剪切產(chǎn)物的含量和/或提高腫瘤細(xì)胞中ccar1長形式可變剪切產(chǎn)物與ccar1短形式可變剪切產(chǎn)物的比例。

上述產(chǎn)品中，所述抑制srsf5表達(dá)和/或活性的物質(zhì)為抗srsf5抗體、srsf5小分子抑制劑、srsf5可溶性蛋白或干擾srsf5表達(dá)的rna分子。

上述產(chǎn)品中，所述干擾srsf5表達(dá)的rna分子為干擾srsf5表達(dá)的shrna。

上述產(chǎn)品中，所述干擾srsf5表達(dá)的shrna為序列1或序列2所示的rna分子。

上述應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌，所述腫瘤細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，所述非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具體為a549細(xì)胞。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供如下1)-3)中任一種作為靶點(diǎn)的新用途：

1)srsf5；

2)srsf5-ccar1信號軸；

3)ccar1可變剪接產(chǎn)物。

上述應(yīng)用中，所述srsf5-ccar1信號軸是指srsf5的表達(dá)和/或活性下降，ccar1短形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1s)的比例下降，即srsf5表達(dá)水平與ccar1短形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1s)的比例呈正相關(guān)。

上述應(yīng)用中，所述ccar1可變剪接產(chǎn)物為ccar1短形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1s)和/或ccar1長形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1l)。

本發(fā)明提供了上述1)-3)中任一種作為靶點(diǎn)在開發(fā)治療和/或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過對60例非小細(xì)胞肺癌臨床樣品進(jìn)行蛋白印跡和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：在非小細(xì)胞肺癌的臨床樣本中，srsf5的蛋白水平和乙?；痵rsf5的蛋白水平均上調(diào)，且呈現(xiàn)顯性正相關(guān)，同時(shí)srsf5的蛋白水平和乙?；痵rsf5的蛋白水平均與ccar1短形式可變剪接的比例具有顯性正關(guān)聯(lián)；然后通過細(xì)胞學(xué)水平的增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以及體外動(dòng)物整體水平的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明了srsf5-ccar1的調(diào)控軸失衡對于肺癌的發(fā)生起促進(jìn)作用。上述實(shí)驗(yàn)說明srsf5-ccar1信號軸可以作為潛在的肺癌治療靶標(biāo)，豐富了對剪接因子的活性調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識?；趕rsf5-ccar1信號軸的小分子抑制劑或剪接活性調(diào)節(jié)抑制劑的篩選將為肺癌的靶向治療提供新的思路和重要科學(xué)基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為非小細(xì)胞肺癌和鄰近癌旁組織中，srsf5的蛋白水平檢測結(jié)果。

圖2為非小細(xì)胞肺癌和其鄰近癌旁組織中，srsf5和乙酰化srsf5的免疫組化檢測結(jié)果圖。

圖3為非小細(xì)胞肺癌和鄰近癌旁組織中，乙酰化srsf5的蛋白水平檢測結(jié)果。

圖4為非小細(xì)胞肺癌和其鄰近癌旁組織中，ccar1l和ccar1s兩種轉(zhuǎn)錄本的比例檢測圖。

圖5為針對60例配對的非小細(xì)胞肺癌和鄰近癌旁組織中ccar1s/ccar1l相對比例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。

圖6為敲低srsf5后，srsf5的表達(dá)水平的檢測結(jié)果。

圖7為敲低srsf5后，ccar1s/ccar1l比例變化的檢測結(jié)果。

圖8為在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系a549中敲低srsf5后腫瘤生長體積的檢測結(jié)果。

圖9為敲低srsf5后腫瘤重量的檢測結(jié)果。

圖10為敲低srsf5后的原位瘤tunel染色檢測結(jié)果。

圖11為在敲低srsf5及過表達(dá)ccar1l和ccar1s的挽救實(shí)驗(yàn)中腫瘤生長速率的檢測結(jié)果。

圖12為敲低srsf5及過表達(dá)ccar1l和ccar1s的挽救實(shí)驗(yàn)中腫瘤生長體積和重量的檢測結(jié)果。

圖13為敲低ccar1s后挽救實(shí)驗(yàn)中原位瘤tunel染色檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、非小細(xì)胞肺癌臨床樣品中srsf5的蛋白水平及其乙酰化水平的檢測

一、srsf5的蛋白水平的檢測

1、免疫印跡實(shí)驗(yàn)

(1)樣本的收集

60例配對的非小細(xì)胞肺癌腫瘤樣本(每例樣本包括非小細(xì)胞肺癌的癌組織及其相鄰的正常組織)收集自解放軍總醫(yī)院普外科，所有臨床樣本都具備必要的臨床信息且獲得病人的知情同意，樣本的采集和儲存均符合臨床標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定。

(2)westernblot檢測

樣本搜集后，利用液氮法對樣本組織進(jìn)行研磨，研磨成細(xì)碎粉末，按照每0.1g/100μl加入ripa裂解液溶解，并加入等體積的上樣緩沖液沸水浴5-10min后上樣檢測。具體操作步驟：sds-page電泳，濃縮膠90v，20-30min，蛋白預(yù)染marker在分離膠中完全分開后，將電壓調(diào)至180v；當(dāng)溴酚藍(lán)完全分開后，將蛋白電轉(zhuǎn)至nc膜上；將nc膜轉(zhuǎn)移至含有5％脫脂牛奶的tbst中封閉1h；封閉后加入一抗：srsf5(abcam，ab671751:400)4℃過夜或室溫3h；tbst洗膜3次，每次10min；室溫孵育二抗：羊抗鼠二抗(jacksonimmunoresearch，115-035-003)或羊抗在兔二抗(jacksonimmunoresearch，111-035-003)用tbst洗滌3次，加入ecl化學(xué)底物發(fā)光試劑暗室曝光顯影；通常保留短曝光(30s以內(nèi))，中曝光(5-10min)及長曝光(3小時(shí)以上)的不同曝光階段膠片若干，必要時(shí)可添加超敏反應(yīng)試劑盒。

westernblot檢測結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出：srsf5的蛋白水平在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中存在顯著性差異，癌組織(t)中srsf5的蛋白表達(dá)水平明顯高于對應(yīng)的癌旁組織(n)的表達(dá)水平。

2、免疫組化實(shí)驗(yàn)

使用肺癌組織芯片(購于上海芯超生物有限公司)將非小細(xì)胞肺癌石蠟標(biāo)本制作成組織芯片，采用免疫組化法檢測組織芯片，利用連續(xù)切片對應(yīng)的組織樣本進(jìn)行染色分析，腫瘤芯片的免疫組化使用的抗體及濃度為：srsf5(1:100，novusbio)。具體步驟如下：

1)白片脫蠟：二甲苯i、ii各10min；

2)切片復(fù)水：100％i、100％ii、95％、90％、80％、70％的酒精時(shí)間依次為8min、8min、6min、5min、3min、3min；

3)雙蒸水洗滌2min×3；

4)3％的雙氧水去除內(nèi)源過氧化物酶15min，避光孵育；

5)pbs2min×3；

6)抗原修復(fù)：微波爐中高火將檸檬酸鹽修復(fù)液煮沸用時(shí)10min左右，緩慢冷卻至室溫；

7)pbs洗3次，每次3min；

8)山羊血清37℃封閉1h，或者4℃過夜；

9)輕輕甩掉液體，懸空側(cè)滴一抗，4℃孵育過夜；

10)加二抗輔助劑，37℃，30min；

11)pbs3min×3；

12)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃，30min；

13)pbs3min×3；

14)dab顯色，鏡下觀察，a:b:c6:6:6/500μl，使顯色反應(yīng)均勻；

15)蒸餾水沖洗，蘇木素染核10-30s，自來水沖洗2min，酒精鹽酸分化23s，自來水沖洗；

16)脫水：70％、80％、90％、95％、100％各2min；

17)透明：二甲苯i、ii分別5min；

18)中性樹脂封片，鏡下觀察，并利用nikon成像系統(tǒng)采集照片。

檢測結(jié)果如圖2(第一行)所示，ihc染色結(jié)果表明：在非小細(xì)胞肺癌中，srsf5在細(xì)胞核的著色顯著增強(qiáng)，說明非小細(xì)胞肺癌中srsf5的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。

二、srsf5乙酰化水平的檢測

1、免疫印跡實(shí)驗(yàn)

(1)樣本的收集

同步驟一中1的(1)。

(2)westernblot檢測

檢測方法同步驟一中1的(2)，其中使用的抗體為ac-srsf5(上海睿星生物有限公司自制，1：300)。

檢測結(jié)果如圖3所示，乙?；痵rsf5(ac-srsf5)的蛋白水平在非小細(xì)胞肺癌及其癌旁組織中存在顯著性差異，癌組織(t)中ac-srsf5的蛋白表達(dá)水平明顯高于對應(yīng)的癌旁組織(n)的表達(dá)水平。

2、免疫組化實(shí)驗(yàn)

同步驟一中2的實(shí)驗(yàn)方法。檢測中使用的抗體濃度為ac-k125(上海睿星生物有限公司自制，1：50)。

檢測結(jié)果如圖2(第二行)所示，ihc染色結(jié)果表明：在非小細(xì)胞肺癌中，乙?；痵rsf5(ac-srsf5)在細(xì)胞核的著色顯著增強(qiáng)，說明在非小細(xì)胞肺癌中乙?；痵rsf5(ac-srsf5)的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。srsf5蛋白水平和乙?；痵rsf5蛋白水平呈正相關(guān)。

三、ccar1可變剪切產(chǎn)物的比例檢測

ccar1作為srsf5的剪切底物，剪切產(chǎn)物共有長短兩種形式ccar1l和ccar1s，srsf5的蛋白表達(dá)水平和乙?；痵rsf5的蛋白表達(dá)水平均影響ccar1可變剪切產(chǎn)物的比例，該步驟以非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織樣本的cdna為模板，采用特異性區(qū)分長短兩種形式的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr，檢測非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織樣本中長短兩種形式的相對豐度和含量。其中，檢測長形式可變剪切產(chǎn)物(ccar1l)的引物序列為5’-gtttcaatcccgccaacgca-3’和5’-ccgaacacgtctcctgctc-3’；檢測短形式可變剪切產(chǎn)物(ccar1s)的引物序列為5’-actccttgtagcgacctgg-3’和5’-ccacgctatgatcagagctacg-3’。具體步驟如下：

1)勻漿化處理：利用研磨棒從配對的腫瘤樣本組織研磨提取rna，加入1mltrizol；

2)相分離：室溫下勻漿化樣品5min；

3)rna抽提：加入0.2ml/氯仿:1mltrizol試劑，小心蓋上ep管蓋，劇烈甩動(dòng)離心管15-20s，使其混勻，室溫溫育2-3min；4℃，12000rpm，離心15min。離心后混合物分為三層：最底層紅色-酚氯仿，中間及上層水相，rna位于水相，水相約占總體積的60％；

4)沉淀rna：將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管；加入0.5ml異丙醇/1mltrizol，使rna沉淀；室溫溫育10min，4℃，12000rpm離心10min，溫育使水相與試劑充分反應(yīng)。

5)洗滌rna：去上清，加入1ml75％乙醇/1mltrizol，渦旋樣品，4℃，7000rpm，5min。

6)重新溶解：待rna稍微晾干后，露出白色物質(zhì)，不宜太干燥，降低rna的溶解。加入20-30μldepc水，55-60℃水浴10min，全部溶解后用槍頭混勻。

7)rna質(zhì)量檢測：凝膠電泳結(jié)果顯示為三條帶或者a260/a280比值為1.8，rn含量＝a260×稀釋倍數(shù)。

8)第一鏈的合成采用toyobo公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下：2×mix5ul+rna(總量1μg以下)；反應(yīng)程序：37℃20min，95℃5min，4℃保存。

檢測結(jié)果如圖4和圖5所示，從圖中可以看出：在非小細(xì)胞肺癌樣本中，ccar1s/ccar1l比例較之正常對照組顯著升高，針對60例樣本的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：該結(jié)果具有顯著性。

綜上所述：在非小細(xì)胞肺癌的臨床樣本中，srsf5的蛋白水平和乙酰化srsf5的蛋白水平均顯著上調(diào)，同時(shí)可變剪接中關(guān)鍵成分剪接因子srsf5的蛋白表達(dá)水平和乙?；痵rsf5的蛋白水平均與ccar1短形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1s)的比例呈正相關(guān)。

實(shí)施例2、抑制srsf5表達(dá)的物質(zhì)在治療非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用

一、敲低srsf5細(xì)胞及其相關(guān)回轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

1、敲低srsf5細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定

(1)敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒

將sh-srsf5-1插入plko.1puro慢病毒載體(載體購自addgene,#8453)的agei和ecori位點(diǎn)間，得到敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1；

將sh-srsf5-2插入plko.1puro慢病毒載體(載體購自addgene,#8453)的agei和ecori位點(diǎn)間，得到敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#2；

將對照序列shrna插入plko.1puro慢病毒載體的agei和ecori位點(diǎn)間，得到對照質(zhì)粒。shrna序列如下：

sh-srsf5-1：gagaaggacgtggaaagatt(序列1)；

sh-srsf5-2：gacggataagagatattgatct(序列2)；

control(對照序列shrna)：ttctccgaacgtgtcacgtat。

(2)慢病毒包裝和純化

將步驟(1)中構(gòu)建的敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1、敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#2和對照質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝和純化，形成包被有敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1、敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#2和對照質(zhì)粒的病毒濃縮液。具體步驟如下：

1)293t細(xì)胞(上海博谷生物公司，cbp60439)復(fù)蘇后1:3傳代2次，隨后鋪至60mm培養(yǎng)皿；

2)18小時(shí)后換液，維持細(xì)胞最佳生長狀態(tài)6-8小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染具體步驟如下：

將敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1、包裝質(zhì)粒pspax2(biovector，biovector10581-52，下同)和pmd2.g(biovector10581-53，下同)按照質(zhì)量比為1:3:4的比例共同導(dǎo)入293t細(xì)胞中；

將敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#2、包裝質(zhì)粒pspax2和pmd2.g按照質(zhì)量比為1:3:4的比例共同導(dǎo)入293t細(xì)胞中；

將對照質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pspax2和pmd2.g按照質(zhì)量比為1:3:4的比例共同導(dǎo)入293t細(xì)胞中。

3)12h后換液完全培養(yǎng)基：隨后于24、48、72小時(shí)后收取病毒上清；

4)收集齊上清后，用0.45μm孔徑無菌濾器過濾；將病毒上清利用超濾管進(jìn)行濃縮(lenti-concentinvirusprecipitationsolution，excellbio)按照體積比為4:1的比例混勻，4℃靜置至少12h，用冷凍離心機(jī)3000g，30min，4℃；

5)棄上清液，收集沉淀；用pbs對沉淀進(jìn)行重懸(按照體積比為1:100的濃縮比例)，得到包被有敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1、敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#2和對照質(zhì)粒的病毒濃縮液。-80℃冰箱保存。

(3)感染目的細(xì)胞

分別將包被有敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒#1，#2和對照質(zhì)粒的病毒濃縮液感染用f12k培養(yǎng)基(cellgro，10-025-cv)培養(yǎng)的目的細(xì)胞a549(購自atcc，貨號atcccrm-ccl-185)，感染比例控制在1:2-1:3之間，利用2μg/mlpuromycin篩選一周，得到敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#1、敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#2和對照細(xì)胞。

(4)敲低srsf5細(xì)胞的鑒定

利用westernblot檢測敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#1、敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#2和對照細(xì)胞的srsf5蛋白表達(dá)水平及長短兩種形式的ccar1l和ccar1s的蛋白表達(dá)水平。

srsf5的蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果如圖6。從圖中可以看出，敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#1和敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#2均已成功敲除srsf5。

長短兩種形式的ccar1l和ccar1s的表達(dá)水平檢測結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#1和敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#2中ccar1長形式可變剪切產(chǎn)物(ccar1l)的比例明顯提高。說明srsf5蛋白水平與ccar1短形式可變剪接產(chǎn)物(ccar1s)成正相關(guān)。

2、敲低srsf5細(xì)胞后相關(guān)回轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

(1)敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1l細(xì)胞株的構(gòu)建

1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將序列1所示的sh-srsf5-1插入pmko.1puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(載體購自addgene,#8452)的agei和ecori位點(diǎn)間，得到敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒；

將對照序列shrna插入pmko.1puro慢病毒載體的agei和ecori位點(diǎn)間，得到對照質(zhì)粒；

將序列3所示的ccar1l全長序列插入pqcxihhygro逆轉(zhuǎn)錄病毒(載體購自addgene,#33091)的noti和xhoi位點(diǎn)間，得到穩(wěn)定過表達(dá)ccar1l的表達(dá)質(zhì)粒。

2)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與純化

將步驟1)獲得的敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒、對照質(zhì)粒和穩(wěn)定過表達(dá)ccar1l的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和純化，分別得到包被有敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒、對照質(zhì)粒和穩(wěn)定過表達(dá)ccar1l表達(dá)質(zhì)粒的病毒濃縮液。具體方法同步驟1(2)中的1)。

3)感染目的細(xì)胞

考慮到篩選標(biāo)記的雙向性，首先分別用包被有敲低srsf5的表達(dá)質(zhì)粒、對照質(zhì)粒的病毒濃縮液感染a549細(xì)胞(感染比例調(diào)整為1:3)。48小時(shí)后，進(jìn)行敲低細(xì)胞株的首輪篩選(3ug/mlpuromycin，1周)。隨后將包被有穩(wěn)定過表達(dá)ccar1l的表達(dá)質(zhì)粒的病毒濃縮液感染至首輪篩選的陽性細(xì)胞(感染比例調(diào)整為1:2)。36小時(shí)后，將包被有ccar1l(挽救)的陽性細(xì)胞進(jìn)行二輪篩選(hygromycin，350mg/ml，2周)，最終得到敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1l細(xì)胞株。在病毒感染時(shí)可加入polybrene(8ug/ml)提高感染效率。

(2)敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1s細(xì)胞株的構(gòu)建

將序列4所示ccar1s全長序列插入pqcxihhygro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的noti和xhoi位點(diǎn)間，得到穩(wěn)定過表達(dá)ccar1s的表達(dá)質(zhì)粒。

將上述步驟(1)中的穩(wěn)定過表達(dá)ccar1l的表達(dá)質(zhì)粒替換為穩(wěn)定過表達(dá)ccar1s的表達(dá)質(zhì)粒，且保持其余步驟不變，得到敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1s細(xì)胞株。

二、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

將試驗(yàn)用balb/c裸鼠(雄性，5-6周齡大小，18.0±2.0g)飼養(yǎng)于spf級動(dòng)物房，待小鼠適應(yīng)spf環(huán)境后，利用隨機(jī)分組的原則分成兩組，根據(jù)處理方式不同分為如下各組：

1、對照組

將步驟一的1中制備的對照細(xì)胞(3×10⁶/ml)和matrigel(bdbioscience，#356234)按照體積比為0.25：1的比例混勻，得到對照體系；并將100ul對照體系皮下注射于裸鼠的腋窩處。

2、敲低srsf5組

將步驟一的1中制備的敲低srsf5的穩(wěn)定細(xì)胞系#1(3×10⁶/ml)和matrigel按照體積比為0.25：1的比例混勻，得到敲低srsf5體系；并將100ul敲低srsf5體系皮下注射于裸鼠的腋窩處。

3、敲低srsf5組并回轉(zhuǎn)ccar1l組

將步驟一的2中制備的敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1l細(xì)胞株(3×10⁶/ml)和matrigel按照體積比為0.25：1的比例混勻，得到敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1l體系；并將100ul敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1l體系皮下注射于裸鼠的腋窩處。

4、敲低srsf5組并回轉(zhuǎn)ccar1s組

將步驟一的2中制備的敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1s細(xì)胞株(3×10⁶/ml)和matrigel按照體積比為0.25：1的比例混勻，得到敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1s體系；并將100ul敲低srsf5并回轉(zhuǎn)ccar1s體系皮下注射于裸鼠的腋窩處。

注射后7-10天對照組出現(xiàn)腫瘤，利用游標(biāo)卡尺每周兩次對腫瘤大小進(jìn)行測量，腫瘤的大小計(jì)算方法遵循以下公式l×w²×0.52(l代表最大直徑，w代表最小直徑)。35-40天后，裸鼠麻醉處死，隨后切割實(shí)體瘤進(jìn)行稱重和記錄，并利用多聚甲醛進(jìn)行固定，后續(xù)he染色確定腫瘤的組織形態(tài)以區(qū)分癌和癌旁組織。腫瘤組織通過福爾馬林固定16小時(shí)后，按照經(jīng)典石蠟包埋法進(jìn)行處理并進(jìn)行石蠟切片，隨后利用tunel實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞原位凋亡情況，相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法參照promegadeadend^tmcolorimetrictunelsystem試劑盒說明書。上述石蠟切片步驟：

1)將固定好的腫瘤組織修塊后放入包埋盒中，按照70％、80％、90％i、90％ii、95％i、95％ii，100％i、100％ii梯度脫水，時(shí)間分別為10min，10min，8min，8min，5min，5min，3min，3min；

2)在二甲苯中透明化組織：二甲苯i、ii各10min；

3)浸蠟：蠟i、蠟ii各20min；

4)利用leica石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，按照蠟-組織-蠟的步驟；

5)按照3.5μm厚度進(jìn)行切片；

6)經(jīng)過展片機(jī)展平并在烘片機(jī)上拷片6小時(shí)以上，長期保存可置于4℃，使用前在60℃過夜烘干。

腫瘤體積和重量的檢測結(jié)果表明：和對照組相比，敲低srsf5組的裸鼠腫瘤的體積明顯減小(圖8)，重量明顯減輕(圖9)。tunel實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明：腫瘤細(xì)胞原位凋亡比例明顯增加(圖10)。進(jìn)一步，在敲低srsf5的水平基礎(chǔ)上回轉(zhuǎn)ccar1l和ccar1s發(fā)現(xiàn)，當(dāng)且僅當(dāng)回轉(zhuǎn)ccar1s后，裸鼠成瘤體積變大(圖11)，重量增加(圖12)，腫瘤細(xì)胞原位凋亡比例減少(圖13)。說明srsf5蛋白是通過調(diào)控細(xì)胞中ccar1可變剪接產(chǎn)物含量進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長。

序列表

<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所

<120>一種肺癌調(diào)節(jié)因子srsf5及其抑制劑與應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>20bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagaaggacgtggaaagatt20

<210>2

<211>22bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gacggataagagatattgatct22

<210>3

<211>3453bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atggctcaatttggaggacagaagaatccgccatgggctactcagtttacagccactgca60

gtatcacagccagctgcactgggtgttcaacagccatcactccttggagcatctcctacc120

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<210>4

<211>2167bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atggctcaatttggaggacagaagaatccgccatgggctactcagtttacagccactgca60

gtatcacagccagctgcactgggtgttcaacagccatcactccttggagcatctcctacc120

atttatacacagcaaactgcattggcagcagcaggccttaccacacaaactccagcaaac180

tatcagttaacacaaactgctgcattgcagcaacaagccgcagctgcagcagctgcatta240

caacagcaatattcacaacctcagcaggccctgtatagtgtgcaacaacagttacagcaa300

ccccagcaaaccctcttaacacagccagctgttgcactgcctacaagccttagcctgtct360

actcctcagccaacagcacaaataactgtatcatatccaacaccaaggtccagtcaacag420

caaacccagcctcagaagcagcgtgttttcacaggggtggttacaaaactacatgatacg480

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cctcctgttcgtatagtttcacagccacaaccggcacgacgattagatcccccatcccga900

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