本發(fā)明涉及殺菌領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合殺菌微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前常用的飲用水及飲料常用的殺菌方法分別為：熱殺菌和非熱殺菌。其中，熱殺菌主要有：濕熱殺菌、干熱殺菌、微波殺菌、電熱殺菌和電場殺菌等；非熱殺菌主要有：化學(xué)與生物殺菌、輻照殺菌、紫外線殺菌、脈沖殺菌、超高靜壓殺菌、脈沖電場(pef)殺菌以及振動(dòng)磁場殺菌等。熱殺菌又可分為高熱殺菌和低熱殺菌。高熱殺菌是利用高溫使微生物蛋白質(zhì)變性以達(dá)到殺菌的目的。雖然高熱殺菌的殺菌速度較快，殺菌也較為徹底，但往往會(huì)破壞液體飲料的營養(yǎng)及品質(zhì)。低熱殺菌最常見的是巴氏殺菌，也是目前最常用的液體食品殺菌技術(shù)，簡單方便。但其設(shè)備較為龐大，而且相比常溫殺菌還是需要較多的能耗?；瘜W(xué)殺菌是非熱殺菌中最常見的方法，也是目前飲用水殺菌的常規(guī)方法，其多利用氧化型殺菌劑產(chǎn)生的次氯酸、原子態(tài)氧等，使微生物體內(nèi)一些與代謝有密切關(guān)系的酶發(fā)生氧化作用而殺滅微生物。但氧化性殺菌劑有它不可克服的缺點(diǎn)：當(dāng)水源中有機(jī)物含量稍高，氯氣殺菌將產(chǎn)生氯代有機(jī)物，可致癌；穩(wěn)定性欠佳，易分解，運(yùn)輸貯藏成本高，并存在爆炸等潛在威脅。如果能開發(fā)一種價(jià)格經(jīng)濟(jì)、使用簡單、高效、安全的新型殺菌劑，不破壞營養(yǎng)成分的同時(shí)，無有害物質(zhì)殘留，而且無需過多專業(yè)知識(shí)即會(huì)使用，非但能改善現(xiàn)做飲料的衛(wèi)生狀況，還可以提高罐裝水和飲料的安全，成為提高水質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種復(fù)合殺菌微球及其制備方法，用來解決現(xiàn)有技術(shù)中可溶性殺菌劑殘留水體的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

1)以氯甲基化聚苯乙烯珠球(俗稱氯球)為母體，在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中浸泡過夜，使載體充分溶脹；

2)在步驟1)的所得物中加入配體5-巰基-1-甲基四唑(mmt)，在90℃的條件下攪拌反應(yīng)12h，并且全程通氮?dú)獗Ｗo(hù)；

3)將步驟2)所得到的微球?yàn)V出，然后用dmf浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，經(jīng)過一系列洗滌后過濾，將微球置于50℃下真空干燥備用；

4)功能基試劑接枝微球后的季銨化反應(yīng)如下：步驟3)所得物與環(huán)氧丙烷在20℃下攪拌反應(yīng)6h后，再加入芐氯，常溫下攪拌反應(yīng)6h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌數(shù)次至表面無環(huán)氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化殺菌微球；

5)將步驟4)中所得物結(jié)合銀離子，測定其殺菌效果。

較佳地，步驟1)dmf的用量為40.0ml，浸泡的氯球用量為60.0mg；

較佳地，步驟2)母體和配體的摩爾比為1:5；

較佳地，步驟3)洗滌所用試劑順序依次為：蒸餾水、無水乙醇、丙酮、乙醚；

較佳地，步驟4)加入環(huán)氧丙烷的量為30.0ml，芐氯的用量為75.0ml。

復(fù)合殺菌微球在飲用水或飲料殺菌中的應(yīng)用。能有效地殺滅飲用水中的微生物，避免水溶性殺菌劑帶來的“二次污染”和水體殘留問題。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明所用的原材料是一種極易改性修飾的樹脂氯球，它有較高的機(jī)械強(qiáng)度和物理穩(wěn)定性，具有耐溶脹，耐氧化，耐磨損，耐溫度變化，不易碎裂，再生方便等優(yōu)點(diǎn)，來源廣泛，價(jià)格低廉，同時(shí)由于其有較高的化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)氯甲基(–ch2cl)，能固定更多不同類型的殺菌功能基，性能穩(wěn)定，固載量大，殺菌效果也能夠更高。本發(fā)明創(chuàng)造性地選用多元含氮雜環(huán)作為氯球固載的功能基因子，而且負(fù)載了具有殺菌性能的銀離子。與目前常見的長鏈季銨鹽殺菌劑相比，不僅具有功能基不易從母體上脫落，不會(huì)造成殺菌劑失效和“二次污染”的優(yōu)點(diǎn)，而且還可以有效地克服直鏈季銨鹽長期使用后會(huì)產(chǎn)生抗性影響其性能的缺點(diǎn)；與無機(jī)載銀殺菌劑相比，銀離子不易溶出，降低了環(huán)境污染，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益。

2.本發(fā)明提供的新型固定化殺菌劑的反應(yīng)路線簡單，合成方法操作方便，只需要母體接枝功能基試劑、接枝后季銨化和吸附銀離子三步反應(yīng)即可完成，反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn)，無需大型儀器設(shè)備，所以容易實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)及自動(dòng)化控制，具有良好的應(yīng)用前景。

3.本發(fā)明提供的新型殺菌微球主要有以下四點(diǎn)性能優(yōu)勢：1)用量少，殺菌效率高，且在殺菌過程中具有持續(xù)時(shí)間久，基團(tuán)不易從載體中脫落，銀離子不易溶出等優(yōu)點(diǎn)，比小分子殺菌劑有更好的殺菌性能；2)殺菌微球較難進(jìn)入動(dòng)植物體內(nèi)，可以有效避免由殺菌劑本身造成的“二次污染”；3)本發(fā)明提供的殺菌微球是水不溶性的，可有效克服可溶性殺菌劑殘留水體的問題，且微球可回收，可重復(fù)使用，能夠提高資源的利用率；4)本發(fā)明提供的有機(jī)載銀殺菌劑不僅可以有效克服現(xiàn)行的無機(jī)載銀殺菌劑制備技術(shù)復(fù)雜、難度大、成本高、難以大批量生產(chǎn)、用量多、使用過程中容易溶出等缺點(diǎn)，而且還可以回收環(huán)境中的銀離子，減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，更能提高殺菌性能，達(dá)到一舉多得的目的。

附圖說明

圖1是微球合成裝置搭建示意圖；

圖2所示為氯球、mmtr、mmtr-ag的紅外光譜圖；

圖3所示為mmtr-ag復(fù)合殺菌微球?qū)Υ竽c桿菌的殺菌率隨時(shí)間變化曲線；

圖4所示為mmtr-ag復(fù)合殺菌微球?qū)瘘S色葡萄球菌的殺菌率隨時(shí)間變化曲線；

圖5所示為濃度為mbc的mmtr-ag復(fù)合微球?qū)Υ竽c桿菌的平板作用效果；

圖6所示為濃度為mbc的mmtr-ag復(fù)合微球?qū)瘘S色葡萄球菌的平板作用效果；

圖7所示為濃度為mbc的mmtr-ag對(duì)礦泉水和生理鹽水中e.coli的殺菌率變化曲線對(duì)比圖；

圖8所示為濃度為mbc的mmtr-ag對(duì)礦泉水和生理鹽水中s.aureus的殺菌率變化曲線對(duì)比圖；

圖9所示為濃度為mbc的mmtr-ag在自來水中殺菌率變化曲線；

圖10所示為復(fù)合微球mmtr-ag在自來水殺菌前后的掃描電鏡圖；

圖1中，1-三頸瓶，2-冷凝管，3-攪拌棒，4-溫度計(jì)，5-氮?dú)夤艿馈?/p>

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

量取40ml反應(yīng)溶劑至容積為100ml的三頸燒瓶中，并加入60.0mg母體(氯球)浸泡過夜。母體充分溶脹后，向三頸燒瓶內(nèi)加入一定摩爾比的5-巰基-1-甲基四唑和催化劑金屬鈉，在一定的溫度下攪拌反應(yīng)，并且反應(yīng)全程通氮?dú)獗Ｗo(hù)。反應(yīng)12h后，將三頸燒瓶內(nèi)微球?yàn)V出，然后用反應(yīng)溶劑浸泡洗滌直至洗滌液無色或微球表面無明顯附著物，用蒸餾水洗滌后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次后，過濾微球置于50℃下真空干燥備用。

本發(fā)明用傅里葉紅外光譜儀對(duì)所合成的新化合物mmtr-ag進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征：如圖2所示為載體ps-cl、mmtr和mmt-ag的紅外光譜圖。由三種微球的紅外圖譜對(duì)比可知，在mmtr-ag中，原來mmtr中1311cm-1的c-n伸縮振動(dòng)峰減弱，1047-1521cm-1的四唑譜帶消失，1679cm-1的c＝n伸縮振動(dòng)吸收峰。從紅外圖譜中可推斷，ag⁺主要是由于mmtr中的五元雜環(huán)吸附，所以對(duì)環(huán)內(nèi)的各個(gè)基團(tuán)的振動(dòng)均產(chǎn)生影響，從而反映在紅外圖譜中。

合成微球的季銨化：將按上述過程的所得物放入250ml的三頸燒瓶內(nèi)，用氮?dú)鈱⑵績?nèi)空氣排盡后加入30ml的環(huán)氧丙烷，20℃下攪拌反應(yīng)6h后，留向瓶內(nèi)加入75ml的芐氯，常溫下攪拌反應(yīng)6h后濾出，并用無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌數(shù)次至表面無環(huán)氧丙烷殘留，過濾后將微球置于50℃下真空干燥，得到不溶的固定化殺菌微球(以下簡稱mmtr)。

載銀復(fù)合殺菌微球的制備：準(zhǔn)確稱取15.0mg的mmtr于100ml的碘量瓶中，加入25.0ml不同ph的hac-naac緩沖液充分溶脹后，加入濃度為1.0mg·ml^-1的ag⁺溶液5.0ml(由硝酸銀配制而成)，不加入微球組為對(duì)照試驗(yàn)，常溫下恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速100rpm·min^-1，至吸附平衡后取上清液測定溶液中剩余ag⁺含量，根據(jù)以下公式推算吸附量q。負(fù)載ag⁺后的殺菌微球稱之為復(fù)合殺菌微球(以下簡稱mmtr-ag)。

式中；co－吸附前金屬離子濃度(mg·ml^-1)，ce－吸附平衡后金屬離子濃度(mg·ml^-1)，q－樹脂的靜態(tài)飽和吸附量(mg·g^-1)，v－溶液體積(ml)，m－樹脂的干重(g)。

對(duì)比例1

將實(shí)施例1中的反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及反應(yīng)摩爾比根據(jù)下表對(duì)應(yīng)組合進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從而獲得不同轉(zhuǎn)化率的mmtr。

表1不同轉(zhuǎn)化率的mmtr合成條件

由表1可知，mmtr的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溶劑為dmf，反應(yīng)溫度為90℃，5-巰基-1-甲基四唑與氯球的反應(yīng)摩爾比為5：1，mmtr的轉(zhuǎn)化率為91.3％。

對(duì)比例2

將實(shí)施例一的配體5-巰基-1-甲基四唑(mmt)改為3-氨基-5-巰基-1,2,4-三氮唑(att)，腺嘌呤(at)，其余按實(shí)施例一操作，得到以下結(jié)果：

表3不同配體的轉(zhuǎn)化率

由表3可得：mmt作配體時(shí)，殺菌微球的合成率最高。

對(duì)比例3

將實(shí)施例一的配體5-巰基-1-甲基四唑(mmt)改為2-氨基苯并咪唑(abm)，將ph值得范圍控制在3.0-6.0之間，其余按實(shí)施例一操作，得到以下結(jié)果：

表4不同ph值下mmtr、abmr對(duì)ag⁺的負(fù)載量

由表4可知，mmtr對(duì)ag⁺有一定的吸附能力外，而abmr則對(duì)ag⁺幾乎不吸附。當(dāng)ph＝5時(shí)，mmtr對(duì)ag⁺的負(fù)載效果最佳，容量為52.01mg·g^-1。ph低時(shí)，溶液中h⁺濃度大，干擾mmtr對(duì)ag⁺的吸附，隨著ph增大，干擾作用減小，負(fù)載量不斷提高。當(dāng)ph＝6時(shí)，溶液中oh-含量增大，同微球競爭與ag⁺結(jié)合，造成吸附量的下降。

實(shí)驗(yàn)1:復(fù)合殺菌微球殺菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以革蘭氏陰性代表細(xì)菌大腸桿菌(e.coli)cicc21524和革蘭氏陽性代表細(xì)菌金黃色葡萄球菌(s.aureus)cicc10384作為受試菌，這兩種菌種均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟及評(píng)價(jià)方法如下：

所有菌株均作為儲(chǔ)備培養(yǎng)物輔以15％(v/v)甘油的營養(yǎng)肉體培養(yǎng)基中，保持于-20℃儲(chǔ)存。菌株置于在lb培養(yǎng)基內(nèi)，37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)18小時(shí)；活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rmp下離心洗滌。將所得菌斑用0.85％的生理鹽水通過十倍稀釋法稀釋成濃度約為106cfu/ml的菌懸液備用。

殺菌活性測試

取若干無菌的100ml搖瓶，加入50ml上述制備的菌懸液；在樣品組中加入一定量充分溶脹的殺菌微球mmtr、mmtr-ag，對(duì)照組不加入殺菌微球；振蕩各混合液，接觸不同時(shí)間后，根據(jù)gb/t4789.3-2010提供的方法，將不同接觸時(shí)間上清液分別逐級(jí)稀釋，稀釋至適宜濃度后用玻璃涂布棒涂勻，倒置平板于37℃下培養(yǎng)進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。通過以下公式計(jì)算微球殺菌率：

為提高殺菌率的準(zhǔn)確性，殺菌率由同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和樣品組取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)后結(jié)果根據(jù)公式計(jì)算得到。

表5所示為殺菌微球mmtr和復(fù)合殺菌微球mmtr-ag對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。其中，殺菌時(shí)間為6h。

表5mmtr、mmtr-ag⁺對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(mbc)

由表5可知，負(fù)載銀離子后，復(fù)合殺菌微球的殺菌能力比負(fù)載前提高。

實(shí)驗(yàn)2:復(fù)合殺菌微球的重復(fù)使用

復(fù)合殺菌微球的解吸性能關(guān)系其ag⁺的回收效率，同時(shí)對(duì)探討復(fù)合微球殺菌過程中ag⁺殘留水體的情況顯得尤為重要。選用hcl+5％硫脲作為洗脫劑，探討不同濃度的洗脫劑劑對(duì)復(fù)合微球的洗脫效果。根據(jù)表6可知，1.5mol·l^-1hcl+5％硫脲對(duì)復(fù)合殺菌微球有較好的洗脫效果，最佳洗脫率為98.04％，表明mmtr-ag具有良好的解吸性能，在回收水體中的ag⁺中有較好的應(yīng)用前景，同時(shí)回收的量也說明復(fù)合微球在殺菌過程中幾乎無ag⁺殘留。

表6不同濃度解吸劑對(duì)復(fù)合殺菌微球的解吸率

銀離子具有較好的殺菌性能，但是常用的制備銀離子殺菌劑的方法都較為繁瑣，需要高溫、劇烈攪拌等條件，相比之下，本發(fā)明具有操作簡單，條件溫和的優(yōu)勢。大部分負(fù)載銀離子的載體本身不具備殺菌性能；而本發(fā)明中，負(fù)載銀離子后，mmtr-ag的mbc較mmtr低，表明其殺菌效率有所提高。一些負(fù)載銀離子的殺菌劑，其殺菌主要依賴于銀離子的緩釋，而銀離子進(jìn)入環(huán)境，除造成水體污染，危害健康外，還會(huì)造成資源的浪費(fèi)。而其他固載銀離子的殺菌劑，鮮有考察其殺菌過程中銀離子的脫落情況。本發(fā)明利用適當(dāng)?shù)南疵搫瑢?duì)殺菌后的復(fù)合殺菌微球進(jìn)行洗脫，測定銀離子的洗脫量，可以間接推斷殺菌過程復(fù)合殺菌微球上銀離子的變化情況。銀作為一種貴金屬，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，復(fù)合殺菌微球上銀離子的洗脫回收量是評(píng)定復(fù)合殺菌微球性能的標(biāo)準(zhǔn)之一，有助于提高經(jīng)濟(jì)效益，提升資源利用率。

實(shí)驗(yàn)三：復(fù)合殺菌微球在自來水中的實(shí)際應(yīng)用

(1)礦泉水

菌株活化后用移液槍取出一定量菌液，在4000rpm下離心洗滌。將所得菌斑用礦泉水調(diào)節(jié)濃度為106cfu·ml-1的菌懸液備用。

取若干無菌的100ml搖瓶，加入50.0ml上述制備的菌懸液；在樣品組中加入上述殺菌實(shí)驗(yàn)的最低殺菌濃度的殺菌微球，空白組不加入微球。振蕩各組溶液，接觸不同時(shí)間后，將不同接觸時(shí)間上清液分別逐級(jí)稀釋，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。通過上述公式計(jì)算微球殺菌率，其中計(jì)算殺菌率所用的均為同一時(shí)間點(diǎn)樣品組和對(duì)照組進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的結(jié)果。

利用平板計(jì)數(shù)法測試所購的礦泉水的本身的含菌情況，未有明顯菌落檢出。圖7、8分別是濃度為mbc的復(fù)合殺菌微球作用于礦泉水和生理鹽水中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌殺菌率曲線對(duì)比圖。從圖中可看出該微球在礦泉水中殺滅大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的時(shí)間均比在生理鹽水中有所延長，但與大腸桿菌作用一定時(shí)間后還是能夠達(dá)將活菌全部殺死，與金黃色葡萄球菌充分接觸后，受試菌的數(shù)量下降程度也達(dá)到90％以上。

礦泉水是從地下深處自然涌出的或經(jīng)人工揭露的、未受污染的地下礦水，含有一定量的礦物鹽、微量元素或二氧化碳?xì)怏w。mmtr-ag復(fù)合微球與礦物質(zhì)作用的活性位點(diǎn)由ag+所占據(jù)，礦物質(zhì)難以與復(fù)合微球結(jié)合，但復(fù)合微球作用受試菌在礦泉水中的殺菌率上升速度也慢于在生理鹽水中，初步推斷可能是由于礦物離子粘附于微球表面或某些離子與ag+存在相互作用，所以導(dǎo)致復(fù)合微球在礦泉水中的的殺菌效果較在生理鹽水中差。

(2)自來水

自取的自來水經(jīng)過平板計(jì)數(shù)法測定，其中菌落總數(shù)約為85cfu·ml^-1，符合城市自來水的國家標(biāo)準(zhǔn)(gb5749-2006)。取若干無菌的100ml搖瓶，加入50.0ml的自來水；樣品組中加入一定量充分溶脹的殺菌微球，對(duì)照組不加入殺菌微球；振蕩各混合液，接觸不同時(shí)間后，將不同接觸時(shí)間上清液分別逐級(jí)稀釋，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。仍然以公式計(jì)算殺菌率。

通過上述實(shí)驗(yàn)測得mmtr-ag作用于自來水時(shí)的最低殺菌濃度(mbc)為0.2mg·ml^-1，圖9為mmtr-ag在自來水中殺菌率與時(shí)間關(guān)系的曲線。結(jié)果顯示該微球菌可將自來水的菌全部殺死，證明其具有良好的廣譜抗菌性和應(yīng)用前景。自來水中總菌數(shù)不多，但自來水中含有許多無機(jī)鹽、金屬離子或其他小分子物質(zhì)。mmtr-ag由于ag+的存在，吸附金屬離子的活性降低，但其他雜質(zhì)仍然會(huì)粘附在其表面。而且自來水中含有多種不同類型的菌，微球與不同的菌作用時(shí)間不一樣，所以復(fù)合微球需要與自來水接觸足夠的時(shí)間后才能將其中的活菌全部殺滅。

由圖10電鏡掃描圖可以看出復(fù)合微球mmtr-ag并非光滑，其表面被ag+覆蓋，且由于ag+在表面的吸附，也使得復(fù)合微球的顏色與mmtr存在差別。復(fù)合微球殺菌后表面出現(xiàn)部分片狀物質(zhì)，可能是由于殺菌微球作用于細(xì)菌活細(xì)胞時(shí)使其破裂，內(nèi)容物流出后與細(xì)胞膜碎片共同覆于微球表面造成的。

上述實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。