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技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)描述了通過(guò)給予雌激素受體調(diào)節(jié)劑來(lái)治療婦女中特征在于一個(gè)或多個(gè)腫瘤細(xì)胞中ER基因突變的激素抗性-雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌的方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是最常見(jiàn)的癌癥形式并且是全世界婦女中癌癥死亡的首要原因。所有乳腺癌中約80％表達(dá)并且依賴(lài)于用于腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的雌激素受體(ER)。雌激素受體(“ER”)是一種通過(guò)其與內(nèi)源性雌激素的相互作用而介導(dǎo)誘導(dǎo)多種生物效應(yīng)的配體活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。內(nèi)源性雌激素包括17β-雌二醇和雌酮。已發(fā)現(xiàn)ER具有兩種亞型，ER-α和ER-β。雌激素和雌激素受體牽涉許多疾病或病癥，諸如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌，以及其它疾病或病癥。

大多數(shù)乳腺癌患者用藥物治療，該藥物阻斷雌激素合成(例如，芳香酶抑制劑；AIS)或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ER結(jié)合拮抗雌二醇的作用(例如，他莫昔芬)(Puhalla S,et al Mol Oncol 2012；6(2):222-236)。盡管在疾病的不同階段，這些藥物具有充分記載的治療效用，但是許多ER+乳腺癌復(fù)發(fā)且患者最終死亡。最近，下一代全基因組和靶標(biāo)測(cè)序在高達(dá)20％的來(lái)自已經(jīng)對(duì)內(nèi)分泌療法(主要是芳香酶抑制劑)進(jìn)展的具有晚期乳腺癌的患者的腫瘤中已鑒定出ESR1(雌激素受體α基因)(Li S,et al.Cell Rep(2013)；4(6):1116-1130；Merenbakh-Lamin K,et al.Cancer Res(2013)；73(23):6856-6864；Robinson DR,et al.Nat Genet(2013)；45(12):1446-1451；Toy W,et al.Nat Genet(2013)；45(12):1439-1445；Jeselsohn R,et al.Clin Cancer Res(2014)；20:1757-1767)。這些配體結(jié)合域(LBD)突變賦予apo受體高基底活性，這使得它們不依賴(lài)于配體且由此在低雌二醇環(huán)境(setting)中具有活性。在AI或他莫昔芬治療后進(jìn)行性疾病的環(huán)境(包括具有ESR1突變腫瘤的患者的亞組)中，對(duì)于靶向具有強(qiáng)效活性的ER信號(hào)傳導(dǎo)的療法存在巨大的需求。

ARN-810(GDC-0810,Seragon Pharmaceuticals,Genentech Inc.)是一種拮抗雌激素作用且經(jīng)蛋白酶體誘導(dǎo)ER降解的強(qiáng)效的小分子、非類(lèi)固醇、選擇性ER調(diào)節(jié)劑。在臨床試驗(yàn)中，ARN-810作為口服遞送的療法以治療晚期轉(zhuǎn)移性ER-α陽(yáng)性(ER+)乳腺癌。

已經(jīng)描述了非類(lèi)固醇、選擇性雌激素受體降解劑(SERD)(WO 2011/156518；US 8703810；WO 2012/037411；WO 2012/037410；US 8299112；US 8455534；WO 2013/090829；WO 2013/142266；WO 2014/151899；WO 2013/090836；WO 2014/025138；WO 2014/205136)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)描述了用于治療特征在于具有ESR1基因突變的患者中激素抗性-雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌的方法，所述方法包括給予雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)。在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為選擇性雌激素受體降解劑(SERD)。在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為具有式(A)、(B)、(C)或(D)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí)施方案中，具有式(A)結(jié)構(gòu)的化合物為具有式(A-1)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí)施方案中，具有式(C)結(jié)構(gòu)的化合物為具有式(C-1)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí)施方案中，具有式(D)結(jié)構(gòu)的化合物為具有式(D-1)、(D-2)、(D-3)、(D-4)、(D-5)或(D-6)結(jié)構(gòu)的化合物。在一些實(shí)施方案中，ESR1基因中的突變導(dǎo)致形成在選自以下的位置具有氨基酸替換的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致形成具有選自以下的氨基酸替換的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有兩個(gè)或更多個(gè)ESR1基因中的突變。

在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)描述了用于治療ER相關(guān)疾病或病癥的方法，其包括向具有ESR1基因突變的患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)化合物。

式(A)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

R^b為C₁-C₆烷基或C₃-C₆環(huán)烷基；

R^c為H或F；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

X為CH或N；且

n為0、1或2。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(A-1)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑選自化合物1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11和1-12。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為化合物1-3。

式(B)化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

環(huán)C為

環(huán)D為苯基或噻吩基；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

n為0、1或2，

或其藥用鹽或溶劑化物。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑選自化合物2-1、2-2、2-3、2-4和2-5。

式(C)化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

R^b為C₁-C₆烷基或C₃-C₆環(huán)烷基；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；且

n為0、1或2，

或其藥用鹽或溶劑化物。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(C-1)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為化合物3-1、3-2、3-3、3-4。

式(D)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

其中，

R¹為H、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R²為H、F、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R³為H、鹵素、-CN、-OR⁶、-NHR⁶、-NR⁶R⁷、-SR⁶、-S(＝O)R⁷、-S(＝O)₂R⁷、C₁-C₄烷基或C₁-C₄氟烷基；

每個(gè)R⁴獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OH、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₄烷基、氟C₁-C₄烷氧基和C₁-C₄烷氧基；每個(gè)R⁵為H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃；

每個(gè)R⁶獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；每個(gè)R⁷獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

n為0、1或2；且t為1或2。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為具有以下結(jié)構(gòu)的式(D-1)化合物：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為具有以下結(jié)構(gòu)的式(D-2)化合物：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為具有以下結(jié)構(gòu)的式(D-3)化合物：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為具有以下結(jié)構(gòu)的式(D-4)化合物：

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑選自化合物4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16、4-17、4-18、4-19、4-20、4-21、4-22、4-23、4-24、4-25、4-26、4-27、4-28、4-29、4-30、4-31、4-32、4-33、4-34、4-35、4-36、4-37、4-38、4-39、4-40、4-41、4-42、4-43、4-44和4-45。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為化合物4-23。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為化合物1-3或4-23。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮雜環(huán)丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羥基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮雜環(huán)丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羥基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇。

在一些實(shí)施方案中，所述ER相關(guān)的疾病或病癥為癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為轉(zhuǎn)移性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為激素抗性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為HER2陽(yáng)性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為HER2陰性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌對(duì)用芳香酶抑制劑的治療具有抗性。在一些實(shí)施方案中，ESR1基因中的突變?yōu)轶w細(xì)胞突變。在一些實(shí)施方案中，所述患者表達(dá)野生型ER和突變型ER。在一些實(shí)施方案中，所述患者表達(dá)兩種突變型ER-α多肽的同二聚體。在一些實(shí)施方案中，所述患者表達(dá)一種野生型ER-α多肽和一種突變型ER-α多肽的異二聚體，或一種野生型ER-β多肽和一種突變型ER-α多肽的異二聚體。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有腫瘤。在一些實(shí)施方案中，多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)突變型ER。在一些實(shí)施方案中，所述患者處于絕經(jīng)前或絕經(jīng)后。在一些實(shí)施方案中，所述患者已經(jīng)歷一種或多種抗癌療法失敗。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受化學(xué)治療劑、生物療法、癌癥疫苗、血管生成抑制劑、激素療法、放射療法、外科手術(shù)或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述生物療法是肽、細(xì)胞因子、抗體、治療性病毒、治療性細(xì)菌、基因療法、siRNA、過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受芳香酶抑制劑、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、選擇性雌激素降解劑(SERD)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途徑抑制劑、CDK4/6抑制劑、HER-2抑制劑、EGFR抑制劑、PD-1抑制劑、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、HSP90抑制劑、VEGFR抑制劑、AKT抑制劑、化學(xué)療法或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受氟維司群(fulvestrant)、他莫昔芬(tamoxifen)、阿那曲唑(anastrozole)、來(lái)曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、GDC0032、戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、巴多昔芬(bazedoxifene)或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受蒽環(huán)類(lèi)抗生素(anthracycline)、紫杉烷(taxane)、鉑劑、埃坡霉素(epothilone)或核苷類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、卡培他濱(capecitabine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、多西他賽(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾日布林(eribulin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、伊沙匹隆(ixabepilone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸(pamidronate)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述患者已接受帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥單抗(trastuzumab)、拉帕替尼(lapatinib)、依維莫司(everolimus)、貝伐單抗(bevacizumab)、坦西莫司(temsirolimus)或它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)ER多肽中的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致雌激素受體的N末端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、鉸鏈區(qū)或配體結(jié)合域中的氨基酸替換。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致雌激素受體的配體結(jié)合域中的氨基酸替換。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換位于SEQ ID NO:2的6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換選自H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換選自Y537N、Y537C、Y537S和D538G。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括給予一種或多種用于治療ER相關(guān)疾病或病癥的治療劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括給予額外的抗癌劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括給予芳香酶抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的是針對(duì)用式(A)、(B)、(C)或(D)化合物調(diào)節(jié)劑化合物的治療選擇患有ER相關(guān)疾病或病癥的患者的方法：其包括1)在包含來(lái)自患者的核酸的樣品中檢測(cè)ESR1基因中的突變；和2)若患者具有ESR1突變，則針對(duì)用所述化合物的治療選擇患者。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸為RNA或DNA。在一些實(shí)施方案中，所述DNA為基因組DNA。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括從核酸樣品中分離mRNA。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括從核酸樣品中擴(kuò)增包含所述突變的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)聚合物酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或數(shù)字PCR進(jìn)行擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，PCR擴(kuò)增包括使用一對(duì)側(cè)翼具有包含所述突變的區(qū)域的寡核苷酸引物。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使核酸與序列特異性核酸探針接觸，其中所述序列特異性核酸探針與具有所述突變的核酸結(jié)合且不與野生型核酸結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包含來(lái)自一個(gè)或多個(gè)腫瘤細(xì)胞的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞取自腫瘤活檢樣品、血液樣品、血清樣品、淋巴樣品或骨髓穿刺液。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包含循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。

在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的是試劑盒，其包含一種或多種用于檢測(cè)ESR1突變的試劑以及式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種或多種引物或用于檢測(cè)ESR1中的突變的探針。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)ER多肽中的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致雌激素受體的N末端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、鉸鏈區(qū)或配體結(jié)合域中的氨基酸替換。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變導(dǎo)致雌激素受體的配體結(jié)合域中的氨基酸替換。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換位于SEQ ID NO:2的6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換選自H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換選自Y537N、Y537C、Y537S和D538G。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑口服給予患者。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑每天給予。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑以連續(xù)每日給藥方案給予。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑以約5mg/天至約1000mg/天給予。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑的治療有效量為約10mg/天至約100mg/天。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑每日一次或每日多次給予。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)、(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑每日一次、每日兩次、每日三次或每日四次給予。

本申請(qǐng)所述的方法、用途和組合物的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)描述中變得顯而易見(jiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例，雖然指示具體實(shí)施方案，但僅以說(shuō)明的方式給出，這是因?yàn)閺脑撛敿?xì)描述中本公開(kāi)的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。

具體實(shí)施方式

乳腺癌是最常見(jiàn)的癌癥形式并且是全世界婦女中癌癥死亡的首要原因。所有乳腺癌中約80％表達(dá)并依賴(lài)于腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的雌激素受體(ER)。其它癌癥也被認(rèn)為依賴(lài)于用于生長(zhǎng)和存活的ER-α信號(hào)傳導(dǎo)，諸如卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌。

雌激素受體α(ER-α)和雌激素受體β(ER-β)是類(lèi)固醇激素受體，其為大的核受體超家族成員。核受體共享共同的模塊結(jié)構(gòu)，其最低限度包括DNA結(jié)合域(DBD)和配體結(jié)合域(LBD)。類(lèi)固醇激素受體是作為配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的可溶性細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。脊椎動(dòng)物含有五個(gè)密切相關(guān)的類(lèi)固醇激素受體(雌激素受體、雄激素受體、孕激素受體、糖皮質(zhì)激素受體、鹽皮質(zhì)激素受體)，其調(diào)節(jié)廣譜的生殖、代謝和發(fā)育活動(dòng)。ER的活性受內(nèi)源性雌激素，包括17β-雌二醇和雌酮的結(jié)合控制。

ER-α基因位于6q25.1且編碼595AA蛋白。ER-β基因位于染色體14q23.3上且產(chǎn)生530AA蛋白質(zhì)。然而，由于選擇性剪接和翻譯起始位點(diǎn)，這些基因中的每一個(gè)可產(chǎn)生多種同工型。除了DNA結(jié)合域(稱(chēng)為C結(jié)構(gòu)域)和配體結(jié)合域(E結(jié)構(gòu)域)之外，這些受體還包含N-末端(A/B)結(jié)構(gòu)域，連接C和E結(jié)構(gòu)域的鉸鏈(D)結(jié)構(gòu)域，和C-末端延伸(F結(jié)構(gòu)域)(Gronemeyer and Laudet；Protein Profile 2:1173-1308,1995)。雖然ER-α和ER-β的C和E結(jié)構(gòu)域是相當(dāng)保守的(分別為95％和55％氨基酸同一性)，但是A/B、D和F結(jié)構(gòu)域的保守性差(低于30％的氨基酸同一性)。兩種受體都參與雌性生殖道的調(diào)節(jié)和發(fā)育，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和骨代謝中也發(fā)揮多種作用。

類(lèi)固醇激素受體的配體結(jié)合口袋深深地埋在配體結(jié)合域內(nèi)。結(jié)合后，配體變成該結(jié)構(gòu)域的疏水核心的一部分。因此，大多數(shù)類(lèi)固醇激素受體在不存在激素的情況下是不穩(wěn)定的，并且需要來(lái)自伴侶蛋白諸如Hsp90的輔助，以便維持激素結(jié)合能力(competency)。與Hsp90的相互作用也控制這些受體的核易位。配體結(jié)合穩(wěn)定受體并啟動(dòng)釋放伴侶蛋白的序列構(gòu)象變化，改變各種受體結(jié)構(gòu)域之間的相互作用并重塑蛋白相互作用表面，其允許這些受體易位至細(xì)胞核中，結(jié)合DNA并參與與染色質(zhì)重塑復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄器的相互作用。雖然ER可與Hsp90相互作用，但是這種相互作用不是激素結(jié)合所必需的，并且取決于細(xì)胞環(huán)境，apo-ER既可以是胞質(zhì)的也可以是核的。生物物理研究表明有助于受體的穩(wěn)定性的是DNA結(jié)合而不是配體結(jié)合(Greenfield et al.,Biochemistry 40:6646-6652,2001)。

ER可通過(guò)結(jié)合稱(chēng)為雌激素響應(yīng)元件(ERE)的特異性DNA序列基序(經(jīng)典途徑)直接與DNA相互作用，或通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(非經(jīng)典途徑)間接與DNA相互作用(Welboren et al.,Endocrine-Related Cancer 16:1073-1089,2009)。在非經(jīng)典途徑中，ER已顯示與其它轉(zhuǎn)錄因子包括SP-1、AP-1和NF-κB相連。這些相互作用似乎在ER調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的能力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

兩種類(lèi)型的ER DNA相互作用可導(dǎo)致依賴(lài)于由相應(yīng)的ER-ERE復(fù)合物募集的轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子的基因激活或抑制(Klinge,Steroid 65:227-251,2000)。輔助調(diào)節(jié)因子的募集主要由兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用表面AF2和AF1介導(dǎo)。AF2位于ER E結(jié)構(gòu)域中并且其構(gòu)象由配體直接調(diào)節(jié)(Brzozowski et al.,Nature 389:753-758,1997)。完全激動(dòng)劑似乎促進(jìn)輔助激活因子的募集，而弱激動(dòng)劑和拮抗劑則有助于輔助抑制因子的結(jié)合。對(duì)用AF1調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)了解較少，但其可通過(guò)絲氨酸磷酸化來(lái)控制(Ward and Weigel,Biofactors 35:528-536,2009)。所涉及的磷酸化位點(diǎn)(S118)之一似乎在存在拮抗劑諸如他莫昔芬的情況下控制ER的轉(zhuǎn)錄活性，所述拮抗劑在乳腺癌的治療中發(fā)揮重要作用。盡管完全激動(dòng)劑似乎以某些構(gòu)象阻止ER，但弱激動(dòng)劑傾向于使ER保持在不同構(gòu)象之間的平衡中，這允許輔助調(diào)節(jié)因子所有組分中的細(xì)胞依賴(lài)性差異以細(xì)胞依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)ER的活性(Tamrazi et al.,Mol.Endocrinol.17:2593-2602,2003)。ER與DNA的相互作用是動(dòng)態(tài)的，并且通過(guò)包括但不限于通過(guò)蛋白酶體降解ER的方法來(lái)調(diào)節(jié)(Reid et al.,Mol Cell 11:695-707,2003)。用配體降解ER為對(duì)可用的抗激素治療具有雌激素敏感性和/或抗性的疾病或病癥提供有吸引力的治療策略。

ER信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于女性生殖器官(包括乳房)的發(fā)育和維持、排卵和子宮內(nèi)膜的增厚是至關(guān)重要的。ER信號(hào)傳導(dǎo)還在骨量、脂質(zhì)代謝、癌癥等中發(fā)揮作用。

雌激素活性和/或合成的調(diào)節(jié)是具有ER陽(yáng)性(ER+)乳腺癌的女性的治療方法的主要內(nèi)容。ER-α拮抗劑他莫昔芬已用于治療絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女的早期和晚期ER-α陽(yáng)性乳腺癌。氟維司群(FASLODEX^TM,Astra Zeneca)，即一種基于類(lèi)固醇的ER拮抗劑，用于治療雖用他莫昔芬治療但仍有進(jìn)展的婦女的乳腺癌。類(lèi)固醇和非類(lèi)固醇芳香酶抑制劑也用于治療人類(lèi)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，類(lèi)固醇和非類(lèi)固醇芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑、來(lái)曲唑和依西美坦)阻斷絕經(jīng)后婦女中由雄烯二酮和睪酮產(chǎn)生雌激素，從而阻斷癌癥中的ER依賴(lài)性生長(zhǎng)。除了這些抗激素劑之外，在一些情況下用多種其它化療劑諸如蒽環(huán)類(lèi)、鉑類(lèi)、紫杉烷類(lèi)治療進(jìn)行性ER陽(yáng)性乳腺癌。在一些情況下，用單克隆抗體曲妥單抗(HERCEPTIN^TM,Genentech Inc.)或小分子pan-ERB-B抑制劑拉帕替尼治療攜帶ERB-B/HER2酪氨酸激酶受體的基因擴(kuò)增的ER陽(yáng)性乳腺癌。盡管具有一系列抗激素、化學(xué)治療和小分子以及基于抗體的靶向療法，許多具有ER-α陽(yáng)性乳腺癌的婦女發(fā)展進(jìn)展性轉(zhuǎn)移性疾病，并需要新的療法。重要的是，在現(xiàn)有抗激素以及其它療法上進(jìn)展的大多數(shù)ER陽(yáng)性腫瘤被認(rèn)為仍然依賴(lài)于用于生長(zhǎng)和存活的ER-α。因此，需要在轉(zhuǎn)移性疾病和獲得性耐藥的情況下具有活性的新型ER-α靶向劑。

盡管對(duì)于芳香酶抑制劑或他莫昔芬而言變得具有難治性，抗性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活仍然依賴(lài)于ER信號(hào)傳導(dǎo)；因此，具有ER+乳腺癌患者在先前激素療法進(jìn)展后仍然可進(jìn)行第二/三線激素治療。在一些實(shí)施方案中，在內(nèi)分泌耐藥狀態(tài)下，ER可以配體非依賴(lài)性方式發(fā)出信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，具有雙重作用機(jī)制(諸如ER拮抗作用+降解)的藥物具有靶向配體依賴(lài)性和非依賴(lài)性ER信號(hào)傳導(dǎo)兩者的潛力，并因此改善晚期ER+乳腺癌的治療結(jié)果。

來(lái)自激素抗性乳腺癌患者的腫瘤樣品的基因組分析揭示了雌激素受體α基因ESR1中的突變，其有助于ER+乳腺癌中的激素抗性。在某些情況下，這種突變導(dǎo)致雌激素受體的配體非依賴(lài)性激活。如本申請(qǐng)所述，特定的ER調(diào)節(jié)劑化合物在ER突變體環(huán)境中有效抑制ER信號(hào)傳導(dǎo)。因此，這種ER調(diào)節(jié)劑化合物可用于治療具有突變型ER的ER+乳腺癌患者。

在某些情況下，所述ER突變?yōu)镋SR1基因中的體細(xì)胞突變。在一些實(shí)施方案中，所述體細(xì)胞突變?cè)诎┌Y治療過(guò)程中發(fā)生于癌細(xì)胞(例如，乳腺癌細(xì)胞)中。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有野生型ESR1基因和突變的ESR1基因兩者(即，雜合子)。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞經(jīng)歷體細(xì)胞突變以產(chǎn)生突變的ESR1基因。在一些實(shí)施方案中，所述突變的癌細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生許多突變的癌細(xì)胞(例如，歸因于體細(xì)胞突變的具有突變的ESR1基因的擴(kuò)大種群的癌細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，所述患者表達(dá)野生型ER-α和突變型ER-α(即，異源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α包含兩種突變型ER-α多肽(即，同二聚體)。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α包含野生型ER-α多肽和突變型ER-α(即，異二聚體)。在一些實(shí)施方案中，所述體細(xì)胞突變賦予癌細(xì)胞對(duì)癌癥治療的抗性。在一些實(shí)施方案中，許多癌細(xì)胞中的體細(xì)胞突變賦予患者對(duì)癌癥治療的抗性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于癌癥(例如，乳腺癌)的治療，所述突變賦予基于激素的療法的抗性。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為ER+乳腺癌。

在一些實(shí)施方案中，所述ER突變?yōu)檫z傳的ESR1基因中的種系突變。在一些實(shí)施方案中，所述突變?cè)黾影l(fā)展乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述種系突變賦予癌細(xì)胞對(duì)癌癥治療的抗性。在一些實(shí)施方案中，許多癌細(xì)胞(例如，乳腺癌細(xì)胞)中的種系突變賦予患者對(duì)癌癥治療的抗性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于癌癥(例如，乳腺癌)的治療，所述種系突變賦予基于激素的療法的抗性。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為ER+乳腺癌。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述用于治療具有一個(gè)或多個(gè)ESR1基因中的突變的患者的雌激素受體調(diào)節(jié)劑的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述患者在一個(gè)或多個(gè)癌細(xì)胞，或多數(shù)癌細(xì)胞中具有一個(gè)或多個(gè)ESR1基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物為選擇性雌激素受體降解劑(SERD)，其靶向用于降解的ER-α。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物為具有組織特異性ER性質(zhì)的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。

在一些實(shí)施方案中，在基于細(xì)胞的測(cè)定中，本申請(qǐng)所述的化合物導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)ER-α水平的降低(例如，ER降解)，并且可用于治療雌激素敏感性疾病或病癥和/或已經(jīng)對(duì)抗激素療法發(fā)展出抗性的疾病或病癥。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所公開(kāi)的ER調(diào)節(jié)劑化合物使核中雌激素受體的水平最小化。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至雌激素受體。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物為與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至雌激素受體的非類(lèi)固醇ERα拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物完全拮抗野生型ER-α對(duì)雌激素的響應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物完全拮抗突變型ER-α對(duì)雌激素的響應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，與野生型ER-α相比，所述突變型ER-α展現(xiàn)出增加的基底活性。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α展現(xiàn)出配體非依賴(lài)性活性(例如，組成性活性)。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α在不存在雌二醇的情況下展現(xiàn)出組成性活性。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑抑制突變型ER-α的配體非依賴(lài)性活性(例如，組成性活性)。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)突變型ER-α中的構(gòu)象改變。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)抑制突變型ER-α的活性的突變型ER-α中的構(gòu)象改變。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中野生型ER-α的蛋白酶體降解。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中突變型ER-α的蛋白酶體降解。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑不依賴(lài)蛋白酶體降解而抑制細(xì)乳腺癌胞中突變型ER-α。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物完全拮抗ER-α對(duì)雌激素的響應(yīng)并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中野生型ER-α的蛋白酶體降解。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物完全拮抗突變型ER-α對(duì)雌激素的響應(yīng)并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中突變型ER-α的蛋白酶體降解。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物完全拮抗突變型ER-α對(duì)雌激素的響應(yīng)而不誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中突變型ER-α的蛋白酶體降解。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物抑制表達(dá)突變型ER-α的乳腺癌細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施方案中，所述ER調(diào)節(jié)劑化合物展現(xiàn)出良好的口服生物利用度。

本申請(qǐng)公開(kāi)的ER調(diào)節(jié)劑化合物可單獨(dú)或與調(diào)節(jié)乳腺癌中其它關(guān)鍵途徑的其它藥物組合用于治療特征在于ESR1基因中的一個(gè)或多個(gè)突變的激素抗性ER陽(yáng)性乳腺癌，所述其它途徑包括但不限于抑制IGF1R、EGFR、Erb-B2、Erb-B3、PI3K/AKT/mTOR途徑、HSP90、PARP、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(即CDK4/6)、VEGF受體或組蛋白脫乙酰酶的那些途徑。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的ER調(diào)節(jié)劑化合物可單獨(dú)或與用于治療乳腺癌的其它藥物組合用于治療特征在于ESR1基因中的一個(gè)或多個(gè)突變的激素抗性ER陽(yáng)性乳腺癌，所述其它藥物包括但不限于，芳香酶抑制劑、蒽環(huán)類(lèi)抗生素、鉑類(lèi)、氮芥、烷化劑、紫杉烷、核苷類(lèi)似物、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途徑抑制劑、CDK 4/6抑制劑、HER-2抑制劑、EGFR抑制劑、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、HSP90抑制劑、VEGFR抑制劑、AKT抑制劑和化學(xué)療法。用于治療乳腺癌的示例性藥物包括但不限于，氟維司群、他莫昔芬、阿那曲唑、來(lái)曲唑、依西美坦、GDC-0032、GDC-0068、戈舍瑞林、亮丙瑞林、雷洛昔芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、巴多昔芬、順鉑、卡鉑、卡培他濱、環(huán)磷酰胺、多西他賽、多柔比星、表柔比星、艾日布林、非格司亭、氟尿嘧啶、吉西他濱、伊沙匹隆、LEE011、LY2835219、米托蒽醌、甲氨蝶呤、紫杉醇、帕米膦酸、長(zhǎng)春瑞濱、非格司亭(pegfilgrastim)、帕妥珠單抗、曲妥單抗、拉帕替尼、依維莫司、貝伐單抗、坦西莫司及它們的組合，以及本申請(qǐng)所述的其它藥物。用于治療乳腺癌的其它非限制性示例性藥物在本申請(qǐng)他處提供。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物，其用于治療本申請(qǐng)所述的ER相關(guān)疾病或病癥。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含用于治療本申請(qǐng)所述的ER相關(guān)疾病或病癥的本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物和一種或多種藥用賦形劑。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物在制備用于治療本申請(qǐng)所述的ER相關(guān)疾病或病癥的藥物中的用途。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物用于治療本申請(qǐng)所述的ER相關(guān)疾病或病癥的用途。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療患者的ER相關(guān)疾病或病癥的方法，其包括給予本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物。

附圖說(shuō)明

圖1和2示出不存在E2(炔雌醇)的情況下在誘導(dǎo)表達(dá)野生型(WT)和突變型ERα的MCF7中的ERα降解測(cè)定。在含有100ng/ml Dox(多柔比星)的缺乏雌激素(estrogen-depleted)的培養(yǎng)基中將細(xì)胞用增加劑量的氟維司群(圖1)處理24小時(shí)。用來(lái)自表1的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)1-3(圖1)和ERM 4-23(圖2)而非他莫昔芬(圖2)，觀察到突變的ERa降解。由PR和細(xì)胞周期蛋白D1水平證明功能輸出。

圖3示出一組7只攜帶MCF-7EF1:Y537S ESR1-突變體(Y537S)的免疫受損小鼠中歷時(shí)28天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物，以高劑量200mg/kg給予氟維司群；AUC約20-30x臨床暴露以上，以及100mg/kg/天來(lái)自表1的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)1-3和100mg/kg/天來(lái)自表4的ERM 4-23。

圖4示出一組5只攜帶包含ESR1L536P突變體的HCI-005乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受損小鼠中歷時(shí)40天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+)、媒介物(-)，以60mg/kg/天給予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM4-23。媒介物(+)為含有炔雌醇(0.1mg/kg)的溶劑/緩沖液。媒介物(-)為不含有炔雌醇的溶劑/緩沖液。

圖5示出一組7只攜帶包含ESR1L536P突變體的HCI-005乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受損小鼠中具有Fold Over Start的歷時(shí)56天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天給予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM 4-23。媒介物(+E2)為含有炔雌醇(0.1mg/kg)的溶劑/緩沖液。媒介物(-E2)為不含有炔雌醇的溶劑/緩沖液。

圖6示出一組7-8只攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物的免疫受損小鼠中歷時(shí)35天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天給予枸櫞酸他莫昔芬，以50mg/kg給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM 4-23。

圖7示出一組7只攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤(NSG OVX中的BC PDX模型)異種移植物的免疫受損小鼠中歷時(shí)28天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以200mg/kg每周三次皮下給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以10和100mg/kg/天給予ERM 4-23。

圖8和9示出攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤、患者衍生的(BC PDX模型)異種移植物模型的免疫受損小鼠中ERα(alpha)與肌動(dòng)蛋白水平的比率(圖8)以及PR-A與肌動(dòng)蛋白水平的比率(圖9)的條形圖：所述模型歷時(shí)4天每日一次PO(口服)給予100微升(μl)媒介物，以200mg/kg給予氟維司群，以100mg/kg給予ERM 1-3，以及以100mg/kg給予ERM 4-23。

圖10示出乳腺癌患者在基線、治療前(左側(cè))和以600mg/天連續(xù)每日口服給予ERM 1-3(ARN-810)一個(gè)月后(右側(cè))的[¹⁸F]FES-PET圖像，其中在給予后23小時(shí)采集圖像。確認(rèn)患者具有含ESR1D538G突變的軟組織損害。

定義

除非另有定義，否則本申請(qǐng)使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與所要求保護(hù)的主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。除非另有說(shuō)明，否則在本申請(qǐng)的整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容中提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、公開(kāi)的申請(qǐng)和出版物、GENBANK序列、網(wǎng)站和其它公開(kāi)的材料通過(guò)引用整體并入。在本申請(qǐng)中存在術(shù)語(yǔ)的多個(gè)定義的情況下，以本部分中的定義為準(zhǔn)。在參考URL或其它這樣的標(biāo)識(shí)符或地址時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，這樣的標(biāo)識(shí)符可以改變，并且互聯(lián)網(wǎng)上的特定信息可為不定的，但是等效信息是已知的并且可容易地訪問(wèn)，諸如通過(guò)搜索互聯(lián)網(wǎng)和/或適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫(kù)。有關(guān)參考文獻(xiàn)證明這種信息的可用性和公開(kāi)傳播。通常，細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞感染、抗體生產(chǎn)和分子生物學(xué)方法的操作是本領(lǐng)域常用的方法。這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可在例如參考手冊(cè)諸如Sambrook et al.(2000)和Ausubel et al.(1994)中找到。

除非上下文另有明確指示，否則本申請(qǐng)使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代。在本申請(qǐng)中，除非另有特別說(shuō)明，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)。如本申請(qǐng)所用，除非另有說(shuō)明，否則“或”的使用意指“和/或”。此外，術(shù)語(yǔ)“包括”以及其它形式(例如，“包含”、“含有”和“涵蓋”)的使用是非限制性的。

本申請(qǐng)使用的范圍和量可表示為“約”特定值或范圍。約還包括確切量。因此，“約5μg”意指“約5μg”也指“5μg”。通常，術(shù)語(yǔ)“約”包括預(yù)期在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)的量。

本申請(qǐng)使用的“雌激素受體多肽”或“ER多肽”是指任何雌激素受體蛋白或多肽，包括但不限于，重組產(chǎn)生的蛋白、合成產(chǎn)生的蛋白、天然雌激素受體蛋白質(zhì)和從細(xì)胞或組織提取的雌激素受體蛋白。ER多肽包括來(lái)自不同物種的相關(guān)多肽，包括但不限于人源和非人源的動(dòng)物。非人源的ER多肽包括但不限于，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如黑猩猩和猿)、鼠科動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)、犬科動(dòng)物(狗)、貓科動(dòng)物(貓)、兔屬動(dòng)物(兔)、禽類(lèi)(鳥(niǎo))、?？苿?dòng)物(牛)、綿羊類(lèi)(綿羊)、豬類(lèi)(豬)、馬科動(dòng)物(馬)、魚(yú)類(lèi)(魚(yú))、蛙科動(dòng)物(蛙)和其它哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物ER多肽。示例性ER多肽包括例如SEQ ID NO:2。ER多肽包括野生型ER、等位基因變體同工型、體細(xì)胞突變(包括在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的那些)、來(lái)自核酸的合成分子、從人組織和細(xì)胞分離的蛋白質(zhì)以及它們的經(jīng)修飾形式。本申請(qǐng)?zhí)峁┑腅R多肽可通過(guò)缺失、添加或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)修飾一級(jí)氨基酸序列，從而得到進(jìn)一步修飾。本申請(qǐng)使用的ER蛋白包括ER多肽的單體和二聚體形式，包括ER-α和ER-β多肽的二聚體形式(例如，ER-α(αα)或ER-β(ββ)同二聚體或ERαβ(αβ)異二聚體)。

本申請(qǐng)使用的“突變的雌激素受體”或“突變型ER”是指與野生型ER相比通過(guò)缺失、添加或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)修飾一級(jí)氨基酸序列從而得到修飾的任何雌激素受體蛋白或多肽。在一些實(shí)施方案中，突變型ER包括突變型ER多肽和野生型多肽的異二聚體。在一些實(shí)施方案中，突變雌激素受體(ER)包含兩種突變型ER多肽的同二聚體。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”意指直接或間接與靶標(biāo)相互作用從而改變靶標(biāo)的活性，包括(僅舉例來(lái)說(shuō))增強(qiáng)靶標(biāo)的活性、抑制靶標(biāo)的活性、限制靶標(biāo)的活性或者擴(kuò)展靶標(biāo)的活性。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”是指直接或間接與靶標(biāo)相互作用的分子。所述相互作用包括但不限于，激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑、拮抗劑、降解劑或它們的組合的相互作用。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是拮抗劑。本申請(qǐng)使用的雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)劑是與雌激素受體(例如，ER-α)相互作用的分子。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是降解劑。

本申請(qǐng)使用的“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”或“SERM”是指差異性調(diào)節(jié)不同組織中的雌激素受體活性的分子。例如，在一些實(shí)施方案中，SERM在一些組織中展現(xiàn)ER拮抗劑活性，且在其它組織中展現(xiàn)ER激動(dòng)劑活性。在一些實(shí)施方案中，SERM在一些組織中展現(xiàn)ER拮抗劑活性，在其它組織中展現(xiàn)最小ER激動(dòng)劑活性或無(wú)該活性。在一些實(shí)施方案中，SERM在乳腺組織、卵巢組織、子宮內(nèi)膜組織和/或子宮頸組織中展現(xiàn)ER拮抗劑活性，但在子宮組織中展現(xiàn)最小ER激動(dòng)劑活性或無(wú)該活性。在一些實(shí)施方案中，SERM展現(xiàn)ER降解性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，SERM在一些組織中展現(xiàn)ER降解性質(zhì)，而在其它組織中沒(méi)有ER降解性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，SERM展現(xiàn)ER降解和ER拮抗劑性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，SERM在一些組織中展現(xiàn)ER降解和ER拮抗劑性質(zhì)，但在其它組織中展現(xiàn)ER降解性質(zhì)而無(wú)ER激動(dòng)劑活性。在一些實(shí)施方案中，SERM在一些組織中展現(xiàn)ER降解和ER拮抗劑性質(zhì)，但在其它組織中展現(xiàn)ER拮抗劑性質(zhì)而無(wú)ER降解性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，SERM在乳腺組織、卵巢組織、子宮內(nèi)膜組織和/或子宮頸組織中展現(xiàn)ER降解和ER拮抗劑性質(zhì)，但在子宮組織中展現(xiàn)最小或沒(méi)有ER降解和/或ER拮抗劑性質(zhì)。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指結(jié)合核激素受體并隨后降低激動(dòng)劑誘導(dǎo)的核激素受體轉(zhuǎn)錄活性的小分子藥物。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是指不存在已知激動(dòng)劑的情況下結(jié)合核激素受體并隨后提高核激素受體轉(zhuǎn)錄活性的小分子藥物。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“反相激動(dòng)劑”是指不存在已知激動(dòng)劑的情況下結(jié)合核激素受體并隨后降低核激素受體轉(zhuǎn)錄活性的基礎(chǔ)水平的小分子藥物。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“降解劑”是指結(jié)合核激素受體并隨后降低所述受體的穩(wěn)態(tài)蛋白水平的小分子藥物。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的降解劑降低穩(wěn)態(tài)雌激素受體水平至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性雌激素受體降解劑”或“SERD”是指優(yōu)先結(jié)合雌激素受體而非其它受體并隨后降低穩(wěn)態(tài)雌激素受體水平的小分子藥物。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“ER依賴(lài)性”是指不存在雌激素受體的情況下不會(huì)發(fā)生或不會(huì)以相同程度發(fā)生的疾病或病癥。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“ER介導(dǎo)的”是指不存在雌激素受體的情況下不會(huì)發(fā)生但可在存在雌激素受體時(shí)發(fā)生的疾病或病癥。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“ER敏感性”是指不存在雌激素的情況下不會(huì)發(fā)生或不會(huì)以相同程度發(fā)生的疾病或病癥。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指傾向于以不受控制的方式增殖的細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，并且在一些情況下是指轉(zhuǎn)移(擴(kuò)散)。癌癥的類(lèi)型包括但不限于，處于有或無(wú)轉(zhuǎn)移的疾病的任何階段的實(shí)體瘤，諸如膀胱腫瘤、腸腫瘤、腦腫瘤、乳腺腫瘤、子宮內(nèi)膜腫瘤、心臟腫瘤、腎腫瘤、肺腫瘤、子宮腫瘤、淋巴組織腫瘤(淋巴瘤)、卵巢腫瘤、胰腺或其它內(nèi)分泌器官腫瘤(甲狀腺腫瘤)、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤(黑色素瘤或基底細(xì)胞癌)或血液腫瘤(諸如白血病和淋巴瘤)。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是癌(例如，腺癌)或肉瘤。

癌癥的其它非限制性實(shí)例包括急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、肛門(mén)癌、闌尾癌、星形細(xì)胞瘤、非典型畸胎瘤/橫紋肌瘤、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和惡性纖維組織細(xì)胞瘤)、腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、腦和脊髓腫瘤、乳腺癌、支氣管腫瘤、伯基特淋巴瘤、子宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性骨髓性白血病、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、胚胎腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、成室管膜細(xì)胞瘤、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤家族腫瘤、眼癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、膽囊癌、胃部(胃)癌、胃腸道類(lèi)癌腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、胃腸道間質(zhì)細(xì)胞腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑素瘤、胰島細(xì)胞腫瘤(內(nèi)分泌胰腺)、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥、喉癌、白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛細(xì)胞白血病、肝癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、伯基特淋巴瘤、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、間皮瘤、口腔癌(mouth cancer)、慢性骨髓性白血病、骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、口腔癌(oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤、骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低惡性潛在腫瘤、胰腺癌、乳頭狀瘤、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、中間分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、成松果體細(xì)胞瘤和幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、成胸膜肺細(xì)胞瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞(腎)癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌癥、肉瘤、尤文肉瘤家族腫瘤、肉瘤、卡波西肉瘤、塞扎里綜合征、皮膚癌、小細(xì)胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃部(胃)癌、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、睪丸癌、喉癌(throat cancer)、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、維爾姆斯瘤。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“乳腺癌”是指組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌為肉瘤。

術(shù)語(yǔ)“局部晚期乳腺癌”是指已經(jīng)從在乳房開(kāi)始的地方擴(kuò)散到附近組織或淋巴結(jié)，而不是擴(kuò)散到身體的其它部分的癌癥。

術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移性乳腺癌”是指已經(jīng)從乳房擴(kuò)散到身體的其它部分的癌癥，諸如骨、肝、肺或腦。轉(zhuǎn)移性乳腺癌也稱(chēng)為IV期乳腺癌。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“共同給予”等意在涵蓋向單個(gè)患者給予所選擇的治療劑，并且旨在包括其中通過(guò)相同或不同的給予途徑或在相同或不同的時(shí)間給予所述藥物的治療方案。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”是指待給予的藥物或化合物的足夠量，其將在一定程度上緩解待治療的疾病或病癥的一種或多種癥狀。所述結(jié)果包括減少和/或減輕疾病的體征、癥狀或原因，或生物系統(tǒng)的任何其它期望的改變。例如，用于治療用途的“有效量”是包含本申請(qǐng)公開(kāi)的化合物的組合物的量，其需要提供疾病癥狀的臨床顯著降低。在任何個(gè)別情況下，任選地使用技術(shù)諸如劑量遞增研究來(lái)確定合適的“有效”量。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“治療”(“treat”、“treating”或“treatment”)包括緩解、減輕或改善疾病或病癥的至少一種癥狀，預(yù)防另外的癥狀，抑制疾病或病癥，例如預(yù)防性和/或治療性地阻止疾病或病癥的發(fā)展、緩解疾病或病癥、引起疾病或病癥的消退、延遲病癥的進(jìn)展、緩解由疾病或病癥引起的病癥或停止疾病或病癥的癥狀。在一些實(shí)施方案中，治療包括延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展存活期。在一些實(shí)施方案中，治療包括與其它治療選擇相比降低疾病進(jìn)展的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中，其它治療選擇包括但不限于激素治療(例如，抗雌激素療法，諸如他莫昔芬和/或氟維司群或芳香酶療法)。

術(shù)語(yǔ)“無(wú)進(jìn)展存活”是在疾病(諸如癌癥)的治療期間和之后患者帶病生活但其并未惡化的時(shí)間的量。在臨床試驗(yàn)中，測(cè)量無(wú)進(jìn)展存活期是一種查看治療產(chǎn)生效果好壞的方式。

術(shù)語(yǔ)“無(wú)轉(zhuǎn)移存活”或“MFS”是指研究中在沒(méi)有癌癥擴(kuò)散持續(xù)確定的時(shí)間段或死亡的情況下存活的受試者的百分比。MFS通常以研究中由治療開(kāi)始的時(shí)間報(bào)告。對(duì)于個(gè)體或研究群體報(bào)道MFS。在一些實(shí)施方案中，無(wú)轉(zhuǎn)移存活的增加為約1個(gè)月、約2個(gè)月、約2個(gè)月、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月、約6個(gè)月、約7個(gè)月、約8個(gè)月、約10個(gè)月、約11個(gè)月、約12個(gè)月、約13個(gè)月、約14個(gè)月、約15個(gè)月、約16個(gè)月、約17個(gè)月、約18個(gè)月、約19個(gè)月、約20個(gè)月或多于20個(gè)月。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合”意指由多于一種活性成分混合或組合產(chǎn)生的產(chǎn)品且包括活性成分的固定和非固定組合。術(shù)語(yǔ)“固定組合”意指活性成分，例如式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物和共藥物(co-agent)，以單一實(shí)體或劑量的形式同時(shí)給予于患者。術(shù)語(yǔ)“非固定組合”意指活性成分，例如式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物和共藥物，作為單獨(dú)的實(shí)體同時(shí)、共同或先后給予患者，而沒(méi)有特定的中間時(shí)間限制，其中所述給予在患者體內(nèi)提供有效水平的兩種化合物。后者也適用于混合療法(cocktail therapy)，例如三種或更多種活性成分的給予。

本申請(qǐng)公開(kāi)的化合物的“代謝物”是當(dāng)化合物被代謝時(shí)形成的該化合物的衍生物。術(shù)語(yǔ)“活性代謝物”是指化合物代謝時(shí)形成的化合物的生物活性衍生物。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“代謝”是指特定物質(zhì)被生物體改變的過(guò)程(包括但不限于水解反應(yīng)和酶催化的反應(yīng))的總和。因此，酶可對(duì)化合物產(chǎn)生特定的結(jié)構(gòu)改變。例如，細(xì)胞色素P450催化多種氧化和還原反應(yīng)，而二磷酸尿苷葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶催化經(jīng)活化的葡糖醛酸分子轉(zhuǎn)移至芳族醇、脂族醇、羧酸、胺和游離巰基。任選地通過(guò)以下方式鑒定本申請(qǐng)公開(kāi)的化合物的代謝物：向宿主給予化合物并分析來(lái)自宿主的組織樣品，或使化合物與肝細(xì)胞在體外孵育并分析所得化合物。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“藥用的”是指不消除本申請(qǐng)所述的ER抑制劑化合物的生物活性或性質(zhì)的物質(zhì)(例如，載體或稀釋劑)，并且相對(duì)無(wú)毒(即，將所述物質(zhì)給予個(gè)體而不引起不期望的生物效應(yīng)或以有害方式與包含它的組合物的任何組分相互作用)。

本申請(qǐng)使用的“對(duì)照”是指與測(cè)試樣品基本相同的樣品，除了其不用測(cè)試參數(shù)處理，或者如果其為血漿樣品，則其可來(lái)自未受所研究的病癥侵襲的正常志愿者。對(duì)照也可為內(nèi)部對(duì)照。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”、“個(gè)體”和“患者”可互換使用。上述術(shù)語(yǔ)均不被解釋為需要醫(yī)療專(zhuān)業(yè)人員(例如，醫(yī)生、護(hù)士、醫(yī)生助理、護(hù)理員、臨終關(guān)懷工作者(hospice worker))的監(jiān)督。本申請(qǐng)使用的受試者可為任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物(例如，人或非人動(dòng)物，例如，黑猩猩、猿、猴、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、犬、貓、大鼠、小鼠、豚鼠等)和非哺乳動(dòng)物。在本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ê徒M合物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。

術(shù)語(yǔ)“連續(xù)每日給藥方案”是指沒(méi)有任何休藥期的每天給予雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)每日給藥方案包括在每天大致相同的時(shí)間每天給予雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

“烷基”是指脂族烴基。烷基部分可為支鏈或直鏈?！巴榛被鶊F(tuán)可具有1至6個(gè)碳原子(每當(dāng)在本申請(qǐng)出現(xiàn)時(shí)，數(shù)值范圍諸如“1至6”是指給定范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)；例如，“1至6個(gè)碳原子”意指烷基可由1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等，直至并包括6個(gè)碳原子組成，但是本定義也涵蓋沒(méi)有指定數(shù)值范圍的術(shù)語(yǔ)“烷基”的出現(xiàn))。在一個(gè)方面，烷基選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但絕不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等。在一些實(shí)施方案中，烷基的1個(gè)或更多個(gè)氫原子被1個(gè)或多個(gè)氘原子替代。

“烷氧基”是指(烷基)O-基團(tuán)，其中烷基如本申請(qǐng)所定義。

術(shù)語(yǔ)“芳族”是指具有包含4n+2個(gè)π電子的離域π電子系統(tǒng)的平面環(huán)，其中n為整數(shù)。芳族為任選取代的。術(shù)語(yǔ)“芳族的”包括碳環(huán)芳基(“芳基”，例如，苯基)和雜環(huán)芳基(或“雜芳基”或“雜芳族”)基團(tuán)(例如吡啶)。該術(shù)語(yǔ)包括單環(huán)或稠環(huán)多環(huán)(即，共享相鄰碳原子對(duì)的環(huán))基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”是指其中形成環(huán)骨架的原子均為碳原子的環(huán)或環(huán)系。因此，該術(shù)語(yǔ)使碳環(huán)區(qū)別于其中環(huán)骨架含有至少一個(gè)不同于碳的原子的雜環(huán)。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”是指芳族環(huán)，其中形成環(huán)的每個(gè)原子為碳原子。在一個(gè)方面，芳基為苯基或萘基。在一個(gè)方面，芳基為苯基。在一個(gè)方面，芳基為C₆-C₁₀芳基。在一些實(shí)施方案中，芳基的1個(gè)或多個(gè)氫原子被1個(gè)或多個(gè)氘原子替代。

術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指環(huán)狀脂族烴基。環(huán)烷基包括具有3至10個(gè)環(huán)原子的基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，環(huán)烷基選自環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。在一個(gè)方面，環(huán)烷基是C₃-C₆環(huán)烷基。

術(shù)語(yǔ)“鹵代”或“鹵素”或“鹵化物”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。在一些實(shí)施方案中，鹵素是F或Cl。在一些實(shí)施方案中，鹵素為F。

術(shù)語(yǔ)“氟烷基”是指其中一個(gè)或多個(gè)氫原子被氟原子替代的烷基。在一些實(shí)施方案中，氟烷基為氟C₁-C₆烷基。在一些實(shí)施方案中，氟烷基為單氟烷基，其中烷基的一個(gè)氫原子被氟原子替代。在一些實(shí)施方案中，氟烷基為二氟烷基，其中烷基的兩個(gè)氫原子被氟原子替代。在一些實(shí)施方案中，氟烷基為三氟烷基，其中烷基的三個(gè)氫原子被氟原子替代。在一些實(shí)施方案中，氟烷基為單氟烷基，二氟烷基或三氟烷基。在一些實(shí)施方案中，單氟烷基為-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CHFCH₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂、-CH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-CH₂CH₂CH₂CF₃、-CHCH₃CF₃、-CH(CF₃)₂或-CF(CH₃)₂。

術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”或“雜環(huán)的”是指在一個(gè)或多個(gè)環(huán)中含有一至四個(gè)雜原子的雜芳族環(huán)(也稱(chēng)為雜芳基)和雜環(huán)烷基環(huán)(也稱(chēng)為雜脂環(huán)基)，其中在所述環(huán)中的每個(gè)雜原子選自O(shè)、S和N，其中在其環(huán)系中的每個(gè)雜環(huán)基團(tuán)具有3至10個(gè)原子，并且條件是任何環(huán)不含有兩個(gè)相鄰的O或S原子。非芳族雜環(huán)基團(tuán)(也稱(chēng)為雜環(huán)烷基)包括在其環(huán)系中僅具有3個(gè)原子的基團(tuán)，但芳族雜環(huán)基團(tuán)在其環(huán)系中必須具有至少5個(gè)原子。雜環(huán)基團(tuán)包括苯并稠合環(huán)系。3元雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例是氮雜環(huán)丙基。4元雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例是氮雜環(huán)丁基。5元雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例是噻唑基。6元雜環(huán)基的實(shí)例是吡啶基，且10元雜環(huán)基的實(shí)例是喹啉基。非芳族雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例為吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、噁唑烷酮基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉基、硫嗎啉基、噻噁烷基、哌嗪基、氮雜環(huán)丙基、氮雜環(huán)丁基、氧雜環(huán)丁基、硫雜環(huán)丁基、高哌啶基、氧雜環(huán)庚基、硫雜環(huán)庚基、氧氮雜基、二氮雜基、硫氮雜基、1,2,3,6-四氫吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、二氫吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧雜環(huán)戊基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫雜環(huán)戊基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮雜二環(huán)[3.1.0]己基、3-氮雜二環(huán)[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。芳族雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例為吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮雜萘基和呋喃并吡啶基。當(dāng)可能時(shí)，前述基團(tuán)可為C-附接的(或C-連接的)或N-附接的。例如，衍生自吡咯的基團(tuán)可為吡咯-1-基(N-附接的)或吡咯-3-基(C-連接的)。此外，衍生自咪唑的基團(tuán)可為咪唑-1-基或咪唑-3-基(均為N-附接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(均為C-附接的)。雜環(huán)基團(tuán)包括苯并稠合環(huán)系。

術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指包括一個(gè)或多個(gè)選自氮、氧和硫的環(huán)雜原子的芳基。單環(huán)雜芳基包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、噠嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。在一些實(shí)施方案中，雜芳基在環(huán)中含有0-3個(gè)N原子。在一些實(shí)施方案中，雜芳基在環(huán)中含有1-3個(gè)N原子。在一些實(shí)施方案中，雜芳基在環(huán)中含有0-3個(gè)N原子、0-1個(gè)O原子，和0-1個(gè)S原子。在一些實(shí)施方案中，單環(huán)雜芳基為5元或6元雜芳基。

“雜環(huán)烷基”或“雜脂環(huán)基”是指其中環(huán)烷基的至少一個(gè)碳原子被氮(未經(jīng)取代或經(jīng)取代的，例如，-NH-、-NR^e-)、氧(-O-)或硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)₂-)取代的環(huán)烷基。所述基團(tuán)可與芳基或雜芳基稠合。在一些實(shí)施方案中，所述雜環(huán)烷基選自噁唑烷酮基、吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉基、硫嗎啉基、哌嗪基和二氫吲哚基。術(shù)語(yǔ)雜脂環(huán)還包括碳水化合物的所有環(huán)形式，包括但不限于單糖、二糖和寡糖。在一個(gè)方面，雜環(huán)烷基為C₂-C₁₀雜環(huán)烷基。在另一方面，雜環(huán)烷基為C₄-C₁₀雜環(huán)烷基。在一些實(shí)施方案中，雜環(huán)烷基在環(huán)中含有0-2個(gè)N原子。在一些實(shí)施方案中，雜環(huán)烷基在環(huán)中含有0-2個(gè)N原子、0-2個(gè)O原子和0-1個(gè)S原子。

術(shù)語(yǔ)“任選取代的”或“經(jīng)取代的”意指所述基團(tuán)可取代有一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)和獨(dú)立地選自以下的額外基團(tuán)：烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、芳基氧基、烷基硫基、芳基硫基、烷基亞砜、芳基亞砜、烷基砜、芳基砜、氰基、鹵素、硝基、鹵代烷基、氟烷基、氟烷氧基和氨基(包括單取代和二取代的氨基)及其經(jīng)保護(hù)的衍生物。在一些實(shí)施方案中，任選的取代基獨(dú)立地選自鹵素、-CN、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂烷基、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-S(＝O)₂NH₂、-S(＝O)₂NH(烷基)、-S(＝O)₂N(烷基)₂烷基、環(huán)烷基、氟烷基、雜烷基、烷氧基、氟烷氧基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、芳基氧基、烷基硫基、芳基硫基、烷基亞砜、芳基亞砜、烷基砜和芳基砜。在一些實(shí)施方案中，任選的取代基獨(dú)立地選自鹵素、-CN、-NH₂、-OH、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-CH₃、-CH₂CH₃、-CF₃、-OCH₃和-OCF₃。在一些實(shí)施方案中，取代基取代有一個(gè)或兩個(gè)前述基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，脂族碳原子(非環(huán)狀或環(huán)狀、飽和或不飽和的碳原子，不包括芳族碳原子)上的任選取代基包括氧代(＝O)。

用于診斷和治療的示例性雌激素受體突變體

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑脑\斷方法包括檢測(cè)ESR1基因中的一個(gè)或多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒òㄖ委熅哂蠩SR1基因中的一個(gè)或多個(gè)突變的患者。用于診斷和治療的示例性ESR1突變包括，但不限于核苷酸插入、缺失或取代。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致編碼的ER多肽中氨基酸的取代的核苷酸取代(即，錯(cuò)義突變)。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致編碼的ER多肽中氨基酸的插入和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代的核苷酸插入。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致編碼的ER中的氨基酸缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代的核苷酸缺失。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致雜合ER多肽的基因組易位，其中ER多肽的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一蛋白或其部分融合。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致截短的ER多肽(即，無(wú)義突變)的核苷酸插入、缺失或取代。在一些實(shí)施方案中，ESR1突變導(dǎo)致編碼的突變ER-α多肽的活性增加。在一些實(shí)施方案中，所述突變賦予編碼的突變ER-α多肽的配體非依賴(lài)性激活。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致組成性激活的突變ER-α多肽。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α在不存在雌二醇的情況下展現(xiàn)組成性活性。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變?cè)黾恿薊SR1基因產(chǎn)物的表達(dá)(即，增加野生型ER-α多肽的表達(dá))。

在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致在選自以下的位置具有氨基酸替換的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致在選自以下的位置具有氨基酸替換的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置380、463、534、535、536、537和538。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致具有選自以下的氨基酸替換的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有兩個(gè)或更多個(gè)ESR1基因中的突變。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的6位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為H6Y取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼H6的密碼子中的C16T取代(例如，CAC至TAC)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的118位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為S118P取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼S118的密碼子中的T352C取代(例如，TCG至CCG)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的269位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為R269C取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼R269的密碼子中的C805T取代(例如，CGC至TGC)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的311位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為T(mén)311M取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C932T取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的341位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為S341L取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1022T取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起在SEQ ID NO:2的氨基酸G344和L345之間的氨基酸插入的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸插入為C氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)镾EQ ID NO:l的核苷酸1032和1033之間核苷酸GCT的插入。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的350位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為A350E取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1049A取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的380位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為E380Q取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼E380的密碼子中的G1138C取代(例如，GAA至CAA)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的392位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為V392I取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼V392的密碼子中的G1174A取代(例如，GTC至ATC)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的394位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為R394H取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的G1181A取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起在SEQ ID NO:2的413位結(jié)束的截短蛋白的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸截短為Q414*突變，歸因于引入終止密碼子的核苷酸序列中的突變。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1240T取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的433位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為S433P取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的T1297C取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的463位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為S463P取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼S463的密碼子中的T1387C取代(例如，TCC至CCC)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的503位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為R503W取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的C1507T取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的534位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為V534E取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼V534的密碼子中的T1601A取代(例如，GTG至GAG)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的535位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為P535H取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼P535的密碼子中的C1604A取代(例如，CCC至CAC)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的536位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為L(zhǎng)536R取代。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為L(zhǎng)536P取代。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為L(zhǎng)536Q取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼L536的密碼子中的T1607A取代和C1608A取代(例如，CTC至CAA)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的537位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為Y537N取代。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為Y537C取代。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為Y537S取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的T1609A取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的A1610G取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的538位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為D538G取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的A1613G取代。

在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變包括引起SEQ ID NO:2的555位氨基酸替換的ESRl基因中的錯(cuò)義突變。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸替換為R555C取代。在一些實(shí)施方案中，所述錯(cuò)義突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:l的核苷酸序列的編碼R555的密碼子中的C1663T取代(例如，CGT至TGT)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESRl突變?yōu)镋SRl基因的配體結(jié)合域中的缺失。在一些實(shí)施方案中，所述ESRl突變?yōu)?個(gè)或更多個(gè)核苷酸的框內(nèi)缺失(in frame deletion)。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)橐粋€(gè)或多個(gè)ESR1外顯子中3個(gè)或更多個(gè)核苷酸的框內(nèi)缺失。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)镋SR1基因的外顯子8、9、10、11或12中3個(gè)或更多個(gè)核苷酸的框內(nèi)缺失。在一些實(shí)施方案中，所述ESRl突變?yōu)楦鶕?jù)SEQ ID NO:1的1046-1051核苷酸(TGGCAG)的6個(gè)核苷酸缺失，其導(dǎo)致349-351位氨基酸(LAD)的缺失和在SEQ ID NO:2的ER多肽的349位氨基酸處插入H。

在一些實(shí)施方案中，ESR1基因中的錯(cuò)義突變導(dǎo)致SEQ ID NO:2的選自以下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換：在6位組氨酸至酪氨酸取代(H6Y)；在118位絲氨酸至脯氨酸取代(S118P)；在269位精氨酸至半胱氨酸取代(R269C)；在311位蘇氨酸至甲硫氨酸取代(T311M)；在341位絲氨酸至亮氨酸取代(S341L)；在350位丙氨酸至谷氨酰胺取代(A350E)；在380位谷氨酸至谷氨酰胺取代(E380Q)；在392位纈氨酸至異亮氨酸取代(V392I)；在394位精氨酸至組氨酸取代(R394H)；在414位谷氨酰胺取代，例如，插入至終止密碼子(Q414*)；在433位絲氨酸至脯氨酸取代(S433P)；在463位絲氨酸至脯氨酸取代(S463P)；在503位精氨酸至色氨酸取代(R503W)；在534位纈氨酸至谷氨酸取代(V534E)；在535位脯氨酸至組氨酸取代(P535H)；在536位亮氨酸至精氨酸取代536(L536R)；在536位亮氨酸至脯氨酸取代(L536P)；在536位亮氨酸至谷氨酰胺取代(L536Q)；在537位酪氨酸至天冬酰胺取代(Y537N)；在537位酪氨酸至半胱氨酸取代(Y537C)；在537位酪氨酸至絲氨酸取代(Y537S)；在538位天冬氨酸至甘氨酸取代(D538G)；在555位精氨酸至半胱氨酸取代(R555C)。

在一些實(shí)施方案中，所述ESRl突變?yōu)閷?dǎo)致ER-YAP1融合蛋白的ESR1基因與Yes激活蛋白1(YAP1)基因之間的基因組易位。

在一些實(shí)施方案中，所述ESRl基因包含兩個(gè)或更多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，所述ESRl基因包含在鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或配體結(jié)合域中的兩個(gè)或更多個(gè)突變。

雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物

本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜谥委熅哂蠩SR1基因突變的受試者的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)化合物。在一些實(shí)施方案中，雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物為式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物，其包括它們的藥用鹽、溶劑化物、N-氧化物、代謝物和前藥。

在一個(gè)方面，用于本申請(qǐng)所述方法和組合物的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物為式(A)化合物或其藥用鹽或溶劑化物：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

R^b為C₁-C₆烷基或C₃-C₆環(huán)烷基；

R^c為H或F；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

X為CH或N；

n為0、1或2。

在一些實(shí)施方案中，R^a為-CO₂H。在一些實(shí)施方案中，R^a為選自以下的5元雜環(huán)：

在一些實(shí)施方案中，R^c為H。在一些實(shí)施方案中，R^c為F。

在一些實(shí)施方案中，R^b為-CH₃、-CH₂CH₃、環(huán)丙基或環(huán)丁基。在一些實(shí)施方案中，R^b為-CH₂CH₃。在一些實(shí)施方案中，R^b為環(huán)丁基。

在一些實(shí)施方案中，X為CH。在一些實(shí)施方案中，X為N。

在一些實(shí)施方案中，n為1或2。在一些實(shí)施方案中，n為1。在一些實(shí)施方案中，n為2。在一些實(shí)施方案中，n為0。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(A)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，其中R^a為-CO₂H，R^b為C₁-C₆烷基，R^c為H，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自鹵素，X為CH；且n為2。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(A)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，其中R^a為-CO₂H，R^b為乙基，R^c為H，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自F和Cl，X為CH；且n為2。

在一些實(shí)施方案中，式(A)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(A-1)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(A)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物為表1所述的化合物：

表1.

在另一方面，用于本申請(qǐng)所述方法和組合物的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物為式(B)化合物或其藥用鹽或溶劑化物：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

環(huán)C為

環(huán)D為苯基或噻吩基；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

n為0、1或2。

在一些實(shí)施方案中，環(huán)C為

在一些實(shí)施方案中，環(huán)C為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，R^a為-CO₂H。

在一些實(shí)施方案中，n為1或2。

在一些實(shí)施方案中，n為1。

在一些實(shí)施方案中，n為2。在一些實(shí)施方案中，n為0。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，式(B)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物為表2所述的化合物：

表2.

在再一個(gè)方面，用于本申請(qǐng)所述方法和組合物的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物為式(C)化合物或其藥用鹽或溶劑化物：

其中，

R^a為-CO₂H或選自以下的5元雜環(huán)：

R^b為C₁-C₆烷基或C₃-C₆環(huán)烷基；

每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OR^e、-NHR^e、-NR^eR^f、-SR^e、-S(＝O)R^f、-S(＝O)₂R^f、C₁-C₆烷基和氟C₁-C₆烷基；

每個(gè)R^e獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R^f、-C(＝O)OR^f、-C(＝O)NHR^f、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R^f獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

n為0、1或2。

在一些實(shí)施方案中，R^a為-CO₂H。

在一些實(shí)施方案中，R^b為-CH₃、-CH₂CH₃、環(huán)丙基或環(huán)丁基。

在一些實(shí)施方案中，R^b為-CH₂CH₃。

在一些實(shí)施方案中，R^b為環(huán)丁基。

在一些實(shí)施方案中，n為1或2。在一些實(shí)施方案中，n為1。在一些實(shí)施方案中，n為2。在一些實(shí)施方案中，n為0。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-S(＝O)₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^d獨(dú)立地選自H、F、Cl、-CN、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-CH₃、-CH₂H₃和-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，式(C)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有式(C-1)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(C)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物為表3所述的化合物：

表3.

在另一方面，用于本申請(qǐng)所述方法和組合物的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物為式(D)化合物或其藥用鹽或溶劑化物：

其中，

R¹為H、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R²為H、F、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

R³為H、鹵素、-CN、-OR⁶、-NHR⁶、-NR⁶R⁷、-SR⁶、-S(＝O)R⁷、-S(＝O)₂R⁷、C₁-C₄烷基或氟C₁-C₄烷基；

每個(gè)R⁴獨(dú)立地選自H、鹵素、-CN、-OH、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₄烷基、氟C₁-C₄烷氧基和C₁-C₄烷氧基；

每個(gè)R⁵為H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃；

每個(gè)R⁶獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

每個(gè)R⁷獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的C₃-C₆環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)C₂-C₆雜環(huán)烷基、經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的單環(huán)雜芳基；

n為0、1或2；且

t為1或2。

在一些實(shí)施方案中，R¹為H、-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為F、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CHFCH₃、-CH₂CH₂F、-CH₂CHF₂、-CH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-CH₂CH₂CH₂CF₃、-CHCH₃CF₃、-CH(CF₃)₂或-CF(CH₃)₂。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為F、-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為-CH₃、-CH₂F、-CHF₂或-CF₃。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為-CH₂F。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為-CH₃。

在一些實(shí)施方案中，t為1。在一些實(shí)施方案中，t為2。

在一些實(shí)施方案中，R³為-OR⁶。在一些實(shí)施方案中，R³為-OH。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R⁴獨(dú)立地選自H、F、Cl、-OH、-CH₃、-CF₃或-OCH₃。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R⁵獨(dú)立地選自H和F。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R⁶獨(dú)立地選自H、-C(＝O)R⁷、-C(＝O)OR⁷、-C(＝O)NHR⁷、C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R⁶為H。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R⁷獨(dú)立地選自C₁-C₆烷基、氟C₁-C₆烷基和經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的苯基。

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為或

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-1)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-2)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-3)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-4)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-5)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物具有以下式(D-6)的結(jié)構(gòu)：

在一些實(shí)施方案中，為

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(D)化合物、式(D-1)化合物或式(D-3)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，其中R¹為H，R²為氟C₁-C₄烷基，R³為H，R⁴為-OH，R⁵為H，R⁶為H，n為1，t為1。

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(D)化合物、式(D-1)化合物或式(D-3)化合物或其藥用鹽或溶劑化物，其中R¹為H，R²為-CH₂F，R³為H，R⁴為-OH，R⁵為H，R⁶為H，n為1，t為1。

在一些實(shí)施方案中，式(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物或其藥用鹽或溶劑化物為表4所述的化合物：

表4.

雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物的其它形式

在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物用作藥用鹽。藥用鹽的類(lèi)型包括但不限于：(1)酸加成鹽，其通過(guò)使化合物的游離堿形式與藥用無(wú)機(jī)酸反應(yīng)形成鹽，諸如，例如，鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、偏磷酸鹽等；或與藥用有機(jī)酸反應(yīng)形成鹽，諸如，例如乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、乙醇酸鹽、丙酮酸鹽、乳酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、三氟乙酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸鹽、肉桂酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、1,2-乙二磺酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、4-甲基二環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸鹽、葡庚糖酸鹽、4,4'-亞甲基二-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)鹽、3-苯基丙酸鹽、三甲基乙酸鹽、叔丁基乙酸鹽、月桂基硫酸鹽、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、羥基萘甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、粘康酸鹽、丁酸鹽、苯乙酸鹽、苯丁酸鹽、丙戊酸鹽等；(2)當(dāng)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子代替時(shí)形成的鹽，所述金屬離子例如，堿金屬離子(例如鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽)，堿土金屬離子(例如鎂鹽或鈣鹽)或鋁離子(例如鋁鹽)。在一些情況下，本申請(qǐng)所述的化合物可與有機(jī)堿配位形成鹽，諸如但不限于乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、氨基丁三醇鹽、N-甲基葡糖胺鹽、二環(huán)己胺鹽或三(羥基甲基)甲胺鹽。在其它情況下，本申請(qǐng)所述的化合物可與氨基酸形成鹽，諸如但不限于精氨酸鹽、賴(lài)氨酸鹽等。用于與包含酸性質(zhì)子的化合物形成鹽的可接受的無(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉等。

應(yīng)當(dāng)理解的是，提及藥用鹽包括溶劑加成形式。溶劑化物含有化學(xué)計(jì)量或非化學(xué)計(jì)量量的溶劑，并且可在與藥用溶劑諸如水、乙醇等的結(jié)晶過(guò)程中形成。當(dāng)溶劑是水時(shí)形成水合物，或當(dāng)溶劑是醇時(shí)形成醇化物。本申請(qǐng)所述的化合物的溶劑化物可方便地在本申請(qǐng)所述的操作中制備或形成。此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕衔锟梢苑侨軇┗问揭约叭軇┗问酱嬖凇?/p>

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物可包含一個(gè)或多個(gè)立體中心。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)存在立體中心時(shí)，所述立體中心可以R構(gòu)型或S構(gòu)型畫(huà)出。除非畫(huà)出立體中心的具體構(gòu)型，否則本申請(qǐng)所述的化合物意在包括所有這些可能的立體化學(xué)構(gòu)型(即外消旋形式，R構(gòu)型、S構(gòu)型)。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER的活性。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低野生型ER的活性。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER-α的活性，所述突變型ER-α具有一種野生型ER-α多肽和一種突變型ER-α多肽(即，異二聚體)。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER-α的活性，所述突變型ER-α具有兩種突變型ER-α多肽(即，同二聚體)。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中突變型ER-α的活性，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER-α兩者(即，異源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中野生型ER-α的活性，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER兩者。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中突變型ER-α的活性，所述細(xì)胞僅表達(dá)突變型ER-α(即，同源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低ER的活性，所述ER在選自以下的位置具有氨基酸替換：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555位。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低ER的活性，所述ER具有選自以下的氨基酸替換：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗突變型ER。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗野生型ER。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗突變型ER-α，所述突變型ER-α具有一種野生型ER-α多肽和一種突變型ER-α多肽(即，異二聚體)。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗突變型ER-α，所述突變型ER-α具有兩種突變型ER-α多肽(即，同二聚體。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗細(xì)胞中突變型ER-α，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER-α兩者(即，異源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗細(xì)胞中的野生型ER-α，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗細(xì)胞中突變型ER-α，所述細(xì)胞僅表達(dá)突變型ER-α(即，同源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗ER，所述ER在選自以下的位置具有氨基酸替換：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物拮抗ER，所述ER具有選自以下的氨基酸替換：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER的細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低野生型ER的細(xì)胞濃度。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER-α的細(xì)胞濃度，所述突變型ER-α具有一種野生型ER-α多肽和一種突變型ER-α多肽(即，異二聚體)。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低突變型ER-α的細(xì)胞濃度，所述突變型ER-α具有兩種突變型ER-α多肽(即，同二聚體)。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中突變型ER-α的細(xì)胞濃度，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER-α兩者(即，異源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中野生型ER-α的細(xì)胞濃度，所述細(xì)胞表達(dá)野生型和突變型ER兩者。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低細(xì)胞中突變型ER-α的細(xì)胞濃度，所述細(xì)胞僅表達(dá)突變型ER-α(即，同源表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低ER的細(xì)胞濃度，所述ER在選自以下的位置具有氨基酸替換：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物降低的細(xì)胞濃度ER，所述ER具有選自以下的氨基酸替換：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。

式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物、其藥用鹽或N-氧化物用作治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物，其中雌激素和/或雌激素受體的作用涉及疾病或病癥的病因或病理學(xué)或有助于疾病或病癥的至少一種癥狀，并且其中雌激素和/或雌激素受體的這種作用是不期望的。在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物為雌激素受體拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的化合物為選擇性雌激素受體降解劑化合物(SERD)。在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物為雌激素受體拮抗劑以及雌激素受體降解劑。在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物展現(xiàn)最小的雌激素受體激動(dòng)劑活性或沒(méi)有該活性。在一些實(shí)施方案中，在治療癌癥的背景下，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物提供改善的治療活性，其特征在于完全或持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的腫瘤消退、較低的發(fā)生率或?qū)χ委煱l(fā)展抗性的發(fā)生率和/或腫瘤侵襲力的減少。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的化合物為雌激素受體降解劑，其展現(xiàn)完全的雌激素受體拮抗劑活性且具有可忽略的或最小的雌激素受體激動(dòng)劑活性。在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物為具有組織特異性ER性質(zhì)的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。

診斷性和治療性方法

在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)描述的是針對(duì)使用雌激素受體調(diào)節(jié)劑的療法選擇患者的方法。在一些實(shí)施方案中，所述雌激素受體調(diào)節(jié)劑為式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括確定患者是否具有ESR1基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有ER介導(dǎo)的疾病或病癥。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有ER+乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有激素抗性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有激素抗性ER+乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者在激素療法后展現(xiàn)疾病進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述患者在抗雌激素療法后展現(xiàn)疾病進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌不適合具有治愈意圖的切除或放射療法。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌在針對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌的至少6個(gè)月激素療法后進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用氟維司群的療法存在的情況下進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用芳香酶抑制劑的療法存在的情況下進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦的療法存在的情況下進(jìn)展。

在一些實(shí)施方案中，針對(duì)使用式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑的療法選擇具有激素抗性雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌的患者的方法包括：a)確定所述患者是否具有ESR1基因中的突；和b)若所述患者具有突變，則針對(duì)療法選擇患者。在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑為選擇性雌激素受體降解劑(SERD)。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致具有選自以下位置的氨基酸替換的ER多肽：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致具有選自以下的氨基酸替換的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有ESR1基因中的兩種或更多種突變。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致ER-YAP1融合多肽的易位。

在一些實(shí)施方案中，所述患者在激素療法后展現(xiàn)疾病進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述患者在抗雌激素療法后展現(xiàn)疾病進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌不適合具有治愈意圖的切除或放射療法。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌在針對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌的至少6個(gè)月激素療法后進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用氟維司群的療法存在的情況下進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用芳香酶抑制劑的療法存在的情況下進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中，所述乳腺癌先前在使用阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦的療法存在的情況下進(jìn)展。

在一些實(shí)施方案中，確定所述患者是否具有ESR1基因中的突變的方法包括測(cè)試含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是腫瘤活檢樣品或流體樣品(例如血液或淋巴樣品)。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包含一種或多種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。因此，在一些實(shí)施方案中，在含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品中評(píng)估ESR1的突變狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，在含有一種或多種CTC的樣品中評(píng)估ESR1基因的突變狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，含有一種或多種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的樣品由患者分離。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有ER陽(yáng)性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有轉(zhuǎn)移性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述患者先前已用一種或多種抗癌劑治療。在一些實(shí)施方案中，所述患者先前已用一種或多種激素療法治療。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)存在或不存在一種或多種ESR1突變測(cè)定所述CTC。在一些實(shí)施方案中，所述ESR1突變賦予編碼的ER多肽的配體非依賴(lài)性活性。在一些實(shí)施方案中，確定了導(dǎo)致在選自以下位置具有氨基酸替換的ER多肽的ESR1突變：SEQ ID NO:2的氨基酸位置6、118、269、311、341、350、380、392、394、433、463、503、534、535、536、537、538和555。在一些實(shí)施方案中，確定了導(dǎo)致具有選自以下的氨基酸替換的ER多肽的ESR1突變：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，確定了作為導(dǎo)致ER-YAP1融合多肽的易位的突變。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品存在或不存在一種或多種額外的基因突變。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品存在或不存在一種或多種選自以下基因中的突變的額外基因突變：BRCA1、BRCA2、CDH1、STK11、TP53、PIK3CA、PTEN、EGFR(ERBB1)、HER2(ERBB2)、AR、ATM、BARD1、BRIP1、CHEK2、DIRAS3、ERBB2、NBN、PALB2、RAD50和RAD51。

在一些實(shí)施方案中，編碼ER的核酸分離自含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品。在一些實(shí)施方案中，編碼ER的核酸分離自循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，確定樣品中具有一種或多種ESR1基因中突變的腫瘤細(xì)胞的百分比。在一些實(shí)施方案中，基于具有一種或多種ESR1基因中突變的腫瘤細(xì)胞的百分比確定治療性診斷。

在一些實(shí)施方案中，確定樣品中具有一種或多種ESR1基因中突變的CTC的百分比。在一些實(shí)施方案中，基于具有一種或多種ESR1基因中突變的CTC的百分比確定治療性診斷。

在一些實(shí)施方案中，從患者中分離后，將含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品體外培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)定存在或不存在一種或多種ESR1突變之前，將含有一種或多種腫瘤細(xì)胞的樣品體外培養(yǎng)。

在一些實(shí)施方案中，從患者中分離后，將含有一種或多種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的樣品體外培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)定存在或不存在一種或多種ESR1突變之前，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)體外培養(yǎng)。

在一些實(shí)施方案中，隨時(shí)間推移監(jiān)測(cè)患者的ESR1突變狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，在癌癥治療的過(guò)程中監(jiān)測(cè)患者的ESR1突變狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，在癌癥治療的過(guò)程中一次或多次評(píng)估患者的ESR1突變狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，每周、每?jī)芍?、每三周、每四周、每月、?個(gè)月、每3個(gè)月、每4個(gè)月、每5個(gè)月、每6個(gè)月、每7個(gè)月、每8個(gè)月、每9個(gè)月、每10個(gè)月、每11個(gè)月、每年、每?jī)赡?、每三年、每四年、每五年或更長(zhǎng)時(shí)間周期評(píng)估患者的ESR1突變狀態(tài)。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕衔锏幕钚钥墒褂帽绢I(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，包括但不限于體外測(cè)定諸如報(bào)道分子測(cè)定、結(jié)合測(cè)定和細(xì)胞存活力測(cè)定，或體內(nèi)測(cè)定包括異種移植物腫瘤動(dòng)物模型。

在一些實(shí)施方案中，腫瘤樣品來(lái)自生物體的任何組織或流體。樣品包括但不限于全血、抽離的骨髓、骨髓穿刺液、胸膜液、腹膜液、中樞脊液、腹腔液、胰液、腦脊液、腦液、腹水、心包液、尿液、唾液、支氣管灌洗液、汗液、眼淚、耳流、痰、腦積液、精液、經(jīng)液(vaginal flow)、乳、羊水以及呼吸道、腸道或泌尿生殖道的分泌物。在具體實(shí)施方案中，所述樣品為腫瘤活檢樣品。在具體實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)自作為淋巴系統(tǒng)或循環(huán)系統(tǒng)的一部分或與淋巴系統(tǒng)或循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的流體或組織。在一些實(shí)施方案中，所述樣品為血液樣品，其為靜脈、動(dòng)脈、周?chē)M織或臍帶血樣品。在具體實(shí)施方案中，所述樣品為血清樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品含有一種或多種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。在一些實(shí)施方案中，所述樣品含有一種或多種播散性腫瘤細(xì)胞(DTC，例如在一個(gè)實(shí)施方案中為骨髓穿刺液樣品)。

分離來(lái)自包含在組織和流體樣品中的細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的。在具體實(shí)施方案中，從受試者獲得的核酸樣品分離自包含在來(lái)自受試者的腫瘤活檢中的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，從受試者獲得的核酸樣品分離自骨髓穿刺液中的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，從受試者獲得的核酸樣品分離自包含在血液樣品中的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，從受試者獲得的核酸樣品分離自包含在淋巴液樣品中的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用公知和常規(guī)臨床方法獲得樣品的任何合適方法從受試者獲得樣品。用于從受試者獲得流體樣品的操作是公知的。例如，用于抽取和處理全血和淋巴的操作是公知的，并且可用于獲得在所提供的方法中使用的樣品。通常，為了收集血液樣品，向樣品中添加抗凝血?jiǎng)?例如EDTA或檸檬酸鹽和肝素或CPD(檸檬酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖)或類(lèi)似物質(zhì))以防止血液凝結(jié)。在一些實(shí)例中，將血液樣品收集在含有一定量EDTA的收集管中，以防止血液樣品的凝結(jié)。

在一些實(shí)施方案中，所述樣品為組織活檢并且例如通過(guò)針吸活檢、CT引導(dǎo)的針吸活檢、穿刺活檢、內(nèi)窺鏡活檢、支氣管鏡活檢、支氣管灌洗、切口活檢、切除活檢、鉆取活檢、剃刮活檢、皮膚活檢、骨髓活檢和電套圈外科切除操作(Loop Electrosurgical Excision Procedure,LEEP)獲得。通常，獲得非壞死、無(wú)菌活檢或樣本，其大于100mg，但可更小，諸如小于100mg、50mg或更小，10mg或更小或5mg或更??；或更大，諸如大于100mg、200mg或更大，或500mg或更大，1g或更大，2g或更大，3g或更大，4g或更大或5g或更大。待提取用于測(cè)定的樣品大小取決于許多因素，包括但不限于待進(jìn)行的測(cè)定數(shù)目、組織樣品的健康狀況、癌癥的類(lèi)型和患者的狀況。在一些實(shí)施方案中，將組織置于無(wú)菌容器(諸如無(wú)菌管或培養(yǎng)板)中，并任選地浸沒(méi)在適當(dāng)介質(zhì)中。通常，通過(guò)本領(lǐng)域公知的機(jī)械方法和/或酶處理將細(xì)胞解離成細(xì)胞懸浮液。通常，收集細(xì)胞，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作以分離用于測(cè)定的核酸。

在一些實(shí)施方案中，在規(guī)律的間隔獲得樣品，諸如一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一周、兩周、四周、一個(gè)月，兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、一年、每天、每周、每月、每季、每年兩次或每年。在一些實(shí)施方案中，樣品的收集在相對(duì)于用一種或多種抗癌劑治療的預(yù)定時(shí)間或規(guī)律的間隔進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，樣品的收集在相對(duì)于用激素療法治療的預(yù)定時(shí)間或規(guī)律的間隔進(jìn)行。例如，在治療之前、期間或之后或在連續(xù)治療之間以預(yù)定時(shí)間或以規(guī)律的間隔收集樣品。在具體的實(shí)例中，在給予抗癌療法之前從受試者獲得樣品，然后在實(shí)施治療之后在規(guī)律的間隔再次獲得樣品。在具體的實(shí)例中，在給予激素治療之前從受試者獲得樣品，然后在實(shí)施治療之后在規(guī)律的間隔再次獲得樣品。

流體樣品的體積可為適于在所提供的方法中檢測(cè)ER突變體的任何體積。在一些實(shí)例中，流體樣品的體積取決于所使用的特定測(cè)定方法。例如，特定的測(cè)定方法可需要更大或更小的流體樣品體積，這取決于以下因素，諸如但不限于所使用的裝置或方法的容量和測(cè)定方法的通量水平。在一些實(shí)例中，在應(yīng)用測(cè)定方法之前，將流體樣品在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中稀釋。在一些實(shí)例中，從受試者獲得流體樣品，并且在測(cè)定方法中使用樣品的一部分或等分試樣。在應(yīng)用測(cè)定方法之前，可將所述部分或等分試樣在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中稀釋。

在一些實(shí)施方案中，樣品獲自受試者，其為哺乳動(dòng)物。示例性哺乳動(dòng)物受試者包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，諸如人、猿和猴；嚙齒類(lèi)動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠、兔和雪貂；反芻動(dòng)物，諸如山羊、牛、鹿和綿羊；馬、豬、狗、貓和其它動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所述樣品獲自患者。在一些實(shí)施例中，所述患者為人類(lèi)患者。

在一些實(shí)施方案中，獲自受試者的核酸樣品為基因組核酸樣品。在一些實(shí)施方案中，獲自受試者的核酸樣品為RNA樣品。在一些實(shí)施方案中，mRNA分離自RNA樣品中的全RNA。在一些實(shí)施方案中，所述RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。在一些實(shí)施方案中，所述基因組核酸樣品通過(guò)核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在一些實(shí)施方案中，所述基因組核酸樣品使用一組對(duì)ER基因具有特異性的核苷酸引物擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，該組核苷酸引物側(cè)面具有編碼ER多肽的突變的氨基酸位置的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物為編碼ER多肽的突變的氨基酸位置的核酸。在一些實(shí)施方案中，序列特異性引物與可檢測(cè)分子，諸如熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、可檢測(cè)底物或結(jié)合第二可檢測(cè)分子的肽或分子綴合。

在一些實(shí)施方案中，所述樣品為含有循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、RNA(ctRNA)或微RNA的血漿或血清樣品(參見(jiàn)例如Chan et al.(2007)Br J Cancer 96(5):681-5)。在一些實(shí)施方案中，所述核酸在檢測(cè)之前由樣品分離。

檢測(cè)方法

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定包括測(cè)序所述核酸樣品。在一些實(shí)施方案中，核酸樣品中編碼ER的核酸首先通過(guò)諸如聚合物酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法使用序列特異性引物擴(kuò)增，然后測(cè)序擴(kuò)增后的PCR片段。用于本申請(qǐng)?zhí)峁┑姆椒ǖ氖纠詼y(cè)序方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括但不限于雙脫氧或鏈終止方法、Maxam-Gilbert測(cè)序、大規(guī)模平行簽名測(cè)序(或MPSS)、Polony測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、Illumina染料測(cè)序、SOLiD(或通過(guò)連接測(cè)序)測(cè)序、離子半導(dǎo)體測(cè)序、DNA納米球測(cè)序、Heliscope測(cè)序和單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序。

在一些實(shí)施方案中，編碼突變型ER-α的DNA通過(guò)BEAMing(珠子、擴(kuò)增、乳液、磁性)PCR測(cè)序方法評(píng)估(參見(jiàn)，例如Li et al.(2006)Nat Methods 3(2):95-7；Li et al.(2006)Nat Methods 3(7):551-9；和Diehl et al.(2008)Nat Med.14(9):985–990)。BEAMing是這樣的技術(shù)，其中單個(gè)DNA分子附著至油包水型乳劑中的磁珠，然后進(jìn)行區(qū)室化PCR擴(kuò)增。然后通過(guò)與突變型或野生型ER的熒光等位基因特異性探針雜交來(lái)確定與珠子結(jié)合的DNA的突變狀態(tài)。然后使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)定量存在于血漿或血清中的突變型DNA的水平(參見(jiàn)例如Higgins et al.(2012)Clin Cancer Res 18:3462-3469)。

在一些實(shí)施方案中，編碼突變型ER-α的DNA通過(guò)核酸樣品的克隆擴(kuò)增評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，編碼突變型ER-α的DNA通過(guò)數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，編碼突變型ER-α的DNA通過(guò)液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(droplet digital polymerase chain reaction)評(píng)估。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)用于檢測(cè)存在編碼突變型ER-α的DNA的樣品進(jìn)行測(cè)定，其包括用序列特異性寡核苷酸探針檢測(cè)突變，所述序列特異性寡核苷酸探針對(duì)編碼突變型ER-α而非野生型ER的核酸具有特異性。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定包括(a)使樣品與突變型ER-α核酸序列特異性寡核苷酸探針接觸，其中若樣品中存在突變性核酸序列，則形成探針-DNA復(fù)合物，和(b)檢測(cè)探針-DNA復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，將序列特異性探針與可檢測(cè)分子綴合，諸如熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、可檢測(cè)底物或結(jié)合第二可檢測(cè)分子的肽或分子。

在一些實(shí)施方案中，單核苷酸變化可通過(guò)以下方式檢測(cè)：使用基于PCR的切割擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)標(biāo)記物進(jìn)行PCR，其在突變序列中產(chǎn)生限制性位點(diǎn)(Michaels et al(1998)Plant J.14(3):381-5)或附接至可檢測(cè)部分的序列特異性發(fā)卡探針，所述可檢測(cè)部分諸如但不限于熒光團(tuán)(Mhlanga and Malmberg(2001)Methods 25:463-471)。在一些實(shí)施方案中，將序列特異性探針與可檢測(cè)分子綴合，諸如熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、可檢測(cè)底物或結(jié)合第二可檢測(cè)分子的肽或分子。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)用于檢測(cè)存在編碼突變型ER-α的DNA的樣品進(jìn)行測(cè)定，其使用寡核苷酸陣列進(jìn)行(參見(jiàn)例如Hastia et al.(1999)J Med Genet.36(10):730-6)。在一些實(shí)施方案中，含有來(lái)自受試者的核酸的樣品直接雜交至芯片。在一些實(shí)施方案中，含有來(lái)自受試者的核酸的樣品使用擴(kuò)增方法擴(kuò)增，所述擴(kuò)增方法諸如但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，并且擴(kuò)增后的核酸雜交至芯片。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸陣列包含在微芯片上。在一些實(shí)施方案中，單核苷酸變化可使用微芯片檢測(cè)。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定樣品包括用針對(duì)突變型ER-α多肽具有特異性的抗體檢測(cè)突變。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)突變型ER-α多肽的方法包括從受試者獲得樣品，其中所述樣品包含ER多肽，以及通過(guò)使樣品與抗體接觸來(lái)測(cè)試樣品是否存在突變型ER-α多肽，所述抗體對(duì)結(jié)合突變型ER-α多肽具有特異性，而不結(jié)合野生型ER-α多肽或以降低的親和力結(jié)合野生型ER-α多肽，其中突變型ER-α多肽的存在產(chǎn)生抗體-突變型ER-α多肽復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括檢測(cè)抗體-突變型ER-α多肽復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括用檢測(cè)試劑檢測(cè)抗體-突變型ER-α多肽復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述突變型ER-α特異性抗體與可檢測(cè)分子綴合，諸如熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記、可檢測(cè)底物或結(jié)合第二可檢測(cè)分子的肽或分子(例如二級(jí)抗體)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定可檢測(cè)分子來(lái)檢測(cè)突變型ER-α特異性抗體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用二級(jí)抗體(例如抗-IgG)檢測(cè)突變型ER-α特異性抗體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是腫瘤活檢樣品、骨髓穿刺液、血液樣品、血清樣品或淋巴樣品。

雌激素受體調(diào)節(jié)劑體外活性

雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)化合物(其包括但不限于表1-4中的那些)的組合的細(xì)胞毒性和抑制細(xì)胞活性通過(guò)以下方式測(cè)量：在細(xì)胞培養(yǎng)基中建立增殖的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系，添加測(cè)試化合物，將所述細(xì)胞培養(yǎng)約6小時(shí)至約5天的時(shí)間；并測(cè)量細(xì)胞存活力(實(shí)施例7)。使用基于細(xì)胞的體外測(cè)定法測(cè)量存活力，即增殖(IC₅₀)、細(xì)胞毒性(EC₅₀)和誘導(dǎo)凋亡(半胱天冬酶激活)。

ERM化合物的體外效力通過(guò)實(shí)施例7的細(xì)胞增殖測(cè)定(可從Promega Corp.,Madison,WI商購(gòu)獲得的發(fā)光細(xì)胞存活力測(cè)定)來(lái)測(cè)量。該均相測(cè)定方法基于鞘翅目(Coleoptera)熒光素酶的重組表達(dá)(US 5583024；US 5674713；US 5700670)，并基于存在的ATP(代謝活性細(xì)胞的指示劑)的定量來(lái)確定培養(yǎng)物中存活細(xì)胞的數(shù)量(Crouch et al(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。以96或384孔格式進(jìn)行測(cè)定，使其適合于自動(dòng)化高通量篩選(HTS)(Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。均相測(cè)定操作包括將單一試劑(試劑)直接添加到在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中。不需要細(xì)胞清洗、去除培養(yǎng)基和多次移液步驟。在添加試劑和混合后的10分鐘內(nèi)，系統(tǒng)在384孔格式中檢測(cè)到少至15個(gè)細(xì)胞/孔。

通過(guò)針對(duì)腫瘤細(xì)胞系的測(cè)定(實(shí)施例7)測(cè)量ERM化合物的組合的抗增殖作用。建立測(cè)試化合物和組合的EC₅₀值。體外細(xì)胞效能活性的范圍可為約100nM至約10μM。

雌激素受體調(diào)節(jié)劑體內(nèi)腫瘤異種移植物活性

通過(guò)在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中植入癌細(xì)胞的同種異體移植物或異種移植物并用藥物和對(duì)照(媒介物)制劑處理荷瘤動(dòng)物，體內(nèi)測(cè)量ERM化合物和各種化學(xué)治療劑的功效。結(jié)果取決于細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞中存在或不存在某些突變、ERM化合物和化療劑的給予順序、給予方案和其它因素。用藥物或?qū)φ?媒介物)處理受試小鼠，并監(jiān)測(cè)數(shù)周或更長(zhǎng)時(shí)間以測(cè)量腫瘤倍增時(shí)間、細(xì)胞殺滅對(duì)數(shù)值(log cell kill)和腫瘤抑制(實(shí)施例8)。圖1-13顯示根據(jù)實(shí)施例8的方案在對(duì)用ERM化合物和各種化療劑處理的荷瘤小鼠處理后，腫瘤體積隨時(shí)間變化的圖。

圖1和2示出不存在E2的情況下在誘導(dǎo)表達(dá)WT和突變型ERα的MCF7中的ERα降解測(cè)定。在含有100ng/ml Dox的缺乏雌激素的培養(yǎng)基中將細(xì)胞用增加劑量的氟維司群(圖1)處理24小時(shí)。用來(lái)自表1的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)1-3(圖1)和ERM 4-23(圖2)而非他莫昔芬(圖2)，觀察到突變的ERa降解。由PR和細(xì)胞周期蛋白D1水平證明功能輸出。

圖3示出一組7只攜帶MCF-7EF1:Y537S ESR1-突變體(Y537S)的免疫受損小鼠中歷時(shí)28天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物，以高劑量200mg/kg給予氟維司群；AUC約20-30x臨床暴露以上，以及100mg/kg/天來(lái)自表1的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ERM)1-3和100mg/kg/天來(lái)自表4的ERM 4-23。工程化MCF7突變型細(xì)胞表達(dá)相對(duì)于內(nèi)源性野生型(WT)MCF7細(xì)胞而言4-5x以上的蛋白。氟維司群未顯示強(qiáng)效的體內(nèi)效能，甚至在30x臨床暴露以上且不存在E2的情況下。

圖4示出一組5只攜帶包含ESR1L536P突變體的HCI-005乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受損小鼠中歷時(shí)40天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+)、媒介物(-)，以60mg/kg/天給予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM 4-23。在該ESR1L536P突變體模型中，ERM 4-23比ERM 1-3具有更大效能。

圖5示出一組7只攜帶包含ESR1L536P突變體的HCI-005乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物(ER+,PR+,HER2+)的免疫受損小鼠中具有Fold Over Start的歷時(shí)56天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天給予他莫昔芬，以200mg/kg(QD 3x/wk)給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM 4-23。

圖6示出一組7-8只攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤(NOD.SCID OVX中的BC PDX模型)異種移植物的免疫受損小鼠中歷時(shí)35天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以60mg/kg/天給予枸櫞酸他莫昔芬，以50mg/kg給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以100mg/kg/天給予ERM 4-23。

圖7示出一組7只攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤(NSG OVX中的BC PDX模型)異種移植物的免疫受損小鼠中歷時(shí)28天的擬合腫瘤體積變化：每日一次PO(口服)給予媒介物(+E2)、媒介物(-E2)，以200mg/kg每周三次皮下給予氟維司群，以100mg/kg/天給予ERM 1-3，以及以10和100mg/kg/天給予ERM 4-23。

圖8和9示出攜帶WHIM 20Y537S ESR1-突變體(Y537S)、PIK3CA突變體(E542K)乳腺腫瘤、患者衍生的(BC PDX模型)異種移植物模型的免疫受損小鼠中ERα(alpha)與肌動(dòng)蛋白水平的比率(圖8)以及PR-A與肌動(dòng)蛋白水平的比率(圖9)的條形圖：所述模型歷時(shí)4天每日一次PO(口服)給予100微升(μl)媒介物，以200mg/kg給予氟維司群，以100mg/kg給予ERM 1-3，以及以100mg/kg給予ERM 4-23。

圖10示出乳腺癌患者在基線、治療前(左側(cè))和以600mg/天連續(xù)每日口服給予ERM 1-3(ARN-810)一個(gè)月后(右側(cè))的[¹⁸F]FES-PET圖像，其中在給予后23小時(shí)采集圖像。確認(rèn)患者具有含ESR1D538G突變的軟組織損害。

ERM 1-3和ERM 4-23證明在ER突變型乳腺癌異種移植模型中腫瘤退化至腫瘤生長(zhǎng)延遲的抗腫瘤活性的范圍。此外，ERM 1-3和ERM 4-23在其中來(lái)自患者的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤植入免疫受損小鼠的模型(也稱(chēng)為患者衍生的異種移植物模型)中是有效的。在患者衍生的異種移植物模型中觀察到ERM 1-3和ERM 4-23的藥效學(xué)活性，其基于降低的ER蛋白水平和孕酮受體水平的降低：ER靶基因。此外，在一個(gè)模型中，ERM 1-3和ERM 4-23比護(hù)理藥物標(biāo)準(zhǔn)物(氟維司群或他莫昔芬)更有效，并且在其它模型中觀察到改善的功效的趨勢(shì)。

ER相關(guān)疾病或病癥的治療

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥委熅哂幸环N或多種ESR1基因中的突變的患者的方法。在一些實(shí)施方案中，治療包括對(duì)具有一種或多種ESR1基因中的突變的患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述突變導(dǎo)致具有選自以下的氨基酸替換的ER多肽：H6Y、S118P、R269C、T311M、S341L、A350E、E380Q、V392I、R394H、S433P、S463P、R503W、V534E、P535H、L536R、L536P、L536Q、Y537N、Y537C、Y537S、D538G和R555C。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有兩種或更多種ESR1基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，所述突變?yōu)閷?dǎo)致ER-YAP1融合多肽的易位。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述患者具有實(shí)體瘤。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌或膀胱癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為雌激素陽(yáng)性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為HER2陽(yáng)性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為HER2陰性乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥轉(zhuǎn)移性癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為激素依賴(lài)性癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為雌激素受體依賴(lài)性癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為雌激素受體陽(yáng)性癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為雌激素敏感性癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥對(duì)抗激素治療具有抗性。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥為對(duì)抗激素治療具有抗性的雌激素敏感性癌癥或雌激素受體依賴(lài)性癌癥。在一些實(shí)施方案中，抗激素治療包括用至少一種選自以下的藥物治療：他莫昔芬、氟維司群、類(lèi)固醇芳香酶抑制劑和非類(lèi)固醇芳香酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，抗激素治療包括用阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦治療。

在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在抗雌激素療法后具有疾病進(jìn)展的婦女。在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在用芳香酶抑制劑的療法后具有疾病進(jìn)展的婦女。在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在用阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦的療法后具有疾病進(jìn)展的婦女。

在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為絕經(jīng)后婦女。在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在抗雌激素療法后具有疾病進(jìn)展的絕經(jīng)后婦女。在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在用芳香酶抑制劑的療法后具有疾病進(jìn)展的絕經(jīng)后婦女。在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者為在用阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦的療法后具有疾病進(jìn)展的絕經(jīng)后婦女。

在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者未經(jīng)受化學(xué)療法(chemotherapy-)。

在一些實(shí)施方案中，用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物治療的患者正在用至少一種抗癌劑針對(duì)癌癥進(jìn)行治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥為激素難治性癌癥。

在一些實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物用于治療具有一種或多種ESR1突變的患者的ER相關(guān)疾病或病癥。示例性ER相關(guān)疾病或病癥包括但不限于與癌癥(例如骨癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、卵巢癌和子宮癌)相關(guān)的ER-α功能障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、平滑肌瘤(例如子宮平滑肌瘤)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)缺陷(例如酒精中毒、偏頭痛)、心血管系統(tǒng)缺陷(例如主動(dòng)脈瘤、對(duì)心肌梗塞的易感性、主動(dòng)脈瓣硬化、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓)、血液系統(tǒng)缺陷(例如深靜脈血栓形成)、免疫和炎癥疾病(例如格雷夫斯病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、肝硬化)、感染易感性(例如乙型肝炎、慢性肝病)、代謝缺陷(例如骨密度、膽汁郁積、尿道下裂、肥胖、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松)、神經(jīng)缺陷(例如阿爾茨海默病、帕金森病、偏頭痛、眩暈)、精神缺陷(例如神經(jīng)性厭食、注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)、癡呆、重度抑郁癥、精神病)和生殖缺陷(例如月經(jīng)初潮年齡、子宮內(nèi)膜異位癥、不育癥)。

本申請(qǐng)還提供了降低具有一種或多種ESR1突變的患者中ER激活的方法，包括向哺乳動(dòng)物給予至少一種具有式(A)、(B)、(C)或(D)的結(jié)構(gòu)的化合物或其藥用鹽或N-氧化物。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括降低哺乳動(dòng)物中乳腺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞或子宮細(xì)胞中的ER活化。在一些實(shí)施方案中，降低哺乳動(dòng)物中ER激活的方法包括降低哺乳動(dòng)物中雌激素與雌激素受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，降低哺乳動(dòng)物中ER激活的方法包括降低哺乳動(dòng)物中的ER濃度。

給藥途徑

本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物的合適的給藥途徑包括但不限于口服、腸胃外(例如、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))、鼻內(nèi)、經(jīng)頰、局部、經(jīng)直腸、氣霧劑、眼部、肺部、透粘膜、透皮、陰道、耳部、經(jīng)鼻和局部給予。此外，僅通過(guò)舉例的方式，腸胃外遞送包括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射、以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、淋巴內(nèi)和鼻內(nèi)注射。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物以全身方式給予。在某些其它實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物以局部而非全身方式給予。在一些實(shí)施方案中，某些實(shí)施方案，本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物口服給予。

藥物組合物/制劑

在一些實(shí)施方案中，如本申請(qǐng)所述的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物被配制成藥物組合物。藥物組合物以常規(guī)方式使用一種或多種藥用非活性成分配制，所述成分促進(jìn)活性化合物加工成藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。本申請(qǐng)所述藥物組合物的概述可見(jiàn)于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Nineteenth Ed(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Seventh Ed.(Lippincott Williams&Wilkins1999)，通過(guò)引用的方式將上述公開(kāi)內(nèi)容并入本申請(qǐng)。

本申請(qǐng)所用的藥物組合物是指式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物與其它化學(xué)組分(即藥用無(wú)活性成分)的混合物，所述其它化學(xué)組分諸如載體、賦形劑、粘合劑、填充劑、助懸劑、矯味劑、增甜劑、崩解劑、分散劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、稀釋劑、增溶劑、濕潤(rùn)劑、增塑劑、穩(wěn)定劑、滲透增強(qiáng)劑、潤(rùn)濕劑、消泡劑、抗氧化劑、防腐劑或一種或多種它們的組合。藥物組合物有助于向哺乳動(dòng)物給予化合物。

藥物組合物將包含至少一種式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽，其作為呈游離酸或游離堿形式或呈藥用鹽形式的活性成分。此外，本申請(qǐng)所述的方法和藥物組合物包括使用N-氧化物(適當(dāng)時(shí))、結(jié)晶形式、無(wú)定形相以及具有相同類(lèi)型活性的這些化合物的活性代謝物。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所述的化合物以非溶劑化形式或以與藥用溶劑諸如水、乙醇等的溶劑化形式存在。

本申請(qǐng)所述的藥物制劑包括但不限于水性液體分散體、自乳化分散體、固體溶液、脂質(zhì)體分散體、氣溶膠、固體劑型、粉劑、即時(shí)釋放制劑、控制釋放制劑、速溶制劑、片劑、膠囊劑、丸劑、延遲釋放制劑、延長(zhǎng)釋放制劑、腸溶衣制劑、脈沖釋放制劑、多顆粒制劑和混合的即時(shí)釋放和控制釋放制劑。

在一些實(shí)施方案中，全身性給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，口服給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。所有用于口服給予的制劑都呈適于所述給藥的劑量。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)公開(kāi)的固體劑型呈片劑、丸劑、粉劑、膠囊劑、固體分散體、固體溶液、生物可蝕性劑型、控制釋放制劑、脈沖釋放劑型、多顆粒劑型、珠粒、藥丸(pellets)、顆粒劑的形式。在其它實(shí)施方案中，藥物制劑呈粉末形式。在其它實(shí)施方案中，藥物制劑呈片劑形式。在其它實(shí)施方案中，藥物制劑呈懸浮片劑、速溶片劑、嚼崩(bite-disintegration)片劑、速崩片劑、泡騰片劑或囊片形式。在其它實(shí)施方案中，藥物制劑呈膠囊劑形式。

在一些實(shí)施方案中，配制藥物固體口服劑型以提供活性化合物的控制釋放。控制釋放特性包括例如持續(xù)釋放、延長(zhǎng)釋放、脈沖釋放和延遲釋放性質(zhì)。

在一個(gè)方面，用于口服給予的液體制劑劑型呈選自包括但不限于以下的水性混懸劑形式：藥用水性口服分散體、乳劑、溶液、酏劑、凝膠劑和糖漿劑。參見(jiàn)，例如，Singh et al.,Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,2nd Ed.,pp.754-757(2002)。

對(duì)于經(jīng)頰或舌下給予，組合物任選地采取以常規(guī)方式配制的片劑、錠劑或凝膠劑的形式。

在一個(gè)方面，將式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽配制成適于肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射的藥物組合物。腸胃外注射涉及推注(bolus injection)和/或連續(xù)輸注。

在一些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，皮下給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，局部給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。在所述實(shí)施方案中，將所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽配制成各種可局部給予的組合物，諸如溶液劑、懸浮劑、洗劑、凝膠劑、糊劑、洗發(fā)劑、擦洗劑、擦拭劑、涂抹劑、藥棒、藥用繃帶、香膏劑、乳膏劑或軟膏劑。在一些實(shí)施方案中，向哺乳動(dòng)物的皮膚局部給予所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，將所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物制備成經(jīng)皮劑型。

在另一方面，其為式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽在制備用于治療其中雌激素受體的活性有助于疾病或病癥的病理學(xué)和/或癥狀的疾病、障礙或病癥(例如，特征在于ESR1基因中的突變的激素抗性癌癥)的藥物中的用途。在一個(gè)方面，所述疾病或病癥為任何本申請(qǐng)所述的疾病或病癥。

治療有效量的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽可取決于疾病的嚴(yán)重度、受試者的年齡和相對(duì)健康以及其它因素而廣泛變化。

給藥和治療方案

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽用于制備治療具有一種或多種ESR1突變包括從雌激素受體活性降低中獲益的疾病或病癥(例如，特征在于ESR1基因中的突變的激素抗性癌癥)的藥物。在需要所述治療的哺乳動(dòng)物中治療本申請(qǐng)所述的任何疾病或病癥的方法包括以治療有效量向所述患者給予藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽、N-氧化物、活性代謝物、前藥或藥用溶劑化物。

治療有效量取決于疾病或病癥的嚴(yán)重度和病程、先前療法、患者的健康狀況、體重和對(duì)藥物的響應(yīng)，以及治療醫(yī)師的判斷。治療有效量任選地通過(guò)包括但不限于劑量遞增臨床試驗(yàn)的方法來(lái)確定。

在本申請(qǐng)所述的任何治療方法中，將所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物的有效量：(a)全身性給予于哺乳動(dòng)物；和/或(b)口服給予于哺乳動(dòng)物；和/或(c)靜脈內(nèi)給予于哺乳動(dòng)物；和/或(d)通過(guò)注射給予于哺乳動(dòng)物；和/或(e)局部給予于哺乳動(dòng)物；和/或(f)非全身性或局部給予于哺乳動(dòng)物。

在一些情況下，治療方法包括單次給予有效量的化合物，包括另外的實(shí)施方案，其中(i)給予化合物一次；(ii)在一天的時(shí)間內(nèi)多次向哺乳動(dòng)物給予化合物；(iii)持續(xù)(continually)給予；或(iv)連續(xù)(continuously)給予。

在任意上述方面中是包括多次給予有效量的化合物的另外的實(shí)施方案，包括另外的實(shí)施方案，其中(i)連續(xù)或間歇給予化合物：如單劑量；(ii)多次給予之間的時(shí)間為每6小時(shí)；(iii)每8小時(shí)向哺乳動(dòng)物給予化合物；(iv)每12小時(shí)向哺乳動(dòng)物給予化合物；(v)每24小時(shí)向哺乳動(dòng)物給予化合物。在進(jìn)一步或備選的實(shí)施方案中，所述方法包括休藥期，其中暫時(shí)中止所述化合物的給予或暫時(shí)減少所給予的化合物的劑量；在休藥期結(jié)束時(shí)，恢復(fù)化合物的給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，休藥期的長(zhǎng)度從2天到1年不等。

在其中患者的狀況不改善的某些實(shí)施方案中，根據(jù)醫(yī)生的判斷，長(zhǎng)期(即延長(zhǎng)的時(shí)間)給予化合物。

在其中患者的狀態(tài)改善的某些實(shí)施方案中，所給予的藥物的劑量暫時(shí)減少或暫時(shí)中止一段時(shí)間(即，“休藥期”)。

在一些實(shí)施方案中，成人治療所采用的劑量范圍通常為每日0.01mg-5000mg的式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一個(gè)方面，成人治療所采用的劑量范圍通常為每日約1mg至約2000mg的式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的劑量方便地以同時(shí)或以適當(dāng)?shù)拈g隔給予的單劑量或分開(kāi)劑量存在，例如每日兩次、三次、四次或更多次亞劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，適于本申請(qǐng)所述式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽的每日劑量為約0.01至約50mg/kg體重。

在一些實(shí)施方案中，向絕經(jīng)后婦女口服給予雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，每天向所述患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，每隔一天向所述患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次或每月一次向所述患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，以連續(xù)每日給藥方案向所述患者口服給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，向所述患者給予約5mg/天至約1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，向所述患者給予約10mg/天至約100mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，向所述患者給予約10mg/天、約15mg/天、約20mg/天、約25mg/天、約30mg/天、約35mg/天、約35mg/天、約40mg/天、約45mg/天、約50mg/天、約55mg/天、約60mg/天、約65mg/天、約70mg/天、約75mg/天、約80mg/天、約85mg/天、約90mg/天、約100mg/天、約150mg/天、約200mg/天、約250mg/天、約300mg/天、約350mg/天、約400mg/天、約450mg/天、約500mg/天、約550mg/天、約600mg/天、約650mg/天、約700mg/天、約750mg/天、約800mg/天、850mg/天、約900mg/天、約950mg/天、約1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，向所述患者給予約600mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，向所述患者給予約1000mg/天的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的每日劑量方便地以同時(shí)(或在短時(shí)間內(nèi))或以適當(dāng)?shù)拈g隔給予的單劑量或分開(kāi)劑量存在，例如作為每日兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)亞劑量。在一些實(shí)施方案中，期望的每日劑量方便地以分開(kāi)的劑量存在，所述劑量每日一次同時(shí)(或在短時(shí)間內(nèi))給予。在一些實(shí)施方案中，期望的日劑量方便地以分開(kāi)的劑量提供，所述劑量以等份每日兩次、每日三次或每日多于三次給予。

在一些實(shí)施方案中，向患者給予的期望每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽每日給予一次。

在一些實(shí)施方案中，向患者給予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽以均分劑量每日給予兩次。

在一些實(shí)施方案中，向患者給予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽以均分劑量每日給予三次。

在一些實(shí)施方案中，向患者給予的每日量的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽以均分劑量每日給予多于三次。

在其中未觀察到患者中乳腺癌的狀態(tài)改善的某些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽的每日劑量增加。在一些實(shí)施方案中，每日一次給藥方案變?yōu)槊咳諆纱谓o藥方案。在一些實(shí)施方案中，采用每日三次給藥方案增加給予的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽的量。

在一些實(shí)施方案中，向處于禁食狀態(tài)的患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。在一些實(shí)施方案中，向處于進(jìn)食狀態(tài)的患者給予式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽。

在一些實(shí)施方案中，向患者給予的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑或其藥用鹽的量取決于以下因素而變化，諸如但不限于乳腺癌的情況和嚴(yán)重度及婦女的特征(identity)(例如，體重)。

18F-氟雌二醇(FES)是雌激素受體的特異性和選擇性放射性示蹤劑，其可通過(guò)對(duì)良好耐受劑量的新治療劑的充分靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行非侵入性監(jiān)測(cè)來(lái)輔助臨床藥物開(kāi)發(fā)。在患有晚期或轉(zhuǎn)移性ER+乳腺癌的婦女中，使用18F-FES的正電子發(fā)射斷層掃描(PET)在多中心、I期、劑量探尋、安全性和藥物動(dòng)力學(xué)臨床試驗(yàn)中用于驗(yàn)證雌激素受體靶標(biāo)與ERM1-3的結(jié)合。圖10顯示了在基線、治療前(左)和以600mg/日的連續(xù)口服每日給藥藥物制劑ERM 1-3一個(gè)月后(ARN-810)(右)的乳腺癌患者的[¹⁸F]FES-PET(氟雌二醇-正電子發(fā)射斷層掃描)圖像，其中在給藥后23小時(shí)收集圖像。患者被證實(shí)具有ESR1D538G突變的軟組織損害?；颊郀顟B(tài)是部分響應(yīng)。FES-PET/CT成功地證明了ERM1-3臨床試驗(yàn)的靶標(biāo)結(jié)合。臨床試驗(yàn)中的其它患者與用ERM 1-3藥物制劑的治療顯示出相似的響應(yīng)。

組合療法

在一些實(shí)施方案中，用于治療具有一種或多種ESR1突變的患者的藥物組合物還包含一種或多種選自以下的額外治療活性劑：皮質(zhì)類(lèi)固醇、止吐劑、鎮(zhèn)痛劑、抗癌劑、抗炎劑、激酶抑制劑、受體抑制劑、抗體、HSP90抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑、PD-1抑制劑、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑和芳香酶抑制劑。

在某些情況下，適當(dāng)?shù)亟o予至少一種式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與一種或多種額外治療劑的組合。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含一種或多種抗癌劑。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與第二治療劑共同給予，其中式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽和第二治療劑調(diào)節(jié)所治療的疾病、障礙或病癥的不同方面，從而提供比單獨(dú)給予任一治療劑更佳的總體益處。

在任何情況下，不考慮待治療的疾病、障礙或病癥，患者所經(jīng)歷的總體益處是兩種治療劑的累加效應(yīng)，或者患者可經(jīng)歷協(xié)同益處。

在組合療法中，多種治療劑(其中之一是本申請(qǐng)所述的化合物之一)以任何順序或甚至同時(shí)給予。如果同時(shí)給予，僅通過(guò)舉例的方式，多種治療劑以單一形式、統(tǒng)一形式或以多種形式提供(例如，作為單一丸劑或作為兩種單獨(dú)的丸劑)。

在一些實(shí)施方案中，治療雌激素受體依賴(lài)性或雌激素受體介導(dǎo)的病癥或疾病(諸如增殖性病癥，包括癌癥)的方法包括向哺乳動(dòng)物給予式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽以及至少一種額外治療劑。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與激素阻斷治療、化學(xué)療法、放射療法、手術(shù)、癌癥疫苗、生物療法或它們的組合組合給予。在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與肽、細(xì)胞因子、治療性病毒、治療性細(xì)菌、基因療法、siRNA、過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移、抗體、單克隆抗體或它們的組合組合給予。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與芳香酶抑制劑、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途徑抑制劑、CDK 4/6抑制劑、HER-2抑制劑、EGFR抑制劑、PD-1抑制劑、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑、HSP90抑制劑、VEGFR抑制劑、AKT抑制劑、化學(xué)療法或它們的任何組合組合給予。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與芳香酶抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述芳香酶抑制劑為阿那曲唑、來(lái)曲唑或依西美坦。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與CDK 4/6抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述CDK 4/6抑制劑為L(zhǎng)EE011或LY283519。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途徑抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR途徑抑制劑為依維莫司、坦西莫司、BEZ235、BYL719、GDC0032、BKM120、BGT226、GDC0068、GDC-0980、GDC0941、INK128(MLN0128)、INK1117、MK-2206、OSI-027、CC-223、AZD8055、SAR245408、SAR245409、PF04691502、WYE125132、GSK2126458、GSK-2636771、BAY806946、PF-05212384、SF1126、PX866、AMG319、ZSTK474、Cal101、PWT33597、CU-906或CUDC-907。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述HDAC抑制劑為恩替司他(entinostat)或莫西司他(mocetinostat)。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與HER-2抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述HER-2抑制劑為曲妥單抗、帕妥珠單抗或TDM-1。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述EGFR抑制劑為拉帕替尼、吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗(cetuximab)、卡奈替尼(canertinib)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、OSI-632、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、MP-412、AEE-788、來(lái)那替尼(neratinib)、XL-647、達(dá)克替尼(dacomitinib)、AZD-8931、CUDC-101、AP-26113或CO-1686。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與抗血管生成劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述抗血管生成劑為VEGFR抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述抗血管生成劑抑制多種激酶(例如，為多激酶靶向劑)。在一些實(shí)施方案中，所述抗血管生成劑為貝伐單抗、ABR-215050(他喹莫德(tasquinimod))、CHIR-258(多韋替尼(dovitinib))、EXEL-7647、OSI-930、BIBF-1120、BAY-73-4506、BMS-582664(布立尼布(brivanib))、RO-4929097、JNJ-26483327、AZD-2171(西地尼布(cediranib))、索拉非尼(sorafenib)、阿柏西普(aflibercept)、恩扎妥林(enzastaurin)、AG-013736(阿西替尼(axitinib))、GSK-786034(帕唑帕尼(pazopanib))、AP-23573或舒尼替尼(sunitinib)。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與抗-PD-1劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述抗-PD-1劑為MK-3475、納武單抗(Nivolumab)、MPDL3280A或MEDI4736。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與AKT抑制劑組合給予。在一些實(shí)施方案中，所述AKT抑制劑為GDC0068、MK-2206、AT7867、GSK2110183、GSK2141795或GSK690693。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與多柔比星、環(huán)磷酰胺、卡培他濱、長(zhǎng)春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和順鉑組合給予。

在一些實(shí)施方案中，與式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽組合使用的額外治療劑包括一種或多種以下治療劑：阿比特龍(abiraterone)；阿巴瑞克(abarelix)；阿霉素(adriamycin)；放線菌素(actinomycin)；阿維菌素(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；鹽酸阿考達(dá)唑(acodazole hydrochloride)；阿克羅寧(acronine)；阿多來(lái)新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；阿侖單抗(alemtuzumab)；別嘌呤醇(allopurinol)；阿利維甲酸(alitretinoin)；六甲蜜胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；氨魯米特(aminoglutethimide)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；氨磷汀(amifostine)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；氨曲霉素(anthramycin)；阿瑞吡坦(aprepitant)；三氧化二砷(arsenic trioxide)；天冬酰胺酶(asparaginase)；曲林菌素(asperlin)；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴馬司他(batimastat)；鹽酸苯達(dá)莫司汀(bendamustine hydrochloride)；苯佐替哌(benzodepa)；貝伐單抗(bevacizumab)；貝沙羅汀(bexarotene)；比卡魯胺(bicalutamide)；鹽酸比生群(bisantrene hydrochloride)；二甲磺酸雙奈法德(bisnafide dimesylate)；比折來(lái)新(bizelesin)；博來(lái)霉素(bleomycin)；硫酸博來(lái)霉素(bleomycin sulfate)；硼替佐米(bortezomib)；布喹那鈉(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放線霉素C(cactinomycin)；卡蘆睪酮(calusterone)；卡拉酰胺(caracemide)；卡貝替姆(carbetimer)；卡鉑(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；鹽酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折來(lái)新(carzelesin)；卡培他濱(capecitabine)；西地芬戈(cedefingol)；西妥昔單抗(cetuximab)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西羅霉素(cirolemycin)；順鉑(cisplatin)；克拉屈濱(cladribine)；氯法拉濱(clofarabine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷(cytarabine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；達(dá)沙替尼(dasatinib)；鹽酸柔紅霉素(daunorubicin hydrochloride)；更生霉素(dactinomycin)；達(dá)貝泊汀α(darbepoetin alfa)；地西他濱(decitabine)；地加瑞克(degarelix)；地尼白介素毒素連接物(denileukin diftitox)；右?jiàn)W馬鉑(dexormaplatin)；鹽酸右雷佐生(dexrazoxane hydrochloride)；地扎呱寧(dezaguanine)；甲磺酸地扎呱寧(dezaguanine mesylate)；地吖醌(diaziquone)；多烯紫杉醇(docetaxel)；多柔比星(doxorubicin)；鹽酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride)；屈洛昔芬(droloxifene)；枸櫞酸屈洛昔芬(droloxifene citrate)；丙酸倍他米松(dromostanolone propionate)；達(dá)佐霉素(duazomycin)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；鹽酸依氟鳥(niǎo)氨酸(eflornithine hydrochloride)；伊沙蘆星(elsamitrucin)；艾曲波帕(eltrombopag olamine)；恩洛鉑(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；鹽酸表柔比星(epirubicinhydrochloride)；阿法依泊汀(epoetin alfa)；厄布洛唑(erbulozole)；鹽酸厄洛替尼(erlotinib hydrochloride)；鹽酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸鈉(estramustine phosphate sodium)；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)；氯苯乙嘧胺(etoprine)；依維莫司(everolimus)；依西美坦(exemestane)；GDC0032；鹽酸法倔佐(fadrozole hydrochloride)；法扎拉濱(fazarabine)；芬維甲胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabine phosphate)；氟尿嘧啶(fluorouracil)；氟西他濱(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星鈉(fostriecin sodium)；氟維司群；吉非替尼(gefitinib)；吉西他濱(gemcitabine)；鹽酸吉西他濱(gemcitabine hydrochloride)；吉西他濱-順鉑(gemcitabine-cisplatin)；吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)；乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)；乙酸組胺瑞林(histrelin acetate)；羥基脲(hydroxyurea)；鹽酸伊達(dá)比星(idarubicin hydrochloride)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；iimofosine；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)；伊達(dá)比星(idarubicin)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)；咪喹莫特(imiquimod)；白介素Il(包括重組白介素II或rlL2)；干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-n1；干擾素α-n3；干擾素β-l a；干擾素γ-lb；異丙鉑(iproplatin)；鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；伊沙匹隆(ixabepilone)；乙酸蘭瑞肽(lanreotide acetate)；拉帕替尼(lapatinib)；來(lái)那度胺(lenalidomide)；來(lái)曲唑(letrozole)；乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；亞葉酸鈣(leucovorin calcium)；乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)；左旋咪唑(levamisole)；阿糖胞苷脂質(zhì)體(liposomal cytarabine)；鹽酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索鈉(lometrexol sodium)；洛莫司汀(lomustine)；鹽酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；馬索羅酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；鹽酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)；(megestrol acetate)；(melengestrol acetate)；美法侖(melphalan)；美諾立爾(menogaril)；巰嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；甲氨蝶呤鈉(methotrexate sodium)；甲氧沙林(methoxsalen)；氯苯氨啶(metoprine)；美烏替派(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托克星(mitocarcin)；絲裂紅素(mitocromin)；米托菌素(mitogillin)；米托馬星(mitomalcin)；絲裂霉素C(mitomycin C)；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；霉酚酸(mycophenolic acid)；苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)；奈拉濱(nelarabine)；尼洛替尼(nilotinib)；諾考達(dá)唑(nocodazoie)；若莫單抗(nofetumomab)；諾加霉素(nogalamycin)；奧法木單抗(ofatumumab)；奧普瑞白介素(oprelvekin)；奧馬鉑(ormaplatin)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；奧西舒侖(oxisuran)；多西他賽(paclitaxel)；帕利夫明(palifermin)；鹽酸帕諾洛司瓊(palonosetron hydrochloride)；帕米磷酸鹽(pamidronate)；培非格司亭(pegfilgrastim)；培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)；噴司他丁(pentostatin)；帕尼單抗(panitumumab)；鹽酸帕唑帕尼(pazopanib hydrochloride)；培美曲塞二鈉(pemetrexed disodium)；普樂(lè)沙福(plerixafor)；普拉曲沙(pralatrexate)；培加帕酶(pegaspargase)；佩里霉素(peliomycin)；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；過(guò)磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；鹽酸吡羅蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；光神霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆鈉(porfimer sodium)；紫菜霉素(porfiromycin)；潑尼莫司汀(prednimustine)；鹽酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)；嘌呤霉素(puromycin)；鹽酸嘌呤霉素(puromycin hydrochloride)；吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)；奎納克林(quinacrine)；鹽酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)；拉布立酶(rasburicase)；重組HPV二價(jià)疫苗；重組HPV四價(jià)疫苗；利波腺苷(riboprine)；洛太米特(rogletimide)；利妥昔單抗(rituximab)；羅米地辛(romidepsin)；羅米司亭(romiplostim)；沙芬戈(safingol)；鹽酸沙芬戈(safingol hydrochloride)；沙莫司亭(sargramostim)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；sipuleucel-T；索拉非尼(sorafenib)；磷乙酰天冬氨酸鈉(sparfosate sodium)；司帕索霉素(sparsomycin)；鹽酸螺鍺(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺鉑(spiroplatin)；鏈黑菌素(streptonigrin)；鏈佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；蘋(píng)果酸舒尼替尼(sunitinib malate)；他利霉素(talisomycin)；他莫昔芬；枸櫞酸他莫昔芬；替可加蘭鈉(tecogalan sodium)；替加氟(tegafur)；鹽酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫唑胺(temozolomide)；替莫卟吩(temoporfin)；坦西莫司(temsirolimus)；替尼泊苷(teniposide)；替羅昔隆(teroxirone)；睪內(nèi)酯(testolactone)；沙利度胺(thalidomide)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑扶林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；鹽酸托泊替康(topotecan hydrochloride)；托瑞米芬(toremifene)；托西莫單抗(tositumomab)和I¹³¹碘托西莫單抗；曲妥單抗(trastuzumab)；乙酸曲托龍(trestolone acetate)；維甲酸(tretinoin)；磷酸曲西立濱(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；鹽酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；烏瑞替派(uredepa)；戊柔比星(valrubicin)；伐普肽(vapreotide)；維替泊芬(verteporfin)；長(zhǎng)春堿(vinblastine)；硫酸長(zhǎng)春堿(vinblastine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春新堿(vincristine sulfate)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；硫酸長(zhǎng)春地辛(vindesine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸環(huán)氧長(zhǎng)春堿(vinleurosine sulfate)；酒石酸長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine tartrate)；硫酸異長(zhǎng)春堿(vinrosidine sulfate)；硫酸長(zhǎng)春利定(vinzolidine sulfate)；伏立諾地(vorinostat)；伏氯唑(vorozole)；折尼鉑(zeniplatin)；凈司他丁(zinostatin)；唑來(lái)膦酸(zoledronic acid)；和鹽酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與止吐劑組合使用以治療由使用式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物、抗癌劑和/或放射療法引起的惡心或嘔吐。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與用于治療貧血和中性粒細(xì)胞減少的藥物組合使用。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與皮質(zhì)類(lèi)固醇給予。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與鎮(zhèn)痛藥共同給予。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與放射療法(或放療)組合使用。放射療法是用電離放射治療癌癥和其它疾病。任選地使用放射療法治療局部實(shí)體瘤，諸如皮膚、舌、喉、腦、乳腺、前列腺、結(jié)腸、子宮和/或子宮頸的癌癥。它還任選地用于治療白血病和淋巴瘤(分別為造血細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)的癌癥)。

用于向癌細(xì)胞遞送放射的技術(shù)是將放射性植入物直接放置在腫瘤或體腔中。這稱(chēng)為內(nèi)部放射療法(近距離放射療法、間質(zhì)輻照和腔內(nèi)輻照是內(nèi)部放射療法的類(lèi)型)。使用內(nèi)部放射療法、放射劑量集中在小區(qū)域，并且患者住院若干天。內(nèi)部放射療法經(jīng)常用于舌、子宮、前列腺、結(jié)腸和子宮頸的癌癥。術(shù)語(yǔ)“放射療法”或“電離放射”包括所有形式的放射，包括但不限于α、β和γ放射和紫外光。

在一些實(shí)施方案中，式(A)、(B)、(C)或(D)的化合物或其藥用鹽與至少一種額外用于乳腺癌的治療選擇組合用于治療乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選擇包括乳腺癌手術(shù)。在一些實(shí)施方案中，乳腺癌手術(shù)包括乳房切除術(shù)(lumpectomy)、乳頭切除術(shù)(mastectomy)、前哨淋巴結(jié)活檢(sentinel node biopsy)或腋窩淋巴結(jié)切除術(shù)(axillary node dissection)。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選擇包括放射療法。在一些實(shí)施方案中，放射包括外部束放射或近距離放射療法。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選項(xiàng)包括激素療法(即激素阻斷療法)。在一些實(shí)施方案中，激素療法包括使用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(例如他莫昔芬)、芳香酶抑制劑或氟維司群。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選擇包括去除卵巢的手術(shù)或使卵巢終止產(chǎn)生雌激素的藥物。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選擇包括使用曲妥單抗、拉帕替尼或貝伐單抗。在一些實(shí)施方案中，所述額外治療選擇包括使用預(yù)防乳腺癌復(fù)發(fā)(例如唑來(lái)膦酸(Reclast,Zometa))的骨形成藥物。

試劑盒/制品

為了用于本申請(qǐng)所述的診斷和治療應(yīng)用，本申請(qǐng)還描述了試劑盒和制品。這樣的試劑盒可包括被分隔以接收一個(gè)或多個(gè)容器諸如小瓶、管等的載體、包裝或容器，每個(gè)容器包括在本申請(qǐng)所述方法中使用的單獨(dú)元件之一。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器由任何可接受的材料形成，包括例如玻璃或塑料。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑脑噭┖杏糜谠谑茉囌咧袡z測(cè)編碼突變型ER-α多肽的核酸或用于檢測(cè)受試者中的突變型ER-α多肽(即診斷試劑盒)。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒用于選擇用式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物治療的患者，用于鑒定對(duì)激素療法具有抗性或可能變得具有抗性的受試者，用于監(jiān)測(cè)對(duì)激素療法的抗性的發(fā)展，或它們的組合。本申請(qǐng)?zhí)峁┑脑噭┖泻幸环N或多種試劑，其用于檢測(cè)編碼突變型ER-α多肽的核酸，用于檢測(cè)突變型ER-α多肽，用于檢測(cè)來(lái)自受試者的細(xì)胞中ER活性，或它們的組合。示例性試劑包括但不限于緩沖液、PCR試劑、抗體、用于酶染色的底物、發(fā)色團(tuán)或其它材料，諸如載玻片、容器、微量滴定板，以及任選地用于進(jìn)行所述方法的說(shuō)明書(shū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多其它可能的可用于接觸各種材料的容器和板及試劑。試劑盒還可含有對(duì)照樣品，例如核酸或蛋白質(zhì)，諸如本申請(qǐng)?zhí)峁┑耐蛔冃虴R-α多肽或編碼本申請(qǐng)?zhí)峁┑耐蛔冃虴R-α多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有一組或多組用于檢測(cè)內(nèi)源性ER基因表達(dá)的寡核苷酸引物。

在一些實(shí)施方案中，所述容器可包含一種或多種式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物，任選地在組合物中或與本申請(qǐng)公開(kāi)的另一種藥物組合。所述容器任選地具有無(wú)菌入口(例如，所述容器可為靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。這樣的試劑盒任選地包含具有與其在本申請(qǐng)所述方法中的用途相關(guān)的識(shí)別描述或標(biāo)記或說(shuō)明書(shū)的化合物。

試劑盒通常包含一個(gè)或多個(gè)額外的容器，每個(gè)容器具有從商業(yè)和用戶(hù)角度考慮使用本申請(qǐng)所述的化合物所需的各種材料(諸如試劑，任選地呈濃縮形式和/或裝置)中的一種或多種。這種材料的非限制性實(shí)例包括但不限于緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針、注射器；列出內(nèi)容和/或使用說(shuō)明的載體、包裝、容器，小瓶和/或管標(biāo)簽，以及具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。通常還將包括一組說(shuō)明書(shū)。

標(biāo)簽可在容器上或與容器相關(guān)聯(lián)。當(dāng)形成標(biāo)簽的字母、數(shù)字或其它字符附接、模制或蝕刻到容器本身時(shí)，標(biāo)簽可在容器上；當(dāng)容器存在于同樣托住容器的容器(receptacle)或載體內(nèi)時(shí)，標(biāo)簽可與容器相關(guān)聯(lián)，例如作為包裝插頁(yè)。標(biāo)記可用于指示內(nèi)容物將用于特定的治療應(yīng)用。標(biāo)簽還可用于指示使用內(nèi)容物的指導(dǎo)，諸如在本申請(qǐng)所述的方法中。

本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥破?，其包括包裝材料、在包裝材料內(nèi)的式(A)、(B)、(C)或(D)的雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽指示化合物或組合物或其藥用鹽、互變異構(gòu)體、藥用N-氧化物、藥學(xué)活性代謝物、藥用前藥或藥用溶劑化物，所述制品用于降低、減少或消除活化的雌激素受體的作用，或用于治療、預(yù)防或改善一種或多種將受益于雌激素受體活性降低或消除的疾病或病癥的癥狀。

實(shí)施例

提供這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的而非限制本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋?quán)利要求的范圍。

實(shí)施例1:MCF-7 3x ERE熒光素酶轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定

在本實(shí)施例中，在MCF7乳腺癌細(xì)胞中，使用3x ERE-熒光素酶報(bào)道蛋白針對(duì)ER調(diào)節(jié)劑雌二醇、4-OH他莫昔芬、氟維司群和一組化合物，評(píng)估了對(duì)選擇的突變型雌激素受體和刺激的野生型雌激素受體活性的組成性轉(zhuǎn)錄活性的抑制的最大相對(duì)IC50。在該測(cè)定中使用的條件下，野生型和所有突變型雌激素受體展現(xiàn)可通過(guò)ER配體調(diào)節(jié)的可測(cè)量的組成性、序列依賴(lài)性和雌二醇非依賴(lài)性基礎(chǔ)活性。因此，所有數(shù)據(jù)都是在不存在雌二醇的情況下相對(duì)于野生型雌激素受體而言。

將MCF7細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％FCS的RPMI 1640中。轉(zhuǎn)錄測(cè)定通過(guò)如下進(jìn)行：將100μL細(xì)胞以250,000個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種到補(bǔ)充有10％活性炭處理的(charcoal stripped)血清的RPMI 1640的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并使其附著過(guò)夜。使用Lipofectin(Life Technologies)根據(jù)制造商的方案瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用150ng 3X ERE-TK-Luc(報(bào)道蛋白載體)、30ng CMVpRL(標(biāo)準(zhǔn)化載體)和300ng pCDNA ERα(或ERα突變體)進(jìn)行一式三份轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育過(guò)夜，然后用配體處理。將化合物連續(xù)稀釋?zhuān)蚣?xì)胞中添加50μL化合物+補(bǔ)充有活性炭處理的血清的RPMI 1640。孵育24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞在40μL裂解緩沖液(25mM Tris磷酸鹽、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解。在添加40μL熒光素酶緩沖液(20mM Tricine、0.1mM EDTA、1.07mM(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O、2.67mM MgSO₄、33.3mM DTT、270μM輔酶A、470μM熒光素酶、530μM ATP)后立即測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase)活性。在添加40μL腔腸素(coelenterazine)緩沖液(1.1M NaCl、2.2mM Na₂EDTA、0.22M K_xPO₄(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN₃、1.43μM腔腸素，最終pH調(diào)節(jié)至5.0)后測(cè)量花蟲(chóng)型熒光素酶(Renilla luciferase)。每種化合物的最大相對(duì)激動(dòng)劑活性源自代表每個(gè)突變體受體的最大響應(yīng)(劑量響應(yīng)曲線的底部)的劑量響應(yīng)曲線上的點(diǎn)，如以下圖表所示：RLU樣品/RLU wtER-αDMSO×100＝相對(duì)活性。每種化合物的相對(duì)IC50如下確定：IC50ER-α突變體/IC50wt ER-α。

本申請(qǐng)公開(kāi)的代表性化合物的示例性轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)示于表5：

表5

:‘+’:>10nM；‘++’:1–10nM；‘+++’:<1nM

實(shí)施例2:ERM化合物1-3在具有局部晚期或轉(zhuǎn)移性ER+乳腺癌和局部確認(rèn)的ESR1突變的絕經(jīng)后婦女中的臨床試驗(yàn)

這是一個(gè)開(kāi)放標(biāo)簽的臨床試驗(yàn)，評(píng)價(jià)ERM化合物1-3、(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽在患有具有確認(rèn)的ESR1突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性ER+(HER2-)乳腺癌的絕經(jīng)后婦女中的療效和安全性。

目的：為了在局部晚期或轉(zhuǎn)移性ER+(HER2-)乳腺癌和確認(rèn)的ESR1突變的絕經(jīng)后婦女中評(píng)價(jià)ERM化合物1-3，即(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽的藥物動(dòng)力學(xué)(PK)、安全性和耐受性并評(píng)估它們的抗腫瘤活性的初步證據(jù)。額外目的包括：用[¹⁸F]-氟雌二醇(FES)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)[FES PET]進(jìn)行藥效學(xué)(PD)響應(yīng)的生物標(biāo)志物的探索性評(píng)價(jià)；進(jìn)行ER靶基因表達(dá)的探索性評(píng)價(jià)；在單次或多次劑量治療(例如C_max、T_max、AUC、T_1/2)后，進(jìn)行對(duì)(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽的抗性機(jī)制的探索性評(píng)價(jià)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：對(duì)本研究中的婦女給予推薦的第2階段劑量的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽，或指定逐漸升高劑量的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽，其中起始劑量為約400mg/天的(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽，接著此后以約200mg增量進(jìn)行劑量遞增。在用芳香酶抑制劑治療之后，患者應(yīng)具有可測(cè)量的疾病進(jìn)展以及確認(rèn)的ESR1突變。

所有患者將被治療直到疾病進(jìn)展、不可接受的毒性或患者撤回同意。

患者選擇

納入標(biāo)準(zhǔn)：

1.具有以下證據(jù)的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證明的乳腺腺癌的診斷：不適合具有治療意圖的切除或放射療法的局部復(fù)發(fā)性疾病，或轉(zhuǎn)移性疾病，兩者在ER+乳腺癌的激素療法至少6個(gè)月后進(jìn)展

2.ER陽(yáng)性腫瘤(通過(guò)免疫組織化學(xué)[IHC]按照實(shí)驗(yàn)室測(cè)試在≥1％細(xì)胞中染色)

3.按照當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室測(cè)試，HER2陰性乳腺癌(對(duì)于細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的IHC結(jié)果為0或+1，或?qū)τ诓缓袃?nèi)部對(duì)照探針的系統(tǒng)，顯示HER2/CEP17比例<1.8的FISH結(jié)果或每個(gè)細(xì)胞核平均少于4個(gè)HER2基因拷貝)

4.根據(jù)RECIST v1.1可評(píng)估的疾病進(jìn)一步定義如下：

可測(cè)量的疾病或可評(píng)估的骨病，即，在沒(méi)有可測(cè)量的損害的情況下裂解或混合(裂解+硬化)的骨損害。注意：先前輻照的損害被認(rèn)為是可測(cè)量的，只有在放射完成后當(dāng)場(chǎng)記錄進(jìn)展。具有不可測(cè)量的、不可評(píng)估的損害(諸如胸腔積液)的患者不適合于試驗(yàn)的劑量擴(kuò)大部分

5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的ESR1突變。用芳香酶抑制劑治療后的疾病進(jìn)展。

6.從使用他莫昔芬已經(jīng)經(jīng)過(guò)至少2個(gè)月

7.從使用任何其它抗癌激素療法已經(jīng)經(jīng)過(guò)至少2個(gè)月

8.從使用化學(xué)療法已經(jīng)經(jīng)過(guò)至少3周

9.女性，18歲或更年長(zhǎng)

10.絕經(jīng)后狀態(tài)定義如下：

先前的雙側(cè)外科卵巢切除術(shù)

年齡≥56歲：自上次月經(jīng)后≥1年的自然性閉經(jīng)

年齡<56歲，自上次月經(jīng)后閉經(jīng)≥1年且血清雌二醇水平(<20pg/mL)和FSH水平(>40mIU/mL)在絕經(jīng)后范圍內(nèi)

年齡<56歲，其經(jīng)歷子宮切除術(shù)，其中一個(gè)或兩個(gè)卵巢留在原位，或具有他莫昔芬誘導(dǎo)的閉經(jīng)以及他莫昔芬停用≥1年且血清雌二醇水平(<20pg/mL)和FSH水平(>40mIU/mL)在絕經(jīng)后范圍內(nèi)

11.東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)體力狀態(tài)≤2(對(duì)于A組)或≤1(對(duì)于B1組和B2組)。

12.先前療法或外科手術(shù)的所有急性毒性作用相對(duì)于基線的分辨率或等級(jí)≤1級(jí)(除非脫發(fā)或其它毒性不被認(rèn)為是針對(duì)患者的安全性風(fēng)險(xiǎn))

13.適當(dāng)?shù)钠鞴俟δ苋缫韵聵?biāo)準(zhǔn)所定義：

絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(ANC)≥1500/μL

血小板≥100,000/μL

血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)≤3x正常上限(ULN)，或如果肝功能異常是由于潛在的惡性腫瘤，則AST和ALT≤5xULN

總血清膽紅素≤1.5x ULN，不考慮繼發(fā)于腫瘤肝轉(zhuǎn)移。允許納入具有由于吉爾伯特綜合征而增加的血清間接膽紅素(≤3x ULN)的患者

血清肌酐≤1.5x ULN

QTc≤460毫秒

14.簽署并注明日期的知情同意文件，表明該受試者(或法律上可接受的代表)在入選前已被告知試驗(yàn)的所有相關(guān)方面

15.遵守定期訪問(wèn)、治療計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)室測(cè)試和其它試驗(yàn)操作的意愿和能力

排除標(biāo)準(zhǔn)：

1.未治療或有癥狀的CNS轉(zhuǎn)移。注意：如果長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類(lèi)固醇在招錄前4周內(nèi)已經(jīng)中止，則允許在招錄前12周內(nèi)具有放射學(xué)穩(wěn)定的治療和無(wú)癥狀CNS轉(zhuǎn)移的患者

2.子宮內(nèi)膜病癥

3.在晚期/轉(zhuǎn)移性環(huán)境中大于1的先前化學(xué)療法。

4.使用針對(duì)晚期疾病的任何系統(tǒng)性抗癌療法的當(dāng)前治療或?qū)α硪慌R床試驗(yàn)的任何系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)性治療

5.在招錄前2年內(nèi)診斷任何繼發(fā)性惡性腫瘤，除了充分治療的基底細(xì)胞或鱗狀細(xì)胞皮膚癌或原位癌之外

6.在招錄前12個(gè)月內(nèi)具有任何以下情況：心肌梗塞、嚴(yán)重/不穩(wěn)定型心絞痛、≥2級(jí)的持續(xù)性心律失常、任何等級(jí)的心房纖維顫動(dòng)、冠狀動(dòng)脈/外周動(dòng)脈旁路移植術(shù)、有癥狀的充血性心力衰竭，或腦血管意外(包括短暫性缺血發(fā)作)

7.活動(dòng)性炎性腸病或慢性腹瀉、短腸綜合征或上胃腸外科手術(shù)(包括胃切除術(shù))

8.已知的人類(lèi)免疫缺陷病毒感染

9.招錄前4周內(nèi)進(jìn)行大手術(shù)或放射療法

10.其它嚴(yán)重急性或慢性醫(yī)學(xué)或精神病癥或?qū)嶒?yàn)室異常，其可能增加與研究參與或研究產(chǎn)品管理相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，或可能干擾研究結(jié)果的解釋?zhuān)⑶以谘芯空叩呐袛嘀?，將使受試者不適合進(jìn)入這項(xiàng)研究

腫瘤評(píng)估：將進(jìn)行疾病評(píng)估。成像研究將包括胸部、腹部和骨盆的CT掃描，以及骨掃描。目標(biāo)腫瘤響應(yīng)或疾病進(jìn)展的放射學(xué)確認(rèn)將基于RECIST v1.1(Eisenhauer,2009)。對(duì)于在骨掃描上檢測(cè)到的新的骨損害，將需要第二成像模式(例如，CT或MRI)以確認(rèn)進(jìn)展。

在篩選和隨訪期間應(yīng)使用相同的評(píng)估方法和相同的技術(shù)。當(dāng)沒(méi)有醫(yī)學(xué)禁忌時(shí)，需要靜脈內(nèi)(IV)造影(contrast)。對(duì)IV造影具有禁忌癥的患者可進(jìn)行腹部和骨盆的MRI檢查來(lái)代替CT和胸部的非造影CT。通過(guò)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)掃描或通過(guò)超聲的腫瘤評(píng)估可能不能代替CT。

相關(guān)研究

用¹⁸FES-PET靶標(biāo)結(jié)合(Target Engagement)的藥效學(xué)：使用[18F]-氟雌二醇(FES)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)進(jìn)行成像以定量腫瘤中的ER表達(dá)，并評(píng)估對(duì)用(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽的療法的藥效學(xué)響應(yīng)。雖然FES攝取可在患者之間變化，但是一般來(lái)說(shuō)，在給定時(shí)間點(diǎn)的損害處的FES攝取是相當(dāng)一致的，并且平均攝取提供了個(gè)體患者的ER表達(dá)的合理概括。將影響標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)的因素，諸如性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Peterson,2011)進(jìn)行調(diào)整。此外，由于每種藥物的半衰期長(zhǎng)及它們可能干擾FES攝取，對(duì)于先前用他莫昔芬(至少2個(gè)月)或氟維司群(至少6個(gè)月)治療的患者可能需要清除期。FES-PET研究將作為混合PET/CT成像用于衰減校正和損害定位。

組織芯活檢(Core Biopsies)：收集治療前和治療后的腫瘤活檢(軟組織或內(nèi)臟損害)，以評(píng)估：

-腫瘤組織學(xué)；腫瘤vs基質(zhì)，vs纖維組織

-通過(guò)免疫組織化學(xué)與免疫熒光評(píng)估ERα和PR蛋白水平

-增殖指數(shù)(Ki67)

-ER靶基因調(diào)節(jié)：可監(jiān)測(cè)的ER靶基因的實(shí)例包括但不限于：AGR2、AREG、C3、CCND1、CXCL12、ERBB2、GREB1、IL6、IRS1、PDZK1、PGR、SEMA3B、TFF1、TFF2、TFF3、TOP2A、WISP2。

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)：在所有患者中，在劑量遞增和劑量擴(kuò)展期間，在篩選、治療和在研究終止時(shí)收集額外血液樣品用于分析循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。

最近的臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明ER-α和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化的亞基α(PIK3CA)的突變與內(nèi)分泌抗性乳腺癌相關(guān)。為了深入了解(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸或其藥用鹽和抗性機(jī)制之間潛在的因果關(guān)系，將會(huì)使用高級(jí)DNA分析技術(shù)在分離自血漿的ctDNA中監(jiān)測(cè)這些基因的突變狀態(tài)：諸如敏感性、基于乳化PCR的BEAMing(Beads,Emulsions,Amplification,and Magnetics)方法(Dressman,2003)或下一代測(cè)序。

實(shí)施例3:ERM化合物1-3(ARN-810)對(duì)臨床相對(duì)ESR1突變的活性

本研究的目的是評(píng)估表1中的ERM 1-3即(E)-3-(4-((E)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1H-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基)苯基)丙烯酸對(duì)臨床相關(guān)雌激素受體突變的功效，已提出該突變賦予對(duì)抗激素療法諸如芳香酶抑制劑的抗性。在穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的ER依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定和活力測(cè)定中體外測(cè)量ERM 1-3的效力和功效。將ERM 1-3活性與臨床相關(guān)的ER-α靶向乳腺癌治療劑4-羥基他莫昔芬(他莫昔芬的活性代謝產(chǎn)物)和氟維司群比較。在基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中，ERM 1-3抑制所有ER-α突變(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的活性，測(cè)試具有納摩爾濃度效力，并且功效接近或大于針對(duì)野生型受體所觀察到的。在穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞中，ERM 1-3使活細(xì)胞的數(shù)目減少44％-78％(在5天增殖性測(cè)定中與DMSO對(duì)照相比)，這取決于突變和測(cè)定格式。在報(bào)道蛋白和增殖性測(cè)定兩者中，在ESR1突變組中，與野生型ER-α相比，ERM 1-3展現(xiàn)0.8至210倍降低的效力。然而，與轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定相比，在活力測(cè)定中ERM 1-3通常比穩(wěn)定表達(dá)野生型ER-α的細(xì)胞展現(xiàn)出降低的效能。

化合物和制劑：

如WO 2012/037410實(shí)施例36和WO 2012/037411實(shí)施例50中所述制備ERM 1-3。藥品樣品具有>95％純度(純度評(píng)估：核磁共振/液相色譜-質(zhì)譜)且為灰白色粉末。采用該分子的鈉鹽或N-甲基-D-葡糖胺鹽形式。ARN-810以10mM溶于DMSO中的儲(chǔ)備溶液形式提供，其在-20℃儲(chǔ)存。

氟維司群(中性形式)購(gòu)自Waterstone Technology(WS10032)并以10mM的終濃度再混懸于無(wú)水DMSO中，然后分配成等分試樣并在-80℃儲(chǔ)存。

4-羥基他莫昔芬購(gòu)自Sigma Aldrich，以10mM的終濃度再混懸于無(wú)水DMSO中，然后分配成等分試樣并在-80℃儲(chǔ)存。

MCF-7細(xì)胞可獲自ATCC( HTB-22^TM)。在培養(yǎng)中一次傳代后，將細(xì)胞擴(kuò)增并儲(chǔ)存在液氮中。將一小瓶冷凍細(xì)胞解凍，并每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行培養(yǎng)，然后每周兩次分開(kāi)。將解凍的細(xì)胞培養(yǎng)兩周以允許在任何測(cè)定中使用之前從冷凍過(guò)程中恢復(fù)。在本報(bào)告中詳述的測(cè)定中使用的細(xì)胞經(jīng)歷了從初始解凍起5至22次傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)介質(zhì)

Corning^TM cellgro^TM RPMI 1640(Corning,Catalog No.15-040)

Corning^TM cellgro^TM RPMI 1640，不含酚紅(Corning,Catalog No.17-105)

Thermo Scientific^TM HyClone^TM胎牛血清(U.S.),具有特征的-(FBS)(Thermo Scientific Catalog No.SH3007103)

Thermo Scientific^TM HyClone^TM胎牛血清(U.S.),經(jīng)炭/葡聚糖處理的-(Thermo Scientific,Catalog No.SH3006803)

其它試劑

試劑(Promega,Catalog No.G7572)

帶蓋、平底、低法蘭、經(jīng)組織培養(yǎng)處理的、無(wú)菌、白色聚苯乙烯384孔測(cè)定板(Corning,Catalog No.3570)

無(wú)水二甲基亞砜(Sigma Aldrich,Catalog No.276855-100mL)

Matrix 12通道電子移液器,0.5-12.5μL,2-125μL,和Matrix 8通道電子移液器,15-1250μL

96-孔經(jīng)TC-處理的無(wú)菌聚苯乙烯板(Corning Inc.,Catalog Nos.3903,3904或3917)

Lipofectin(Invitrogen,Catalog No.18292037)

D-熒光素鉀鹽(Gold Biotechnology,Catalog No.LUCK-500)

Perkin Elmer EnVision 2103^TM多標(biāo)簽閱讀器

Molecular Devices Analyst^TM GT多模式閱讀器

Reichert 改良的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(Hausser Scientific,Catalog No.1490)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：以GraphPad 軟件使用log(抑制劑)對(duì)響應(yīng)可變斜率(四參數(shù))曲線擬合，使用GraphPad Prism Version 6.01和Microsoft Office Excel(2010)產(chǎn)生曲線擬合及IC₅₀和E_max值。

實(shí)施例4:ER-α轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定

將MCF7細(xì)胞保持在補(bǔ)充有10％FCS的RPMI 1640中。轉(zhuǎn)錄測(cè)定通過(guò)如下進(jìn)行：將100μL細(xì)胞以250,000個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種到補(bǔ)充有10％活性炭處理的血清的RPMI 1640的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并使其附著過(guò)夜。使用Lipofectin(Life Technologies)根據(jù)制造商的方案瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用180ng 3X ERE-TK-Luc(報(bào)道蛋白載體)、30ng pRL-CMV(標(biāo)準(zhǔn)化載體)和270ng pCDNA ERα(或ERα突變體)進(jìn)行一式三份轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育過(guò)夜，然后用配體處理。針對(duì)ER激動(dòng)劑測(cè)定，將化合物連續(xù)稀釋?zhuān)蚣?xì)胞中添加50μL化合物及補(bǔ)充有活性炭處理的血清的RPMI 1640。

對(duì)于ER拮抗劑測(cè)定，將化合物連續(xù)稀釋并向細(xì)胞中添加于補(bǔ)充有活性炭處理的血清的RPMI 1640中的50μL化合物及3nM 17β-雌二醇。孵育24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞在40μL裂解緩沖液(25mM Tris磷酸鹽、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解。

在添加40μL熒光素酶緩沖液(20mM Tricine、0.1mM EDTA、1.07mM(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O、2.67mM MgSO₄、33.3mM DTT、270μM輔酶A、470μM熒光素、530μM ATP)后立即測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。在添加40μL腔腸素緩沖液(1.1M NaCl、2.2mM Na₂EDTA、0.22M K_xPO₄(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN₃、1.43μM腔腸素，最終pH調(diào)節(jié)至5.0)后測(cè)量花蟲(chóng)型熒光素酶。每種化合物的最大相對(duì)激動(dòng)劑活性源自代表每個(gè)突變體受體的劑量響應(yīng)曲線的底部，如以下所示：RLU樣品/RLU wtER-αDMSO＝相對(duì)活性。

MCF-7突變型ER-α穩(wěn)定細(xì)胞系產(chǎn)生：通過(guò)將包含氨基末端血凝素標(biāo)簽的ESR1野生型和突變型cDNA亞克隆到pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro)(稱(chēng)為EF1HA-ER-α)和pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro(稱(chēng)為UbC HA-ER-α)中，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)野生型或ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞。除了空載體陰性對(duì)照外，隨后根據(jù)制造商的方案用pPACKH1包裝質(zhì)?；旌衔?System Biosciences)將所得質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4天，從細(xì)胞培養(yǎng)基純化慢病毒顆粒，分層并儲(chǔ)存在-80℃。用純化的病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7細(xì)胞，并通過(guò)在含有10％FBS及分別用于pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro)和pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro的1μG/mL嘌呤霉素或200μG/mL潮霉素的RPMI中生長(zhǎng)來(lái)選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系。選擇后，使用6E2小鼠單克隆HA抗體(Cell Signaling)通過(guò)蛋白免疫印跡法(western blot)證實(shí)野生型和突變型ER-α的表達(dá)。

MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞系存活率：在含有10％CSS及NEAA和丙酮酸鈉的不含苯酚的RPMI中，使用濃度調(diào)節(jié)至40,000個(gè)細(xì)胞/mL的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)MCF-7細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用Matrix 16通道電子移液器將16微升細(xì)胞混懸液添加至384孔經(jīng)組織培養(yǎng)處理的白色透明底聚苯乙烯板(Corning)的每個(gè)孔中。將細(xì)胞孵育過(guò)夜以允許細(xì)胞粘附。第二日，使用Matrix 16通道電子移液器將16微升含有10％CSS及NEAA和丙酮酸鈉的不含苯酚的RPMI添加至一個(gè)板的孔中，然后添加16μL CellTiter-Glo(Promega,Madison WI)發(fā)光細(xì)胞存活力試劑(luminescent cell viability reagent)。在室溫孵育20分鐘后，在Perkin Elmer Envision 2103多標(biāo)簽閱讀器上測(cè)量發(fā)光，其中發(fā)光測(cè)量高度設(shè)定為6.5mm，且最大積分時(shí)間為1秒?？椎南鄬?duì)發(fā)光單位(RLU)的“平均值”被認(rèn)為是時(shí)間＝零時(shí)的基線值。此外，使用Matrix 12通道電子移液器在DMSO(Sigma-Aldrich)中進(jìn)行10點(diǎn)、1:5連續(xù)稀釋(包括僅作為陽(yáng)性對(duì)照的DMSO)。然后將4μL的各稀釋液添加至196μL含有10％CSS及NEAA和丙酮酸鈉的RPMI中。將16μL含有化合物的培養(yǎng)基以10μM至5pM的終濃度添加至細(xì)胞中。使用Matrix 12通道電子移液器在培養(yǎng)基中稀釋化合物并隨后添加至細(xì)胞中。化合物暴露5天后，使用Matrix 16通道電子移液器向細(xì)胞中添加16μL CellTiter-Glo(Promega,Madison WI)發(fā)光細(xì)胞存活力試劑。使用添加至32μL無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基中的CellTiter-Glo獲得背景值。在Perkin Elmer Envision 2103多標(biāo)簽閱讀器上測(cè)量發(fā)光，其中發(fā)光測(cè)量高度設(shè)定為0mm，且最大積分時(shí)間為0.1秒。測(cè)量每個(gè)孔的相對(duì)發(fā)光單位(RLU)，并如下確定每個(gè)樣品的相對(duì)增殖(倍數(shù))：(RLU樣品-RLU背景)/(T＝0時(shí)的RLU)＝相對(duì)增殖

實(shí)施例5化合物1-3(ARN-810)和ER轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定

在瞬時(shí)表達(dá)野生型ER-α或ER-α突變體的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中評(píng)價(jià)化合物1-3(ARN-810)、4-羥基他莫昔芬和氟維司群對(duì)臨床相關(guān)ESR1突變(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的轉(zhuǎn)錄活性的作用。用ER應(yīng)答轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白及野生型或突變型ER-α表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，并用范圍為0.1pM至10μM的ARN-810、4-羥基他莫昔芬或氟維司群或范圍為0.1pM至1μM的17β-雌二醇處理。為了評(píng)估化合物的潛在激動(dòng)劑活性，在不存在雌二醇的情況下處理細(xì)胞。在1nM雌二醇存在的情況下進(jìn)行拮抗劑測(cè)定。如表6所示，在不存在雌二醇的情況下，所有分析的臨床突變表現(xiàn)出可檢測(cè)的配體非依賴(lài)性活性，其被ARN-810、4-羥基他莫昔芬和氟維司群抑制達(dá)到接近野生型的水平。所有拮抗劑對(duì)測(cè)試的突變保持納摩爾濃度效力(表7)。然而，除了少數(shù)例外(4-羥基他莫昔芬對(duì)E380Q和L536P的活性)，在激動(dòng)劑模式中，與野生型ER-α相比，所有拮抗劑表現(xiàn)出對(duì)突變型受體的效力的適度降低(1.1至61倍)，其中對(duì)于在ARN-810對(duì)Y537S突變中觀察到最大61倍的降低。當(dāng)在拮抗劑模式轉(zhuǎn)錄測(cè)定中分析ESR1突變(L536R、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的亞組時(shí)，觀察到對(duì)功效的類(lèi)似效應(yīng)。然而，在雌二醇存在的情況下，用ARN-810觀察到的效力變化不太明顯。具體來(lái)說(shuō)，在臨床相關(guān)突變ARN-810上，IC₅₀改變0.8至1.7倍，并且最大功效接近在野生型受體上觀察到的功效(表8和9)。

表6 ARN-810抑制臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄活性(激動(dòng)劑模式,-E2)

E_max是相對(duì)于媒介物處理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表7 ARN-810為臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄拮抗劑(激動(dòng)劑模式,-E2)

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表8 ARN-810拮抗臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄活性(拮抗劑模式,+E2)

E_max是相對(duì)于媒介物處理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表9 ARN-810為臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄拮抗劑(拮抗劑模式,+E2)

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

存活力測(cè)定：為了評(píng)估ARN-810拮抗患者中鑒定的組成型活性ER-α突變的配體非依賴(lài)性增殖活性的能力，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G氨基末端血凝素標(biāo)簽的ER-α(HA-ER-α)的MCF-7細(xì)胞系。因?yàn)镋R-α過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)配體非依賴(lài)性生長(zhǎng)并且還可使配體介導(dǎo)的降解途徑飽和，所以利用UbC和EF1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ER-α表達(dá)，針對(duì)每個(gè)受體產(chǎn)生獨(dú)立的穩(wěn)定細(xì)胞系(Li S,,et al.Cell Rep(2013)；4(6):1116-1130；Wardell SE,et al.Biochem Pharmacol(2011)；82(2):122-130)。UbC啟動(dòng)子由制造商(System Biosciences)報(bào)道以表達(dá)低至中等RNA水平，而EF1啟動(dòng)子表達(dá)高水平(System Biosciences)。如通過(guò)定量蛋白免疫印跡分析所確定，基于UbC的細(xì)胞系以小于10％內(nèi)源性ER-α的水平表達(dá)HA-ER-α蛋白。在另一方面，基于EF1啟動(dòng)子的細(xì)胞系以比內(nèi)源性蛋白高2至6倍的水平表達(dá)HA-ER-α和突變體。

與其在轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中的活性一致，臨床鑒定的ER-α突變體在MCF-7細(xì)胞中通過(guò)UbC或EF1啟動(dòng)子的表達(dá)賦予細(xì)胞在不存在17β-雌二醇的情況下增殖的能力(表10和14)。然而，使用EF1啟動(dòng)子獲得的高水平的野生型ER-α表達(dá)(約為內(nèi)源性蛋白水平的2-3倍)也足以促進(jìn)配體非依賴(lài)性生長(zhǎng)。

在基于UbC啟動(dòng)子的細(xì)胞系中，化合物1-3(ARN-810)、4-羥基他莫昔芬和氟維司群以激動(dòng)劑和拮抗劑模式兩者拮抗穩(wěn)定表達(dá)野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G HA-ER-α的細(xì)胞系的增殖(表10和12)。氟維司群和ARN-810表現(xiàn)出相似的功效(對(duì)于激動(dòng)劑和拮抗劑模式分別為47％至67％和71％至78％抑制)，而4-羥基他莫西芬在所測(cè)試的所有突變上展現(xiàn)出降低的功效。在激動(dòng)劑和拮抗劑模式中，所有三種拮抗劑對(duì)UbC HA-ER-α突變型細(xì)胞系展現(xiàn)出高皮摩爾濃度至低納摩爾濃度IC₅₀(表11和13)。在激動(dòng)劑模式下，UbC野生型HA-ER-α細(xì)胞系沒(méi)有充分增殖以得到準(zhǔn)確的IC₅₀，然而，在拮抗劑模式中，與野生型ER-α相比，所有拮抗劑均展現(xiàn)出效力的適度降低(1.3-至5.4倍，表13)。

在EF1衍生的細(xì)胞系中，在激動(dòng)劑模式中，與野生型相比，所有拮抗劑對(duì)突變型受體表現(xiàn)出降低的效力(對(duì)于4-羥基他莫昔芬、氟維司群和ARN-810分別為8至140倍、2-至47倍和2-至210倍)。此外，與氟維司群和4-羥基他莫昔芬兩者相比，ARN-810在Y537突變體上展現(xiàn)出降低的功能(表15和16)。當(dāng)以拮抗劑模式進(jìn)行增殖測(cè)定時(shí)，觀察到拮抗劑功效和效力的類(lèi)似觀察(表16和17)。然而，在17β-雌二醇存在的情況下，在攜帶野生型和突變型HA-ER-α的細(xì)胞系之間拮抗劑效力的差異不如在EF-1激動(dòng)劑測(cè)定中所觀察到的顯著(最大15倍)。

表10孵育5天后ARN-810減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(UbC HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言的第5天的最大刺激增殖響應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。數(shù)據(jù)是從4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表11 ARN-810為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(UbC HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表12孵育5天后ARN-810減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(UbC HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言的第5天的最大刺激增殖響應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表13 ARN-810為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(UbC HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表14孵育5天后ARN-810減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)(EF1HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言的第5天的最大刺激增殖響應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表15 ARN-810為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的增殖拮抗劑(EF1HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。ND＝未確定。

表16孵育5天后ARN-810減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(EF1HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言的第5天的最大刺激增殖響應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表17 ARN-810為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的增殖拮抗劑(EF1HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：化合物1-3(ARN-810)在基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白和細(xì)胞存活力測(cè)定中抑制臨床相關(guān)ESR1突變E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G的活性。ARN-810將ER依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中所有ESR1突變的轉(zhuǎn)錄活性抑制為達(dá)到接近野生型受體所觀察到的水平。在通過(guò)UBC啟動(dòng)子以低水平穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞中，與DMSO對(duì)照相比，ARN-810將存活細(xì)胞數(shù)減少了47％-78％。雖然ARN-810在此測(cè)定中展現(xiàn)出納摩爾濃度效力，但與野生型相比，ARN-810在突變型ER-α上表現(xiàn)出1.3至2.7倍的降低的效力。相反，當(dāng)ER-α突變體通過(guò)EF1啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)時(shí)，與野生型受體相比，ARN-810展現(xiàn)出效力降低0.6至210倍，并且與4-羥基他莫昔芬和氟維司群相比，降低最大功效(E_max)響應(yīng)。

實(shí)施例6:ERM化合物4-23對(duì)臨床相關(guān)ESR1突變的活性

本研究的目的是評(píng)估ERM 4-23，即(S)-2-(4-(2-(3-(氟甲基)氮雜環(huán)丁-1-基)乙氧基)苯基)-3-(3-羥基苯基)-4-甲基-2H-色烯-6-醇(表4)對(duì)臨床相關(guān)雌激素受體突變的功效，已提出該突變賦予對(duì)抗激素療法諸如芳香酶抑制劑的抗性。在穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的ER依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定和存活力測(cè)定中，體外測(cè)量ERM 4-23的效力和功效。將ERM 4-23活性與臨床相關(guān)的ER-α靶向乳腺癌治療劑4-羥基他莫昔芬(他莫昔芬的活性代謝產(chǎn)物)和氟維司群進(jìn)行比較。在基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中，ERM 4-23抑制所有ER-α突變(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的活性，測(cè)試具有納摩爾濃度效力，并且功效接近野生型受體所觀察到的。類(lèi)似地，在穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞中，ERM 4-23使存活細(xì)胞的數(shù)目減少49％-90％(與DMSO對(duì)照相比)，這取決于突變和測(cè)定格式。然而，在兩種測(cè)定中，在ESR1突變組中，與野生型ER-α相比，ERM 4-23展現(xiàn)0.7至23倍降低的效力。

如實(shí)施例3所示，本研究的目的是確定ERM 4-23對(duì)臨床相關(guān)ER-α突變的活性。在穩(wěn)定表達(dá)野生型或突變型ER-α(alpha)的MCF-7細(xì)胞的ER-α轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白和細(xì)胞存活力中監(jiān)測(cè)ERM 4-23活性。

如WO 2014/025138中所述制備ERM 4-23。采用該分子的鹽酸鹽形式。藥品樣品具有>95％純度(純度評(píng)估：核磁共振/液相色譜-質(zhì)譜)且為灰白色粉末。將ERM 4-23溶于二甲基亞砜(DMSO)中作為10mM儲(chǔ)備溶液并在-20℃儲(chǔ)存。采用如實(shí)施例3中所述的其它化合物和制劑。

在如實(shí)施例5所示的瞬時(shí)表達(dá)野生型ER-α或ER-α突變體的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，評(píng)價(jià)ERM化合物4-23、4-羥基他莫昔芬和氟維司群對(duì)臨床相關(guān)ESR1突變(E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的轉(zhuǎn)錄活性的作用。用ER應(yīng)答轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白及野生型或突變型ER-α表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，并用范圍為0.1pM至10μM的ERM 4-23、4-羥基他莫昔芬或氟維司群或范圍為0.1pM至1μM的17β-雌二醇處理。為了評(píng)估化合物的潛在激動(dòng)劑活性，在不存在雌二醇的情況下處理細(xì)胞。在1nM雌二醇存在的情況下進(jìn)行拮抗劑測(cè)定。如表18所示，在不存在雌二醇的情況下，所有分析的臨床突變表現(xiàn)出可檢測(cè)的配體非依賴(lài)性活性，其被ERM 4-23、4-羥基他莫昔芬和氟維司群抑制到接近野生型的水平。所有拮抗劑對(duì)測(cè)試的突變保持納摩爾濃度效力(表19)。然而，除了少數(shù)例外(4-羥基他莫昔芬對(duì)E380Q和L536P的活性)，在激動(dòng)劑模式中，與野生型ER-α相比，所有拮抗劑表現(xiàn)出對(duì)突變型受體的效力的適度降低(1.1至5.9倍)，其中對(duì)于在ERM 4-23對(duì)Y537S突變中觀察到最大5.9倍的降低。當(dāng)在拮抗劑模式轉(zhuǎn)錄測(cè)定中分析ESR1突變(L536R、Y537C、Y537N、Y537S和D538G)的亞組時(shí)，觀察到對(duì)功效和效力的類(lèi)似效應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，在臨床相關(guān)突變ERM 4-23上，IC₅₀增加0.8至1.7倍，但最大功效接近在野生型受體上所觀察到的功效(表20和21)。

表18 ERM 4-23抑制臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄活性(激動(dòng)劑模式,-E2)

E_max是相對(duì)于經(jīng)媒介物處理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表19 ERM 4-23為臨床相關(guān)ER-α突變的活性的強(qiáng)效轉(zhuǎn)錄抑制劑(激動(dòng)劑模式,-E2)

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表20 ERM 4-23拮抗臨床相關(guān)ER-α突變的轉(zhuǎn)錄活性(拮抗劑模式,+E2)

Emax是相對(duì)于經(jīng)媒介物處理的野生型ER-α而言的最大刺激活性。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表21 ERM 4-23為臨床相關(guān)ER-α突變的活性的強(qiáng)效轉(zhuǎn)錄拮抗劑(拮抗劑模式,+E2)

數(shù)據(jù)是從n次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

存活力測(cè)定：為了評(píng)估ERM 4-23拮抗患者中鑒定的組成型活性ER-α突變的配體非依賴(lài)性增殖活性的能力，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G氨基末端血凝素標(biāo)簽的ER-α(HA-ER-α)的MCF-7細(xì)胞系。因?yàn)镋R-α過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)配體非依賴(lài)性生長(zhǎng)并且還可使配體介導(dǎo)的降解途徑飽和，所以利用UbC和EF1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ER-α表達(dá)，針對(duì)每個(gè)受體產(chǎn)生獨(dú)立的穩(wěn)定細(xì)胞系。UbC啟動(dòng)子由制造商(System Biosciences)報(bào)道以表達(dá)低至中等RNA水平，而EF1啟動(dòng)子表達(dá)高水平(System Biosciences)。如通過(guò)定量蛋白免疫印跡分析所確定的，基于UbC的細(xì)胞系以小于10％內(nèi)源性ER-α的水平表達(dá)HA-ER-α蛋白。在另一方面，基于EF1啟動(dòng)子的細(xì)胞系以比內(nèi)源性蛋白高2至6倍的水平表達(dá)HA-ER-α和突變體。

與其在轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中的活性一致，臨床鑒定的ER-α突變體在MCF-7細(xì)胞中通過(guò)UbC或EF1啟動(dòng)子的表達(dá)賦予細(xì)胞在不存在17β-雌二醇的情況下增殖的能力(表22和26 5)。然而，使用EF1啟動(dòng)子獲得的高水平的野生型ER-α表達(dá)(約為內(nèi)源性蛋白水平的2-3倍)也足以促進(jìn)配體非依賴(lài)性生長(zhǎng)。在激動(dòng)劑模式中，ERM 4-23、4-羥基他莫昔芬和氟維司群通過(guò)任一啟動(dòng)子拮抗穩(wěn)定表達(dá)野生型、E380Q、L536P、L536R、Y537N、Y537S、Y537C和D538G HA-ER-α的細(xì)胞系的增殖(表22和26)。氟維司群和ERM 4-23表現(xiàn)出相似的功效(對(duì)于UbC和EF1-衍生的細(xì)胞系分別為47％至66％和42％至96％抑制)，而4-羥基他莫西芬在所測(cè)試的所有突變上展現(xiàn)出降低的功效。在激動(dòng)劑模式中，所有三種拮抗劑對(duì)UbC HA-ER-α突變型細(xì)胞系展現(xiàn)出高皮摩爾濃度至低納摩爾濃度IC₅₀，且在EF1-衍生的細(xì)胞系中展現(xiàn)出低納摩爾濃度效力(表23和27)。在不存在E2的情況下，UbC野生型HA-ER-α細(xì)胞系沒(méi)有充分增殖以得到準(zhǔn)確的IC₅₀，然而，在EF1-衍生的細(xì)胞系中，與野生型相比，所有拮抗劑均展現(xiàn)出降低的效力(對(duì)于4-羥基他莫昔芬、氟維司群和ERM 4-23分別為8至140倍、2至47倍和0.7至24倍)。當(dāng)以拮抗劑模式進(jìn)行增殖測(cè)定時(shí)，觀察到拮抗劑功效和效力的類(lèi)似觀察(表24、25、28、29)。然而，在17β-雌二醇存在的情況下，在攜帶野生型和突變型HA-ER-α的細(xì)胞系之間拮抗劑效力的差異不如在EF-1激動(dòng)劑測(cè)定中所觀察到的顯著(最大13倍)。

表22孵育5天后ERM 4-23減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(UbC HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言第5天的最大刺激增殖反應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表23ERM 4-23為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(UbC HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表24孵育5天后ERM 4-23減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(UbC HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言第5天的最大刺激增殖反應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表25 ERM 4-23為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(UbC HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表26孵育5天后ERM 4-23減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(EF1HA-ER-α；激動(dòng)劑模式；-E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言第5天的最大刺激增殖反應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表27 ERM 4-23為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(EF1HA-ER-α；拮抗劑模式；-E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。ND＝未確定。

表28孵育5天后ERM 4-23減少穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)(EF1HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

E_max是相對(duì)于第0天而言第5天的最大刺激增殖反應(yīng)。還展示了與媒介物相比的抑制百分比(％)。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表29 ERM 4-23為穩(wěn)定表達(dá)臨床相關(guān)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞的強(qiáng)效增殖拮抗劑(EF1HA-ER-α；拮抗劑模式；+E2)

將用空EF1慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞用作陰性對(duì)照。

數(shù)據(jù)是從2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：ERM 4-23在基于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白和細(xì)胞存活力測(cè)定中抑制臨床相關(guān)ESR1突變E380Q、L536R、L536P、Y537C、Y537N、Y537S和D538G的活性。ERM 4-23將ER依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄報(bào)道蛋白測(cè)定中所有ESR1突變的轉(zhuǎn)錄活性抑制為達(dá)到接近野生型受體所觀察到的水平。在穩(wěn)定表達(dá)ER-α突變體的MCF-7細(xì)胞中，與DMSO對(duì)照相比，ERM 4-23使存活細(xì)胞數(shù)減少了49％-90％。雖然ERM 4-23在這些測(cè)定中展現(xiàn)出納摩爾濃度效力，但與野生型相比，ERM 4-23在突變型ER-α上表現(xiàn)出0.7至24倍的降低的效力。ERM 4-23展現(xiàn)出與4-羥基他莫昔芬和氟維司群類(lèi)似的IC₅₀效力以及與氟維司群類(lèi)似的最大功效(E_max)響應(yīng)。

實(shí)施例7體外細(xì)胞增殖測(cè)定

雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物和化療化合物的功效通過(guò)采用以下方案的細(xì)胞增殖測(cè)定來(lái)測(cè)量(Mendoza et al(2002)Cancer Res.62:5485-5488)。

發(fā)光細(xì)胞存活力測(cè)定是一種基于對(duì)存在的ATP定量而用于確定培養(yǎng)物中存活細(xì)胞數(shù)量的均相方法，這表示代謝活性細(xì)胞的存在。測(cè)定設(shè)計(jì)用于多孔板格式，使其對(duì)于自動(dòng)化高通量篩選(HTS)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性測(cè)定而言是理想的。均相測(cè)定操作涉及將單一試劑(試劑)直接添加至在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中。不需要細(xì)胞清洗、去除培養(yǎng)基或多個(gè)移液步驟。Cell發(fā)光細(xì)胞存活力測(cè)定包括試劑和方案是可商購(gòu)得到的(Promega Corp.,Madison,WI,Technical Bulletin TB288)。

該測(cè)定評(píng)估化合物進(jìn)入細(xì)胞和抑制細(xì)胞增殖的能力。測(cè)定原理基于通過(guò)定量存在于均相測(cè)定中的ATP來(lái)確定存在的存活細(xì)胞的數(shù)目，其中添加Cell試劑導(dǎo)致細(xì)胞裂解并通過(guò)熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)。發(fā)光信號(hào)與存在的ATP的量成比例。

操作：第1天-接種細(xì)胞板(來(lái)自Falcon#353962的384孔黑色、透明底部、微透明、有蓋TC板)，收獲細(xì)胞，以1000個(gè)細(xì)胞/54μl/孔接種細(xì)胞至384孔細(xì)胞板中以用于3天測(cè)定。細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI或DMEM高葡萄糖、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺,P/S。在37℃,5％CO₂孵育O/N(過(guò)夜)。

第2天-向細(xì)胞添加藥物，化合物稀釋?zhuān)珼MSO板(連續(xù)稀釋1:2,9個(gè)點(diǎn))。在96孔板的第二列加入20μl 10mM的化合物。使用來(lái)自Nunc(cat.#249946)的Precision Media Plates 96孔圓底聚丙烯板，跨板(10μl+20μl 100％DMSO)進(jìn)行連續(xù)稀釋1:2共9個(gè)點(diǎn)(1:50稀釋)。向所有孔中添加147μl培養(yǎng)基。使用(Caliper,a Perkin-Elmer Co.)將DMSO板中每個(gè)孔的3μlDMSO+化合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基板上每個(gè)相應(yīng)的孔中。對(duì)于2種藥物組合研究，使用Rapidplate將DMSO板中每個(gè)孔的一種藥物1.5μl DMSO+化合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基板上每個(gè)相應(yīng)的孔中。然后，轉(zhuǎn)移另一種藥物1.5μl至培養(yǎng)基板。

添加藥物至細(xì)胞，細(xì)胞板(1:10稀釋)：直接添加6μl培養(yǎng)基+化合物至細(xì)胞(在細(xì)胞上已經(jīng)有54μl培養(yǎng)基)。在不會(huì)經(jīng)常打開(kāi)的培養(yǎng)箱中在37℃，5％CO₂孵育3天。

第5天-鋪板，在室溫解凍Cell Titer Glo緩沖液：從37℃移去細(xì)胞板并平衡至室溫約30分鐘。添加Cell緩沖液至Cell底物(瓶到瓶)。向每個(gè)孔的細(xì)胞中添加30μl CellReagent(Promega cat.#G7572)。在板振蕩器上放置約30分鐘。在Analyst HT板閱讀器上讀取發(fā)光(每孔半秒)。

細(xì)胞存活力測(cè)定和組合測(cè)定：歷經(jīng)16小時(shí)將細(xì)胞以1000-2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在384孔板中。在第二天，在96孔板中在DMSO中制備9個(gè)連續(xù)稀釋的1:2化合物稀釋液。使用自動(dòng)化設(shè)備(Zymark Corp.,Hopkinton,MA)將化合物進(jìn)一步稀釋至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后將稀釋的化合物一式四份添加至384孔細(xì)胞板的孔中，并在37℃和5％CO₂下孵育。4天后，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用Cell(Promega)通過(guò)發(fā)光測(cè)量存活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目，并在Wallac Multilabel(PerkinElmer,Foster City)上讀取。使用4.0software(GraphPad,San Diego)計(jì)算EC₅₀值。組合測(cè)定中的藥物以4X EC₅₀濃度開(kāi)始給藥。如果在藥物的EC₅₀>2.5μM的情況下，使用的最高濃度為10μM。在所有測(cè)定中同時(shí)添加或分隔4小時(shí)添加(一個(gè)接一個(gè))雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物和化學(xué)治療劑。

另外的示例性體外細(xì)胞增殖測(cè)定包括以下步驟：

1.將培養(yǎng)基中含有約10⁴個(gè)細(xì)胞(對(duì)于細(xì)胞系和腫瘤類(lèi)型參見(jiàn)表3)的100μl細(xì)胞培養(yǎng)物的等分試樣沉積在384孔不透明壁板的每個(gè)孔中。

2.準(zhǔn)備含有培養(yǎng)基和無(wú)細(xì)胞的對(duì)照孔。

3.將化合物添加至實(shí)驗(yàn)孔中并孵育3-5天。

4.將板平衡至室溫約30分鐘。

5.添加與每個(gè)孔中存在的細(xì)胞培養(yǎng)基的體積相等的體積的試劑。

6.將內(nèi)容物在定軌振蕩器上混合2分鐘以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。

7.將板在室溫孵育10分鐘以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)。

8.記錄發(fā)光并在圖中報(bào)告為RLU＝相對(duì)發(fā)光單位。

9.使用Chou和Talalay聯(lián)合方法并使用軟件(Biosoft,Cambridge,UK)的劑量-效應(yīng)分析進(jìn)行分析，以獲得聯(lián)合指數(shù)(Combination Index)。

可選擇地，將細(xì)胞以最佳密度接種在96孔板中并在測(cè)試化合物存在的情況下孵育4天。隨后將Alamar Blue^TM添加至測(cè)定培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞孵育6小時(shí)，然后在544nm激發(fā)、590nm發(fā)射讀取。使用S形劑量響應(yīng)曲線擬合計(jì)算EC₅₀值。

可選擇地，使用Cell試劑(Promega Inc.,Madison,WI)在藥物治療48小時(shí)后分析增殖/存活力。在所有存活力測(cè)定中DMSO處理用作對(duì)照。使用XL擬合軟件(IDBS,Alameda,CA)計(jì)算IC₅₀值。

細(xì)胞系獲自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA)或DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,DE)。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、2mM L-谷氨酰胺和100mg/ml鏈霉素(Life Technology,Grand Island,NY)的RPMI 1640培養(yǎng)基中在37℃在5％CO₂培養(yǎng)。

實(shí)施例8體內(nèi)小鼠腫瘤異種移植物功效

小鼠：雌性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(Fox ChaseC.B-17/IcrHsd,Harlan)或裸鼠(Taconic Farms,Harlan)為8至9周齡，在研究的第0天的BW范圍為15.1至21.4克。對(duì)動(dòng)物隨意飼喂水(反滲透，1ppm Cl)以及由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纖維組成的NIH 31改良和輻照實(shí)驗(yàn)室飲食(Modified and Irradiated Lab)。將小鼠安置在21-22℃(70-72°F)和40-60％濕度、以12小時(shí)光照循環(huán)的靜態(tài)微隔離器(static microisolator)中經(jīng)輻照的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物墊料(Laboratory Animal Bedding)上。PRC特別遵守“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)”關(guān)于約束、飼養(yǎng)、手術(shù)操作、飼料和流體調(diào)節(jié)以及獸醫(yī)護(hù)理的建議。PRC的動(dòng)物護(hù)理和使用計(jì)劃由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理國(guó)際評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)(the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)(AAALAC)認(rèn)證，確保遵守關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。

腫瘤植入：用癌細(xì)胞啟動(dòng)異種移植。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/mL青霉素、100μg/mL硫酸鏈霉素和25μg/mL慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在指數(shù)生長(zhǎng)期間收集細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞系的倍增時(shí)間以5x 10⁶或10x 10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重新混懸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。將腫瘤細(xì)胞皮下植入右脅腹，并且當(dāng)平均大小接近100至150mm³的目標(biāo)范圍時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。在腫瘤植入后21天(指定為研究的第0天)，將小鼠置于四組中，每組由10只小鼠組成，所述小鼠具有75-172mm³的單個(gè)腫瘤體積和120-121mm³的組平均腫瘤體積(參見(jiàn)附錄A)。使用下式計(jì)算體積：

腫瘤體積(mm³)＝(w²x l)/2，其中w＝腫瘤的寬度且l＝腫瘤的長(zhǎng)度(以mm為單位)。假設(shè)1mg等于1mm³的腫瘤體積，可估計(jì)腫瘤重量。

治療劑：雌激素受體調(diào)節(jié)劑化合物和化學(xué)治療劑通常由干粉制備，在室溫儲(chǔ)存，并且免受光照。在去離子水(“媒介物”)中的0.5％甲基纖維素:0.2％吐溫80中每周制備藥物劑量并在4℃儲(chǔ)存。在給藥的每一天通過(guò)用無(wú)菌鹽水(0.9％NaCl)稀釋儲(chǔ)備液的等分試樣來(lái)制備化合物的劑量。配制所有劑量以每20克體重0.2mL的體積(10mL/kg)遞送所述mg/kg劑量。

治療：將所有劑量按比例調(diào)整至單個(gè)動(dòng)物的體重并通過(guò)各圖中所示的途徑提供。

終末點(diǎn)：以2維(長(zhǎng)度和寬度)使用Ultra Cal IV卡尺(Model 54 10 111；Fred V.Fowler Company)如下測(cè)量腫瘤體積：腫瘤體積(mm³)＝(長(zhǎng)度x寬度²)×0.5并使用Excel version 11.2(Microsoft Corporation)進(jìn)行分析。使用線性混合效應(yīng)(LME)建模方法分析來(lái)自同一動(dòng)物的腫瘤體積隨時(shí)間的重復(fù)測(cè)量(Pinheiro J,et al.nlme:linear and nonlinear mixed effects models.R package version 3.1 92.2009；Tan N,et al.Clin.Cancer Res.2011；17(6):1394–1404)。該方法解決了由于在研究結(jié)束之前動(dòng)物的任何非治療相關(guān)的死亡所導(dǎo)致的重復(fù)測(cè)量和適度退出(dropout)。使用三次回歸樣條(cubic regression spline)在每個(gè)劑量水平將非線性分布擬合為log2腫瘤體積的時(shí)程。然后，這些非線性分布與混合模型內(nèi)的劑量相關(guān)。使用下式將作為媒介物對(duì)照的百分比的腫瘤生長(zhǎng)抑制(％TGI)計(jì)算為針對(duì)相應(yīng)劑量組/天相對(duì)于媒介物的擬合曲線下面積(AUC)的百分比：％TGI＝100×(1-AUC_dose/AUC_veh)。使用該式，TGI值為100％表示腫瘤停滯，TGI值＞1％但＜100％表示腫瘤生長(zhǎng)延遲，且TGI值>100％表示腫瘤消退。將動(dòng)物的部分響應(yīng)(PR)定義為腫瘤消退＞50％的起始腫瘤體積但＜100％的起始腫瘤體積。將完全響應(yīng)(CR)定義為在研究過(guò)程的任一天100％腫瘤消退(即，無(wú)可測(cè)量的腫瘤)。

毒性：在研究的前五天每天稱(chēng)重動(dòng)物，然后每周兩次稱(chēng)重。使用AdventurerAV812量表(Ohaus Corporation)測(cè)量動(dòng)物體重。重量變化百分比計(jì)算如下：體重變化(％)＝[(重量_新的一天-重量_第0天)/重量_第0天]×100。頻繁觀察小鼠并在觀察時(shí)記錄任何不良的、治療相關(guān)的副作用的明顯體征和臨床毒性體征。將可接受的毒性定義為在研究期間小于20％的組平均體重(BW)減輕，并且在10只治療的動(dòng)物中有不超過(guò)一只治療相關(guān)的(TR)死亡。導(dǎo)致更大毒性的任何給藥方案被認(rèn)為高于最大耐受劑量(MTD)。若可歸因于由臨床體征和/或尸體剖檢所證明的治療副作用，則將死亡歸類(lèi)為T(mén)R，或者若歸因于給藥期期間或最后一次給藥的10天內(nèi)的未知原因，則也可將死亡歸類(lèi)為T(mén)R。若沒(méi)有證據(jù)表明死亡與治療副作用相關(guān)，則將死亡歸類(lèi)為NTR。

盡管為了清楚理解的目的通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但是描述和實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過(guò)引用的方式將本申請(qǐng)引用的所有專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容明確地整體并入本申請(qǐng)。本申請(qǐng)所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員所建議的各種修改或變化將被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 賽拉根醫(yī)藥股份有限公司(SERAGON PHARMACEUTICALS, INC.)

<120> 調(diào)節(jié)雌激素受體突變體的方法和組合物

<130> 45202-739.101

<140> 待確定

<141> 2014-03-13

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atgaccatga ccctccacac caaagcatct gggatggccc tactgcatca gatccaaggg 60

aacgagctgg agcccctgaa ccgtccgcag ctcaagatcc ccctggagcg gcccctgggc 120

gaggtgtacc tggacagcag caagcccgcc gtgtacaact accccgaggg cgccgcctac 180

gagttcaacg ccgcggccgc cgccaacgcg caggtctacg gtcagaccgg cctcccctac 240

ggccccgggt ctgaggctgc ggcgttcggc tccaacggcc tggggggttt ccccccactc 300

aacagcgtgt ctccgagccc gctgatgcta ctgcacccgc cgccgcagct gtcgcctttc 360

ctgcagcccc acggccagca ggtgccctac tacctggaga acgagcccag cggctacacg 420

gtgcgcgagg ccggcccgcc ggcattctac aggccaaatt cagataatcg acgccagggt 480

ggcagagaaa gattggccag taccaatgac aagggaagta tggctatgga atctgccaag 540

gagactcgct actgtgcagt gtgcaatgac tatgcttcag gctaccatta tggagtctgg 600

tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660

tgtccagcca ccaaccagtg caccattgat aaaaacagga ggaagagctg ccaggcctgc 720

cggctccgta aatgctacga agtgggaatg atgaaaggtg ggatacgaaa agaccgaaga 780

ggagggagaa tgttgaaaca caagcgccag agagatgatg gggagggcag gggtgaagtg 840

gggtctgctg gagacatgag agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc 900

tctaagaaga acagcctggc cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg 960

gatgctgagc ccccgatact ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct 1020

tcgatgatgg gcttactgac caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg 1080

gcgaagaggg tgccaggctt tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa 1140

tgtgcctggc tagagatcct gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccaggg 1200

aagctactgt ttgctcctaa cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc 1260

atggtggaga tcttcgacat gctgctggct acatcatctc ggttccgcat gatgaatctg 1320

cagggagagg agtttgtgtg cctcaaatct attattttgc ttaattctgg agtgtacaca 1380

tttctgtcca gcaccctgaa gtctctggaa gagaaggacc atatccaccg agtcctggac 1440

aagatcacag acactttgat ccacctgatg gccaaggcag gcctgaccct gcagcagcag 1500

caccagcggc tggcccagct cctcctcatc ctctcccaca tcaggcacat gagtaacaaa 1560

ggcatggagc atctgtacag catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctcta tgacctgctg 1620

ctggagatgc tggacgccca ccgcctacat gcgcccacta gccgtggagg ggcatccgtg 1680

gaggagacgg accaaagcca cttggccact gcgggctcta cttcatcgca ttccttgcaa 1740

aagtattaca tcacggggga ggcagagggt ttccctgcca cggtctga 1788

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His

1 5 10 15

Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys

20 25 30

Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys

35 40 45

Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr

65 70 75 80

Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly

85 90 95

Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His

100 105 110

Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val

115 120 125

Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala

130 135 140

Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly

145 150 155 160

Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met

165 170 175

Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala

180 185 190

Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe

195 200 205

Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr

210 215 220

Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys

225 230 235 240

Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg

245 250 255

Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp

260 265 270

Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala

275 280 285

Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn

290 295 300

Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu

305 310 315 320

Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro

325 330 335

Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg

340 345 350

Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val

355 360 365

Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu

370 375 380

Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly

385 390 395 400

Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys

405 410 415

Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser

420 425 430

Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu

435 440 445

Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser

450 455 460

Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp

465 470 475 480

Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr

485 490 495

Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser

500 505 510

His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met

515 520 525

Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu

530 535 540

Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val

545 550 555 560

Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser

565 570 575

His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro

580 585 590

Ala Thr Val

595