本發(fā)明屬于生物組織工程領域，具體涉及一種時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架及其制備方法。

背景技術：
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在組織工程策略中，支架可以支持細胞在三維空間中構建新生組織，是組織再生的重要影響因素。許多人體器官是管狀的，如血管、食道、腸、膽管、輸尿管等等，當這些器官組織受到損傷時，多數(shù)情況下，需要使用管狀支架作為假體，進行組織重建。另外，對于自體管狀器官狹窄病變而引起的疾病，如血管狹窄等，可以使用管狀支架作為支撐物，拓寬狹窄區(qū)域，保持血流通暢；對于外周神經的缺損修復，也可以使用管狀支架作為導管，橋連受損神經，達到神經修復再生的目的。然而，制備管狀支架的材料，如天然類的脫細胞組織、聚多糖、聚氨基酸或者合成類的聚酯、聚醚、聚多醇、聚烴等材料本身不具有生物活性，只是簡單的為組織再生提供空間上的支持，在一定程度上，導致組織修復的能力與效果不佳。比如，選擇商品化的脫細胞小腸粘膜(SIS)材料進行尿道重建，成功率在80％左右，并可能伴有尿道狹窄的并發(fā)癥。因此，將管狀支架與功能分子相結合，制備可以控制釋放一種或者多種功能分子的管狀支架，具有重要意義。功能分子可以是諸如蛋白質、多肽、氨基酸、生長因子、激素、抗生素、抗腫瘤藥物、抗增殖藥物等等可以促進或者抑制細胞生長、引導細胞遷移分化的天然分子或者合成藥物。在組織修復的不同時間段，需要不同的功能分子，多種功能分子共同作用，可以有效調控組織的再生過程。所以，制備負載多種功能分子的管狀支架，實現(xiàn)支架中功能分子的時序性緩釋，尤為重要。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架及其制備方法。

本發(fā)明的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，其特征在于，

管狀組織工程支架的管壁包括層疊的五層，即第一材料層、第二材料層、第三材料層、第四材料層和第五材料層；

所述的第一材料層為生物可吸收材料制成的納米纖維層，在納米纖維層中負載有功能分子；

所述的第二材料層為基底膜層，選自生物可吸收材料制成的基底膜層；

所述的第三材料層為生物可吸收材料制成的微球層，微球層中負載有與第一材料層不同的功能分子；

所述的第四材料層為基底膜層，選自生物可吸收材料制成的基底膜層；

所述的第五層為生物可吸收材料制成的納米纖維層，在納米纖維層中負載有功能分子。

所述的生物可吸收材料可以為可降解聚酯材料，如乙交酯、丙交酯、己內酯、三亞甲基碳酸內酯、對二氧六環(huán)己烷酮為原料通過均聚或共聚制備得到的系列合成材料，或者可以為脫細胞基質、明膠、膠原、絲蛋白、多糖等天然材料。

基底膜層的厚度優(yōu)選為0.5mm～1.0mm。

所述的納米纖維層優(yōu)選是在基底膜層進行靜電紡絲，使得在基底膜層的一側復合負載功能分子的納米纖維層，納米纖維層厚度小于1μm。

所述的生物可吸收材料制成的微球層，微球直徑為0.1μm～100μm，微球層復合于基底膜層的另一側。

所述的功能分子可以為層連粘蛋白、纖連蛋白、鈣黏蛋白等蛋白質；RGD、IKVAV、YIGSR等多肽；表皮生長因子、血管內皮生長因子、神經生長因子等生長因子；生長激素、甲狀腺素等調控細胞生長行為的激素；青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗生素；阿霉素、紫杉醇、絲裂霉素C、氟尿嘧啶等抑制細胞生長抗腫瘤藥物；咪康唑、阿莫羅芬、環(huán)吡酮等抗菌劑；曲馬多、哌替啶、卡馬西平等止痛劑；水楊酸、布洛芬等消炎劑；依那西普、地西泮、三唑侖等拮抗劑等等。

本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術，其有益效果如下：

1.本發(fā)明在同一個組織工程管狀支架中實現(xiàn)了兩種功能分子的負載。并且，通過控制支架材料的化學組成與分子量，從而調控支架的降解速率，達到支架外靜電紡絲層首先釋放功能分子，而支架管壁內部的微球隨著管壁的降解滯后釋放功能分子，實現(xiàn)多功能分子的時序性釋放。

2.管壁表面的納米纖維層，具有模仿細胞外基質的納米纖維結構，有利于細胞的生長與組織的再生。

附圖說明：

圖1是基底膜層為由可降解聚酯材料制成的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架外貌圖；

圖2是基底膜層為由體內可吸收的天然材料制成的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架外貌圖；

圖3是時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架內部的負載有功能分子的微球電鏡圖片

圖4是時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架表面的納米纖維層；

圖5是時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架的表面納米纖維層負載生長因子的累計釋放曲線

圖6是時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架的管壁內部微球層負載的藥物的累計釋放曲線。

圖7是時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架的管壁截面圖；

其中1、第五材料層；2、第四材料層；3、第三材料層；4、第二材料層；5、第一材料層。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

將1.0g的PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)溶解于20mL的氯仿中，溶劑揮發(fā)后制備得到PLGA基底膜層。將100μg表皮生長因子(EGF)與1.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于質量分數(shù)為5％的明膠/六氟異丙醇溶液中，裝入注射泵，流速為0.5mL/h，以PLGA基底膜層作為接收物，設置針頭與接收裝置距離為15cm，電位差為15kV，進行靜電紡絲，在基底膜層的一側制備納米纖維層，納米纖維層負載有表皮生長因子(EGF)與牛血清蛋白(BSA)。納米纖維層微觀結構如圖4所示。

采用單乳液揮發(fā)法制備聚乳酸(PLA)載藥微球，稱取200mg的PLA和1.0mg的絲裂霉素C溶于10mL二氯甲烷溶液后，攪拌緩慢注入100mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超聲分散后，溶劑減壓揮發(fā)，清洗干燥，得到負載藥物絲裂霉素C的PLA微球。微球的微觀形貌如圖3所示。

將負載藥物絲裂霉素C的PLA微球分散于PLGA基底膜層另一側，然后將兩張基底膜層復合(微球層在內，納米纖維層在外)，將復合后的基底膜卷曲黏合成管狀，得到時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，外形如圖1所示。

時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架的結構如圖7所示，其從外到內包括層疊的五層，即第一材料層(納米纖維層)5、第二材料層(基底膜層)4、第三材料層(微球層)3、第四材料層(基底膜層)2和第五材料層(納米纖維層)1。

納米纖維層的厚度小于1μm，基底膜層的厚度為0.5mm～1.0mm，微球直徑為0.1μm～100μm。

實施例2：

將500g的聚己內酯(PCL)粒料加入吹膜機制備PCL基底膜層。將100μg的短肽(IKVAV)與1.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于質量分數(shù)為3％的聚乳酸PLA溶液中，裝入注射泵，流速為0.5mL/h，以PCL基底膜層作為接收物，設置針頭與接收裝置距離為15cm，電位差為15kV，進行靜電紡絲，在基底膜層的一側制備納米纖維層，納米纖維層負載有短肽(IKVAV)和牛血清蛋白(BSA)。

采用噴霧干燥法制備PLA載藥微球。稱取500mg的PLA和3.0mg的五氟尿嘧啶溶于30mL二氯甲烷溶液后，攪拌緩慢注入300mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超聲分散乳化后，選擇口徑為0.5mm的噴嘴，加料速率2mL/min，進風量為500NL/h，入口溫度為45℃，在基底膜層的另一側制備負載五氟尿嘧啶的微球層。

將兩張基底膜層(一層復合有納米纖維層，另外一層復合有微球層的基底膜層)復合(微球層在內，納米纖維層在外)，將復合后的基底膜層卷曲黏合成管狀，得到時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，外形如圖1所示。

納米纖維層的厚度小于1μm，基底膜層的厚度為0.5mm～1.0mm，微球直徑為0.1μm～100μm。

實施例3：

采用冷凍干燥法制備明膠基底膜層。5.0g明膠溶解于40mL水溶液中，加入交聯(lián)劑后，將溶液旋涂成膜。所得明膠膜迅速至于-40℃環(huán)境中冷凍4h，-20℃冷凍干燥12h，得到明膠基底膜層。將200μg表皮生長因子(EGF)與2.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于質量分數(shù)為5％的明膠/六氟異丙醇溶液中，裝入注射泵，流速為0.5mL/h，以明膠基底膜層作為接收物，設置針頭與接收裝置距離為15cm，電位差為15kV，進行靜電紡絲，在基底膜層的一側制備納米纖維層，納米纖維層負載有表皮生長因子(EGF)與牛血清蛋白(BSA)。

采用單乳液揮發(fā)法制備聚己內酯(PCL)載藥微球，稱取500mg的PCL和2.5mg的絲裂霉素C溶于20mL二氯甲烷溶液后，攪拌緩慢注入100mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超聲分散后，溶劑減壓揮發(fā)，清洗干燥，得到負載藥物絲裂霉素C的PCL微球。

將負載藥物絲裂霉素C的PCL微球分散于明膠基底膜層另一側，然后將兩張基底膜層復合(微球層在內，納米纖維層在外)，將復合后的基底膜卷曲黏合成管狀，得到時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，外形如圖2所示。

實施例4：

將實施例3制備得到的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架置于1mL塑料試管中，加入500μL的PBS緩沖液，37℃，搖床40rpm條件下模擬體內環(huán)境進行功能分子釋放實驗；每隔一段時間取樣，取樣時將500μL的PBS緩沖液全部取出，更換500μL新鮮PBS緩沖液。時間點為1d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d。用Elisa試劑盒檢測樣品中EGF的釋放含量；于358nm處測定紫外吸收，并結合MMC(絲裂霉素C)標準曲線計算MMC的釋放含量。

對于納米纖維層中EGF的釋放，結果如圖5所示，在三周內，時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架皆可緩釋一定量的活性EGF，且在釋放初期，并未出現(xiàn)明顯暴釋現(xiàn)象，三周累積釋放量約為24.2ng。

對于時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架中MMC的釋放，如圖6所示，體現(xiàn)為藥物的延遲釋放，即在釋放初期，藥物緩釋速率較小，而達到某一時間點時，藥物釋放的速率明顯增加。對于低度交聯(lián)(25％)的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架主體部分9天左右即基本降解，這使得時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架中藥物釋放的延遲效應并不明顯；對于中度交聯(lián)(50％)的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，其降解時間延長至21天，此時，時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架中載藥微球的釋放行為表現(xiàn)出明顯的延遲，即在釋放的前6天，藥物緩釋速率較低，累積釋放量僅有7％左右，而在接下來的時間內，藥物緩釋速率明顯提高，第21天時，累積釋放量達到45％左右；對于高度交聯(lián)(65％左右)的時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架，時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架的降解時間延長至21天以上，此時序性控制釋放多功能分子的管狀組織工程支架中藥物釋放行為與前組相似，也表現(xiàn)出明顯的延遲，但與前組不同的是，藥物緩釋速率的增加約發(fā)生在釋放的第9天。

管狀支架中兩種功能分子的釋放表現(xiàn)為，負載于管壁納米纖維表層的EGF首先釋放，而負載于管壁內部的藥物隨著支架的降解可控延遲釋放，整體實現(xiàn)時序性控制釋放兩種功能分子。