本發(fā)明屬于絲素蛋白化妝品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種載有活性成分的絲素蛋白/HA(透明質(zhì)酸)復(fù)合微球凍干粉，還涉及了該復(fù)合微球凍干粉的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熊果苷、維生素C、果酸等是當(dāng)今公認(rèn)比較安全有效的水溶性美白抗衰原料，在不影響細(xì)胞增殖的同時，能有效地抑制皮膚中的酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，減緩皮膚的衰老。而且對黑色素細(xì)胞不產(chǎn)生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同時還有殺菌、消炎的作用。神經(jīng)酰胺系為神經(jīng)鞘糖脂中的一種，是一種水溶性脂質(zhì)物質(zhì)，可以改善角質(zhì)層的保水及屏障功能，解決皮膚干燥、皺紋、粗糙現(xiàn)象，是一種常見的保濕劑。中國專利CN103251515A(申請?zhí)枺?01310156108.5，專利名稱：一種皮膚美白組合物，公開號：103251515)報道了一種將熊果苷和白藜蘆醇用于皮膚美白組合物中；日本專利CN101583345(申請?zhí)枺?00780040739.3，專利名稱：神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑、化妝品、皮膚外用劑、抗老化方法和皺紋改善方法，公開號：101583345)公開了美露香株式會社將神經(jīng)酰胺合成促進(jìn)劑作為化妝品和皮膚外用劑中。這些活性成分自身穩(wěn)定性差，受外界干擾易失活，例如在光及周圍環(huán)境不合適的條件下容易分解，在空氣中也容易氧化，缺少儲存的穩(wěn)定性，因此在化妝品應(yīng)用中受到了一定的限制。

絲素蛋白壁材與人體肌膚構(gòu)成相近，和人體皮膚具有極強(qiáng)的親和力、安全性和良好的生物相容性，蠶絲蛋白中包含18種氨基酸和多種微量元素，都是人體皮膚所需要的重要成分，通過有效補(bǔ)充，能增進(jìn)皮膚細(xì)胞的活力，防止皮膚老化并促進(jìn)新陳代謝，是提高美白效果的最優(yōu)秀的天然纖維蛋白。

目前已有一些絲素蛋白微囊技術(shù)用于包封化妝品活性成分的報道，由單一的絲素蛋白制備的微囊機(jī)械性能較差，包載在微囊中的化妝品活性成分容易突釋，雖然絲素蛋白微囊經(jīng)凍干后可以方便它的儲存，但凍干后的絲素蛋白微囊復(fù)溶時間較長、易發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致其穩(wěn)定性變差。因此，絲素蛋白在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

透明質(zhì)酸(又稱玻尿酸、HA)是存在于生物組織中細(xì)胞外基質(zhì)中的一種酸性黏多糖，是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復(fù)交替連接構(gòu)成的線性大分子黏多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解及高黏彈性，具有特殊的保水作用，被稱為理想的天然保濕因子，并能與細(xì)胞表面某些特異受體專一性結(jié)合，其中皮膚中就含有大量的透明質(zhì)酸。本發(fā)明使用透明質(zhì)酸修飾絲素蛋白微囊，不僅能夠提高微囊的保濕效果，還能提高絲素蛋白微囊的機(jī)械性能，并縮短絲素蛋白微囊凍干粉復(fù)溶時間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，其機(jī)械性能好，且可提高化妝品活性成份的穩(wěn)定性，解決了現(xiàn)有包封活性成分的絲素蛋白微囊機(jī)械性能較差、易突釋、活性成分穩(wěn)定性較差和其凍干粉復(fù)溶時間長的問題。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉的應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的第一個技術(shù)方案是，一種載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，按照質(zhì)量百分比包括以下組分：絲素蛋白10％～50％，化妝品活性成份10％～20％，透明質(zhì)酸10％～20％，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)5％～13％，凍干保護(hù)劑20％～40％，水1％～4％，以上各組分的質(zhì)量總和是100％。

其中，化妝品活性成份包括美白活性成份和保濕活性成份，美白活性成份為熊果苷、維生素C或果酸中的一種或幾種的任意比例混合物，保濕活性成份為神經(jīng)酰胺。

優(yōu)選地，凍干保護(hù)劑由質(zhì)量比為1:1的海藻糖與甘露醇復(fù)配而成。

優(yōu)選地，上述復(fù)合微球的粒徑小于450nm。

本發(fā)明采用的第二個技術(shù)方案是，上述載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，制備絲素蛋白；

步驟2，制備包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球；

按照質(zhì)量百分比稱取以下各原料組分：絲素蛋白50％～82％，化妝品活性成份20％～46％，以上各原料組分的質(zhì)量總和是100％；

先將絲素蛋白完全溶解于部分水中，化妝品活性成份完全溶解于剩余水中；然后將溶解化妝品活性成份的溶液加入到絲素蛋白水溶液中，使化妝品活性成份與絲素蛋白混合均勻，得到原料液；在攪拌條件下，將乙醇溶液滴加到原料液中，得到混合溶液；然后將混合溶液冷凍，并轉(zhuǎn)到室溫放置后得到懸浮液，將懸浮液離心，收集固體部分，即得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球。

步驟3，制備包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉；

按照質(zhì)量百分比稱取以下各原料組分：絲素蛋白10％～50％，化妝品活性成份10％～20％，透明質(zhì)酸10％～20％，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)5％～13％，凍干保護(hù)劑20％～40％，水1％～4％，以上各組分的質(zhì)量總和是100％。

先把透明質(zhì)酸配制成透明質(zhì)酸水溶液，再把包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球分散到透明質(zhì)酸水溶液中，得到混合溶液；在攪拌條件下，把EDC滴加到混合溶液中，得到混懸液；然后將混懸液離心，收集固體部分，把固體部分分散到水中，超聲并過膜，得到復(fù)合微球的混懸液；最后把凍干保護(hù)劑加入到復(fù)合微球混懸液中，攪拌均勻后，進(jìn)行冷凍干燥，得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉。

其中，步驟1中絲素蛋白的制備方法為：首先，按照蠶絲和0.01～0.1mol/L碳酸鈉溶液的質(zhì)量比為1:10～1:5的比例，把蠶絲加入到100℃的碳酸鈉溶液中，加熱后在90～100℃去離子水中煮30min，將煮好的蠶絲在35℃下真空干燥20min，得到脫膠蠶絲；然后，把脫膠蠶絲加入到三元體系CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O中，在70～80℃溫度下保溫2h，然后離心，得到絲素蛋白溶液；最后，將絲素蛋白溶液放入纖維素透析袋中在4℃去離子水中透析7d，透析好的絲素蛋白溶液在-80℃預(yù)凍15h后，置于真空度＜80mT的凍干機(jī)中，-50℃冷凍干燥24h后取出，得到絲素蛋白。

其中，步驟2中乙醇溶液與原料液的體積比為1:4。

優(yōu)選地，步驟3中透明質(zhì)酸的分子量為30～50kD；步驟3中，EDC與混合溶液的體積比為1:5。

優(yōu)選地，絲素蛋白溶液真空冷凍干燥參數(shù)為：先置于-80℃預(yù)凍15h，再于真空度＜80mT，-50℃條件下冷凍干燥24h。

本發(fā)明的第三個技術(shù)方案是，上述包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉在化妝品中的應(yīng)用。

制備霜狀、乳液狀的化妝品時，可將上述包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉直接加入化妝品中；而制備面膜及水劑化妝品時，需要先將包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉用水復(fù)溶后再加入化妝品中。

上述包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉在化妝品中的添加量為0.2％～10％。

本發(fā)明的有益效果是，(1)本發(fā)明使用透明質(zhì)酸修飾絲素蛋白微囊，從而提高絲素蛋白微囊的機(jī)械性能減少突釋，并縮短絲素蛋白微囊凍干粉復(fù)溶時間。(2)本發(fā)明將透明質(zhì)酸作為一種壁材制備微囊，其微囊本身就具有保濕性能。(3)本發(fā)明將化妝品活性成份包載在絲素蛋白和透明質(zhì)酸中，并制備成納米級微球，可以有效的提高化妝品活性成份的穩(wěn)定性，也增大了其透皮吸收性能，皮膚吸收絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球后，包載化妝品活性成份的復(fù)合微球可以在皮膚中緩慢釋放有效成分，達(dá)到長期美白保濕等的功效。

附圖說明

圖1是實施例1的復(fù)合微球凍干粉的粒徑圖；

圖2是實施例2的復(fù)合微球凍干粉的粒徑圖；

圖3是實施例3的復(fù)合微球凍干粉的粒徑圖；

圖4是復(fù)合微球凍干粉的緩釋圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于這些實施方式。

本發(fā)明的載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉按照質(zhì)量百分比包括以下組分：絲素蛋白10％～50％，化妝品活性成份10％～20％，透明質(zhì)酸10％～20％，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)5％～13％，凍干保護(hù)劑20％～40％，水1％～4％，以上各組分的質(zhì)量總和是100％。其中，化妝品活性成份包括美白活性成份和保濕活性成份，美白活性成份為熊果苷、維生素C或果酸中的一種或幾種的任意比例混合物，保濕活性成份為神經(jīng)酰胺。

優(yōu)選地，凍干保護(hù)劑由質(zhì)量比為1:1的海藻糖與甘露醇復(fù)配而成。

優(yōu)選地，上述復(fù)合微球的粒徑小于450nm。

該載有活性成分的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉的制備方法如下：

步驟1，制備絲素蛋白；

絲素蛋白可以通過市場購買得到，也可按照以下方法制備得到：首先，按照蠶絲和0.01～0.1mol/L碳酸鈉溶液的質(zhì)量比為1:10～1:5的比例，把蠶絲加入到100℃的碳酸鈉溶液中，加熱后在90～100℃去離子水中煮30min，將煮好的蠶絲在35℃下真空干燥20min，得到脫膠蠶絲；然后，把脫膠蠶絲加入到三元體系CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O(1:2:8)中，在70～80℃溫度下保溫2h，然后離心，得到絲素蛋白溶液；最后，將絲素蛋白溶液放入纖維素透析袋中在4℃去離子水中透析7d，透析好的絲素蛋白溶液在-80℃預(yù)凍15h后，置于真空度＜80mT的凍干機(jī)中，-50℃冷凍干燥24h后取出，得到絲素蛋白。

步驟2，制備包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球；

按照質(zhì)量百分比稱取以下各原料組分：絲素蛋白50％～82％，化妝品活性成份20％～46％，以上各原料組分的質(zhì)量總和是100％；

先將絲素蛋白完全溶解于部分水中，化妝品活性成份完全溶解于剩余水中；然后將溶解化妝品活性成份的溶液加入到絲素蛋白水溶液中，使化妝品活性成份與絲素蛋白混合均勻，得到原料液；在400～700rpm攪拌條件下，將乙醇溶液以2.5-3mL/min的速度滴加到原料液中，得到混合溶液；其中，乙醇溶液與原料液的體積比為1:4；然后把混合溶液在-20℃溫度下冷凍1～2h，轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)放置2～5h后得到懸浮液，將懸浮液離心，收集固體部分，即得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球。

步驟3，制備包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉；

按照質(zhì)量百分比稱取以下各原料組分：絲素蛋白10％～50％，化妝品活性成份10％～20％，透明質(zhì)酸10％～20％，1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)5％～13％，凍干保護(hù)劑20％～40％，水1％～4％，以上各組分的質(zhì)量總和是100％。

先把分子量為30～50kD的透明質(zhì)酸配制成濃度為1％的透明質(zhì)酸水溶液；把包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球分散到透明質(zhì)酸水溶液中，超聲使二者混勻，得到混合溶液；在攪拌條件下，把EDC以3-4.5mL/min的速度滴加到混合溶液中，得到混懸液；其中，EDC與混合溶液的體積比為1:5。然后將混懸液離心，收集固體部分，把固體部分分散到水超聲并過0.45μm膜，得到復(fù)合微球的混懸液；最后把凍干保護(hù)劑加入到復(fù)合微球混懸液中，攪拌均勻后，先置于-80℃預(yù)凍24h，再于真空度＜80mT，-50℃條件下冷凍干燥24h，得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉。

本發(fā)明將化妝品活性成份包載在絲素蛋白和透明質(zhì)酸中，并制備成納米級微球，可以有效的提高化妝品活性成份的穩(wěn)定性，也增大了其透皮吸收性能，皮膚吸收絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球后，包載化妝品活性成份的復(fù)合微球可以在皮膚中緩慢釋放有效成分，達(dá)到長期美白保濕等的功效。

本發(fā)明的包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉可以添加到化妝品中，起美白保濕功效。

制備霜狀、乳液狀化妝品時，將本發(fā)明復(fù)合微球凍干粉直接加入化妝品中；制備面膜及水劑化妝品時，需要先將本發(fā)明復(fù)合微球凍干粉用水復(fù)溶后再加入化妝品中。本發(fā)明復(fù)合微球凍干粉在化妝品中的添加量為0.2％～10％。

實施例1

本實施例制備了一種包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，制備方法如下：

步驟1，制備絲素蛋白：

步驟1-1，把30.00g蠶絲加入到100mL 100℃的0.02mol/L碳酸鈉溶液中，加熱25min后再在95℃去離子水中煮30min，將煮好的蠶絲在35℃下真空干燥20min，得到脫膠蠶絲。

步驟1-2，把脫膠蠶絲加入到三元體系CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O中，CaCl₂、C₂H₅OH、H₂O的摩爾比為1:2:8，在75℃溫度下保溫2h，然后在離心力1.35×10⁴g下離心9min，得到絲素蛋白溶液。

步驟1-3，將絲素蛋白溶液放入纖維素透析袋中在4℃去離子水中透析7d，透析好的絲素蛋白溶液在-80℃預(yù)凍15h后，置于真空度＜80mT的凍干機(jī)中，-50℃冷凍干燥24h后取出，得到絲素蛋白。

步驟2，制備包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球：

步驟2-1，先將3g絲素蛋白溶于水中得到濃度為50mg/mL絲素蛋白水溶液，再把0.6g熊果苷和0.9g神經(jīng)酰胺溶于30mL蒸餾水后，將其加入到絲素蛋白水溶液中，在300rpm下磁力攪拌5min，使化妝品活性成份與絲素蛋白混合均勻，得到原料液。

步驟2-2，在500rpm磁力攪拌下，把乙醇溶液以55滴/min的速度逐滴加入到含有化妝品活性成份的絲素蛋白溶液中，乙醇溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1:4，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌6min，得到混合溶液。

步驟2-3，把混合溶液在-20℃溫度下冷凍2h，轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)放置3h后得到懸浮液，將懸浮液在6000rpm下離心15min，除去乙醇溶液，收集固體部分，得到包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球。

步驟3，制備包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉：

步驟3-1，先把1.5g分子量為40kD粉末狀的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，不停攪拌使之分散均勻，配制成濃度為1％的透明質(zhì)酸水溶液。

步驟3-2，把包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球分散到1％的透明質(zhì)酸水溶液中，超聲5min使其混合均一得到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液。

步驟3-3，在800rpm磁力攪拌下，把交聯(lián)劑1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)溶液以3.5mL/min的速度逐滴加入到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液中，使絲素蛋白與透明質(zhì)酸進(jìn)行交聯(lián)，EDC添加量與透明質(zhì)酸和絲素蛋白質(zhì)量和的比為1:5，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌10min，得到含有包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的混懸液。

步驟3-4，將該混懸液在5000rpm下離心10min，收集固體部分，得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球。

步驟3-5，把復(fù)合微球分散到30mL蒸餾水中，超聲5min，過0.45μm的膜2次，得到含有粒徑小于450nm復(fù)合微球的混懸液。

步驟3-6，把凍干保護(hù)劑加入到制備好的含有復(fù)合微球的混懸液中，攪拌均勻后，置于-80℃預(yù)凍24h，再進(jìn)行真空冷凍干燥，得到包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉。

本實施例制得的包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，其組分按照質(zhì)量百分比為：絲素蛋白29.70％，熊果苷5.94％，神經(jīng)酰胺8.91％，透明質(zhì)酸14.85％，EDC8.91％，凍干保護(hù)劑29.70％，蒸餾水1.98％。

對復(fù)合微球進(jìn)行粒徑分析，把復(fù)合微球凍干粉復(fù)溶后測定其粒徑，該包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的粒徑為390±80nm，從得到的粒徑圖1可以得出大部分的微囊粒徑為390nm。

本實施例將制備的包載熊果苷和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉添加到霜膏中，使用均質(zhì)機(jī)在19000rpm條件下均質(zhì)10min后，得到具有持續(xù)美白保濕功效的霜膏。

實施例2

本實施例制備了一種包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，制備方法如下：

步驟1，制備絲素蛋白

步驟1-1，把50.00g蠶絲加入到500mL 100℃的0.1mol/L碳酸鈉溶液中，加熱30min后再在100℃去離子水中煮30min，將煮好的蠶絲在35℃下真空干燥20min，得到脫膠蠶絲。

步驟1-2，把脫膠蠶絲加入到三元體系CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O中，CaCl₂、C₂H₅OH、H₂O的摩爾比為1:2:8，在80℃溫度下保溫2h，然后在離心力1.35×10⁴g下離心10min，得到絲素蛋白溶液。

步驟1-3，將絲素蛋白溶液放入纖維素透析袋中在4℃去離子水中透析7d，透析好的絲素蛋白溶液在-80℃預(yù)凍15h后，置于真空度＜80mT的凍干機(jī)中，-50℃冷凍干燥24h后取出，得到絲素蛋白。

步驟2，制備包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球：

步驟2-1，先將1g絲素蛋白溶于水中得到濃度為40mg/mL絲素蛋白水溶液，再把0.5g維生素C和0.5g神經(jīng)酰胺溶于30mL蒸餾水后，將其加入到絲素蛋白水溶液中，在300rpm下磁力攪拌5min，使化妝品活性成份與絲素蛋白混合均勻，得到原料液；

步驟2-2，在400rpm磁力攪拌下，把乙醇溶液以2.5mL/min的速度逐滴加入到含有化妝品活性成份的絲素蛋白溶液中，乙醇溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1:4，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌2min，得到混合溶液；

步驟2-3，把混合溶液在-20℃溫度下冷凍1h，轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)放置2h后得到懸浮液，將懸浮液在6000rpm下離心15min，除去乙醇溶液，收集固體部分，得到包載化妝品活性成份的絲素蛋白微球；

步驟3，制備包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉：

步驟3-1，先把0.5g分子量為50kD粉末狀的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，不停攪拌使之分散均勻，配制成濃度為0.5％的透明質(zhì)酸水溶液；

步驟3-2，把包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球分散到0.5％的透明質(zhì)酸水溶液中，超聲5min使其混合均一得到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液；

步驟3-3，在700rpm磁力攪拌下，把交聯(lián)劑1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)溶液以60滴/min的速度逐滴加入到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液中，使絲素蛋白與透明質(zhì)酸進(jìn)行交聯(lián)，EDC添加量與透明質(zhì)酸和絲素蛋白質(zhì)量和的比為1:5，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌8min，得到含有包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的混懸液；

步驟3-4，將該混懸液在5000rpm下離心10min，收集固體部分，得到包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球；

步驟3-5，把復(fù)合微球分散到30mL蒸餾水中，超聲5min，過0.45μm的膜2次，得到含有粒徑小于450nm復(fù)合微球的混懸液；

步驟3-6，把凍干保護(hù)劑加入到制備好的含有復(fù)合微球的混懸液中，攪拌均勻后，置于-80℃預(yù)凍24h，再進(jìn)行真空冷凍干燥，得到包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉。

本實施例制得的包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，其組分按照質(zhì)量百分比為：絲素蛋白20.20％，維生素C10.10％，神經(jīng)酰胺10.10％，透明質(zhì)酸10.10％，EDC 6.06％，凍干保護(hù)劑40.40％，蒸餾水3.03％。

對復(fù)合微球進(jìn)行粒徑分析，把復(fù)合微球凍干粉復(fù)溶后測定其粒徑，該包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的粒徑為380±100nm，從得到的粒徑圖2可以得出大部分的微囊粒徑為380nm。

本實施例將制備的包載維生素C和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉使用超純水復(fù)溶后添加到爽膚水配方中，得到具有持續(xù)美白保濕功效的爽膚水。

實施例3

本實施例制備了一種包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，制備方法如下：

步驟1，制備絲素蛋白

步驟1-1，把5.00g蠶絲加入到25mL 100℃的0.01mol/L碳酸鈉溶液中，加熱20min后再在90℃去離子水中煮30min，將煮好的蠶絲在35℃下真空干燥20min，得到脫膠蠶絲。

步驟1-2，把脫膠蠶絲加入到三元體系CaCl₂:C₂H₅OH:H₂O中，CaCl₂、C₂H₅OH、H₂O的摩爾比為1:2:8，在70℃溫度下保溫1.5h，然后在離心力1.35×10⁴g下離心8min，得到絲素蛋白溶液。

步驟1-3，將絲素蛋白溶液放入纖維素透析袋中在4℃去離子水中透析7d，透析好的絲素蛋白溶液在-80℃預(yù)凍15h后，置于真空度＜80mT的凍干機(jī)中，-50℃冷凍干燥24h后取出，得到絲素蛋白。

步驟2，制備包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球：

步驟2-1，先將5g絲素蛋白溶于水中得到濃度為60mg/mL絲素蛋白水溶液，再把0.67g熊果苷、0.4g果酸和0.6g神經(jīng)酰胺溶于30mL蒸餾水后，將其加入到絲素蛋白水溶液中，在300rpm下磁力攪拌5min，使化妝品活性成份與絲素蛋白混合均勻，得到原料液；

步驟2-2，在700rpm磁力攪拌下，把乙醇溶液以3mL/min的速度逐滴加入到含有化妝品活性成份的絲素蛋白溶液中，乙醇溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1:4，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌10min，得到混合溶液；

步驟2-3，把混合溶液在-20℃溫度下冷凍1.5h，轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)放置5h后得到懸浮液，將懸浮液在6000rpm下離心15min，除去乙醇溶液，收集固體部分，得到包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球；

步驟3，制備包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉：

步驟3-1，先把2.5g分子量為30kD粉末狀的透明質(zhì)酸溶解在去離子水中，不停攪拌使之分散均勻，配制成濃度為2％的透明質(zhì)酸水溶液；

步驟3-2，把包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球分散到2％的透明質(zhì)酸水溶液中，超聲5min使其混合均一得到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液；

步驟3-3，在900rpm磁力攪拌下，把交聯(lián)劑1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)溶液以90滴/min的速度逐滴加入到含有絲素蛋白微球的透明質(zhì)酸混合溶液中，使絲素蛋白與透明質(zhì)酸進(jìn)行交聯(lián)，EDC添加量與透明質(zhì)酸和絲素蛋白質(zhì)量和的比為1:5，滴加完室溫下繼續(xù)磁力攪拌15min，得到含有包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的混懸液；

步驟3-4，將該混懸液在5000rpm下離心10min，收集固體部分，得到包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球；

步驟3-5，把復(fù)合微球分散到30mL蒸餾水中，超聲5min，過0.45μm的膜2次，得到含有粒徑小于450nm復(fù)合微球的混懸液；

步驟3-6，把凍干保護(hù)劑加入到制備好的含有復(fù)合微球的混懸液中，攪拌均勻后，置于-80℃預(yù)凍24h，再進(jìn)行真空冷凍干燥，得到包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉。

本實施例制得的包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉，其組分按照質(zhì)量百分比為：絲素蛋白34.46％，熊果苷4.62％，果酸2.76％，神經(jīng)酰胺4.14％，透明質(zhì)酸17.23％，EDC 10.34％，凍干保護(hù)劑23.02％，蒸餾水3.45％。

對復(fù)合微球進(jìn)行粒徑分析，把復(fù)合微球凍干粉復(fù)溶后測定其粒徑，該包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球的粒徑為410±80nm，從得到的粒徑圖3可以得出大部分的微囊粒徑為410nm。

本實施例將制備的包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉添加到乳液配方中，使用均質(zhì)機(jī)在15000rpm/min條件下均質(zhì)15min后，得到具有持續(xù)美白保濕功效的乳液。

對本發(fā)明的凍干粉的各項性能進(jìn)行檢測。

按照實施例3中的步驟1和步驟2的條件進(jìn)行制備包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球，并將微球置于-80℃預(yù)凍24h，再進(jìn)行真空冷凍干燥，得到包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球凍干粉。

將包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球凍干粉(1^#)和絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉(2^#)進(jìn)行體外釋放測試。從圖4中可以看出使用透明質(zhì)酸修飾絲素蛋白微球后，可以提高其機(jī)械性能，故降低了其突釋效應(yīng)和延長了緩釋時間。

將包載熊果苷、果酸和神經(jīng)酰胺的絲素蛋白微球凍干粉(1^#)和絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉(2^#)中加入溶媒進(jìn)行復(fù)溶，具體結(jié)果見表1。

表1 1^#和2^#復(fù)溶時間比較(n＝3)

由結(jié)果可知，使用透明質(zhì)酸修飾絲素蛋白微球后可以縮短其凍干粉的復(fù)溶時間。

本發(fā)明還對包載了不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉進(jìn)行了功效評價。

受試對象：42位無皮膚敏感史的年齡在25～40歲的女性，測試期間志愿者隨機(jī)一側(cè)半臉使用測試產(chǎn)品，另外一側(cè)為空白區(qū)；

使用方法：先將包載不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉進(jìn)行復(fù)溶得到包載不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球懸浮液，將2～3滴該懸浮液涂抹到前臂內(nèi)側(cè)的試驗區(qū)，每天早晚各使用一次。連續(xù)使用8周。

測試時間：從第1天開始，每隔一周進(jìn)行一次皮膚測試，測試過程由皮膚科醫(yī)生全程監(jiān)控。

測試指標(biāo)：皮膚水分含量測試(Corneometer)、皮膚顏色測試(Chromameter)。

皮膚含水量測試采用德國CK公司CM825型水分測試儀接觸式連續(xù)測量方式進(jìn)行。皮膚顏色采用德國CK公司MEXAMETER MX18黑色素測定儀進(jìn)行測定。黑色素值通過儀器測出，平均測定3次取平均值，測量數(shù)值越高，說明皮膚中黑色素含量越高。

產(chǎn)品使用前、產(chǎn)品使用4周和8周后，對兩側(cè)臉頰區(qū)域進(jìn)行皮膚水分測試，結(jié)果見表2。

表2產(chǎn)品使用前、產(chǎn)品使用4周及8周后皮膚水分統(tǒng)計結(jié)果

由表2可見，與初始值相比，使用產(chǎn)品4周后，產(chǎn)品區(qū)與空白區(qū)水分含量分別顯著增加了6.11和1.08；使用產(chǎn)品8周后，產(chǎn)品區(qū)水分含量顯著增加了11.32，空白區(qū)未呈現(xiàn)顯著變化。

區(qū)域之間比較，產(chǎn)品使用4周和8周后，產(chǎn)品區(qū)水分含量均顯著性優(yōu)于空白區(qū)。結(jié)果表明，在連續(xù)使用包載不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉后，皮膚的含水量顯著性增高，被包載后的具有保濕功效的活性化妝品成份得到了保護(hù)。

產(chǎn)品使用前、產(chǎn)品使用4周和8周后，對兩側(cè)臉頰區(qū)域進(jìn)行皮膚顏色測試，結(jié)果見表3。

表3產(chǎn)品使用前、產(chǎn)品使用4周及8周后皮膚顏色統(tǒng)計結(jié)果

由表3可見，與初始值相比，使用產(chǎn)品4周后，產(chǎn)品區(qū)L^*值顯著增加了1.48，ITA^°值顯著增加了1.77；空白區(qū)L^*值無顯著性增加，ITA^°值無顯著性增加；使用產(chǎn)品8周后，產(chǎn)品區(qū)L^*值顯著增加了2.80，ITA^°值顯著增加了2.36；空白區(qū)L^*值無顯著性增加，ITA^°值無顯著性增加。

區(qū)域之間比較，產(chǎn)品使用4周和8周后，產(chǎn)品區(qū)L^*值和ITA^°值均有顯著性增加。結(jié)果表明，在連續(xù)使用包載不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉后，皮膚的L^*值和ITA^°值顯著增高，被包載后的具有美白功效的活性化妝品成份得到了保護(hù)。

功效實驗結(jié)果表明皮膚的綜合指標(biāo)均有顯著變化，因此，包載不同化妝品功效成份的絲素蛋白/透明質(zhì)酸復(fù)合微球凍干粉完全可以保護(hù)化妝品功效成份的活性，滿足多功能護(hù)膚用品的需要。

本發(fā)明以上描述只是部分實施例，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式。上述的具體實施方式是示意性的，并不是限制性的。凡是采用本發(fā)明的材料和方法，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，所有具體拓展均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。