一種用于分離原代呼吸道上皮細胞的雙材質(zhì)中空套管的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在體分離原代呼吸道上皮細胞的工具，具體涉及一種用于分離原代呼吸道上皮細胞的雙材質(zhì)中空套管。其特征在于由不同管徑的硅膠管(管徑細、強度高)和鐵氟龍中空管(管徑粗、強度小、韌性大)通過硅膠膠水粘合而成。
【專利說明】一種用于分離原代呼吸道上皮細胞的雙材質(zhì)中空套管

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學儀器領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于分離原代呼吸道上皮細胞的雙材質(zhì)中空套管。

【背景技術(shù)】
[0002]呼吸道上皮細胞是呼吸系統(tǒng)與外界接觸的第一道天然屏障，其結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)是呼吸系統(tǒng)維持正常換氣功能和防御功能的細胞基礎(chǔ)。呼吸道上皮細胞附著于基底膜生長，共同構(gòu)成呼吸道的假復層柱狀纖毛上皮，其表面的纖毛有節(jié)律地向咽部擺動，在機體排除呼吸道刺激性異物的過程中發(fā)揮了重要作用。
[0003]實驗動物的原代呼吸道上皮細胞作為人呼吸道上皮細胞的實驗?zāi)Ｐ停瑢τ谂R床和實驗室工作具有不可取代的借鑒作用。呼吸道上皮細胞分離培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善必將對以呼吸系統(tǒng)研宄為基礎(chǔ)的病毒學、病理學和毒理學、生物化學、藥代動力學、發(fā)育生物學，甚至臨床治療與應(yīng)用產(chǎn)生推動作用。
[0004]目前，國內(nèi)外分離實驗用動物大氣道原代呼吸道上皮細胞大多采用縱向剪開氣管，直接浸入含鏈酶蛋白酶的試管中，4°C酶解18-24小時，再離心酶解液(離心力123g)，最后收集細胞團的方法來獲取原代呼吸道上皮細胞。然而，這種方法獲取的細胞數(shù)較少、活性較差，最為重要的是雜細胞過多，對呼吸道疾病的細胞學研宄產(chǎn)生限制。因此，我們總結(jié)實驗中的經(jīng)驗，開發(fā)出基于氣管插管的分離大氣道上皮細胞的方法。但是，在該方法的操作過程中存在以下問題:若選用的材質(zhì)強度太大而彈性小，導致針頭插入欠緊，且折返、動脈夾夾持困難，容易造成鏈霉蛋白酶外漏；若選取的材質(zhì)強度小而彈性大，又將導致手術(shù)線結(jié)扎時，不宜扎緊，也會造成鏈霉蛋白酶外漏等。目前雖已有多種氣管插管方法應(yīng)用于動物體外實驗中，但這些方法不但技術(shù)操作復雜且需要特殊設(shè)備，而且往往因鏈霉蛋白酶外漏導致細胞消化不充分，從而影響整個實驗的成敗。于是我們針對上述問題開發(fā)出雙材質(zhì)中空套管。此套管選取兩種不同特性、材質(zhì)的中空管組成套管，分別滿足兩端不同需要，以達到防止鏈霉蛋白酶外漏并有效減少鏈霉蛋白酶用量的效果，從而減少酶解液對游離呼吸道上皮細胞的損傷作用，在保證分離的呼吸道上皮細胞活性的基礎(chǔ)上，大幅增加細胞分離數(shù)量。本發(fā)明通過運用鐵氟龍中空管、GA-1073硅膠管和文錦超能380硅膠膠水實現(xiàn)這一構(gòu)想。
[0005]GA-1073硅膠管強度大(硬度70土OT)，且生物相容性較好。鐵氟龍管，又叫聚四氟乙稀(Polytetrafluoroethene，PTFE)管，是采用PTFE材料制成，具有強度小(硬度50-5?)、韌性大的特點，可塑性強。文錦超能380硅膠膠水化學成份為氰基丙烯酸酯，目前醫(yī)用氰基丙烯酸酯粘合劑已在創(chuàng)傷骨科中廣泛應(yīng)用，無生物毒性。本套管即利用GA-1073硅膠管強度大不易變形，即在手術(shù)線結(jié)扎時不易坍陷的特點，通過選取適當管徑的GA-1073硅膠管，在減少對氣管損傷的同時，更便于插入動物氣管，手術(shù)線結(jié)扎緊密；又利用鐵氟龍中空管強度小和韌性大的特點，既便于連接注射器，又在后期動脈夾封閉管腔時便于折返。文錦超能380硅膠膠水是以高分子聚合物為主體的溶劑型產(chǎn)品，粘接強度高、抗剪切。此雙材質(zhì)中空套管不僅可以重復使用，而且在保證分離的呼吸道上皮細胞活性的基礎(chǔ)上，大幅增加細胞分離數(shù)量。
[0006]目前，市售的原代呼吸道上皮細胞價格昂貴，且多數(shù)都已喪失纖毛定向擺動的在體生理功能，活性較差。因此，需要更為便利且快捷的呼吸道上皮細胞分離設(shè)備。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及一種便于進行原代呼吸道上皮細胞分離的雙材質(zhì)中空套管。所述雙材質(zhì)套管能夠保證實驗動物氣管插管的成功率，并且確保由注射器、雙材質(zhì)中空套管和氣管所組成的管道系統(tǒng)的通暢性和密閉性，防止此管道系統(tǒng)在培養(yǎng)基中浸泡、酶解的過程中出現(xiàn)酶解液滲漏，在保證鏈霉蛋白酶與呼吸道上皮細胞的接觸和作用的同時，有效減少鏈霉蛋白酶的用量，從而降低酶解液對游離呼吸道上皮細胞的損傷。以獲取更多數(shù)目且活性更好的原代呼吸道上皮細胞。
[0008]所述的雙材質(zhì)中空套管由，
[0009](I)管徑細、強度高的硅膠管構(gòu)成的插入氣管的內(nèi)層套管，和
[0010](2)管徑粗、韌性大、可對折并通過止血鉗封閉的鐵氟龍中空管構(gòu)成的外層套管套接而成；
[0011]并且硅膠管的外徑等于鐵氟龍中空管的內(nèi)徑。
[0012]所述的套接為通過可用于外科手術(shù)的醫(yī)用粘合劑粘合，所述的醫(yī)用粘合劑優(yōu)選為文錦超能380硅膠粘硅膠膠水。
[0013]所述的硅膠管優(yōu)選為GA-1073硅膠管，強度大不易變形，在手術(shù)線結(jié)扎時不易坍陷，通過選取適當管徑的GA-1073硅膠管，在減少對氣管損傷的同時，能更便于插入動物氣管，且手術(shù)線結(jié)扎時不塌陷從而保證了鏈霉蛋白酶消化液的順利流入氣管腔；
[0014]所述的鐵氟龍中空管強度小韌性大的，既便于連接注射器，又在后期封閉管腔時便于折疊并通過止血鉗夾緊密封。
[0015]此套管不僅可以重復使用，而且能保證實驗動物氣管插管的成功率，并且確保由注射器、雙材質(zhì)中空套管和實驗動物氣管所組成的管道的通暢性和密閉性，減少鏈霉蛋白酶的用量，有效提升分離得到的呼吸道上皮細胞的活性，增加呼吸道上皮細胞的分離數(shù)量。
[0016]所述的硅膠管和鐵氟龍中空管的口徑大小和長度可以根據(jù)實驗動物模型來合理選擇，以便于插管操作。
[0017]所述的硅膠管套接與鐵氟龍中空管內(nèi)的長度取決于分離原代呼吸道上皮細胞的模型動物種類和兩種材質(zhì)管的長度，優(yōu)選為硅膠管長度的四分之一。
[0018]本發(fā)明為有關(guān)呼吸道上皮細胞的研宄、教學、醫(yī)學應(yīng)用提供了有利的物質(zhì)條件，聯(lián)合應(yīng)用我們已授權(quán)的專利(ZL 201110440894.2)中所述的培養(yǎng)基，能有效增加分離得到的呼吸道上皮細胞的數(shù)量和活力，并保留呼吸道上皮細胞的纖毛定向擺動的在體生理功能。
[0019]本發(fā)明使得原代呼吸道上皮細胞分離操作簡單易行，可重復性強，便于推廣應(yīng)用，具有廣泛的推廣價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.雙材質(zhì)中空套管的立體圖(以小鼠專用雙材質(zhì)中空套管為例)。(比例尺5:I)
[0021]圖2.雙材質(zhì)中空套管的剖視圖。(比例尺5:1)
[0022]圖3.雙材質(zhì)中空套管沿線A-A’的剖視圖。(比例尺50:1)
[0023]圖4.雙材質(zhì)中空套管連接游離BALB/c小鼠氣管后的實物圖，1.一號手術(shù)線；
2.小鼠氣管；3.GA-1073硅膠管；4.鐵氟龍中空管。
[0024]圖5.注入鏈酶蛋白前雙材質(zhì)中空套管連接氣管實物圖，1.小鼠氣管；2.GA-1073硅膠管；3.鐵氟龍中空管。
[0025]圖6.注入鏈酶蛋白后氣管氣球樣改變的實物圖，1.小鼠氣管；2.GA-1073硅膠管；
3.鐵氟龍中空管。
[0026]圖7.倒置顯微鏡下的小鼠原代呼吸道上皮細胞

【具體實施方式】
[0027]以分離小鼠呼吸道上皮細胞專用雙材質(zhì)中空套管為例
[0028]實施例1.雙材質(zhì)套管的制作
[0029](I)取兩端分別為45度斜末端和平末端，內(nèi)徑0.6mm，外徑0.8mm的GA-1073娃膠管;
[0030](2)取20mm和兩端均為平末端，內(nèi)徑0.8mm，外徑1.0mm的鐵氟龍中空管25mm，
[0031](3)將GA-1073硅膠管的平末端涂上10微升文錦超能380硅膠膠水插入鐵氟龍中空管中，插入5_后固定15s即得所述雙材質(zhì)套管。
[0032]圖1所示為本發(fā)明所述雙材質(zhì)中空套管的立體圖(以小鼠專用雙材質(zhì)中空套管為例)，其中
[0033]I為鐵氟龍中空管，長度:25mm
[0034]2 為 GA-1073 硅膠管，長度:20_
[0035]BB’為鐵氟龍中空管外徑:1.0mm
[0036]CC’為GA-1073硅膠管插入鐵氟龍中空管長度5mm
[0037]DD’ 為 GA-1073 硅膠管內(nèi)徑:0.6mm
[0038]EE’為鐵氟龍中空管內(nèi)徑，GA-1073硅膠管外徑:0.8mm
[0039]實施例2.小鼠氣管的分離
[0040](I)取BALB/c小鼠經(jīng)斷頸處死，翹起頭部，將其胸腹部酒精浸泡消毒30s，注意保護口腔和鼻道，免受酒精刺激。將其固定于手術(shù)臺上，無菌條件下延腹白線剪開皮膚，暴露腹主動脈，切開放血至流盡，其目的在于避免分離呼吸道上皮細胞時混入過多紅細胞；
[0041](2)鈍性分離氣管，暴露氣管后，并將其充分游離；
[0042](3)穿雙股I號手術(shù)線100mm，在氣管環(huán)狀軟骨下方5mm處剪一小缺口，插入雙材質(zhì)套管GA-1073娃膠管45度斜末端，插入氣管一半約5mm深，用I號手術(shù)線在氣管外側(cè)打一緊結(jié)，將硅膠套管固定在氣管內(nèi)；
[0043](4)通過鐵氟龍中空管連接Iml規(guī)格注射器，向?qū)Ч軆?nèi)注射PBS緩沖液盥洗氣管，并觀察肺有無缺損；
[0044](5)在氣管下游硅膠管未深入的分叉處用手術(shù)線再打一緊結(jié)封閉氣管末端，去除氣管周圍多余組織及手術(shù)線，游離氣管。
[0045]實施例3.氣管組織的消化和紅細胞的去除
[0046](I)通過雙材質(zhì)套管向套管尖端固定的氣管內(nèi)注入少許4°C預冷的0.05%鏈霉蛋白酶，灌洗氣管內(nèi)壁將盥洗的PBS去除；
[0047](2)將0.05%鏈霉蛋白酶注滿整段氣管，使氣管稍呈氣球樣膨脹，對折的鐵氟龍中空管部分后用30_動脈夾夾住，封閉整個氣管-套管的組合；
[0048](3)將整段氣管固定浸潤在加有青霉素的MEM中，消化8h ；
[0049](4)剪斷下端氣管，收集消化液，并用Iml注射器吸取PBS沖洗氣管；
[0050](5)收集沖洗液約1.5ml (收集液+PBS沖洗氣管液體)，合并后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，500X g離心4min去除上清液；
[0051](6)添加紅細胞裂解液(Sigma R7757-100ML) 150 μ 1，Imin溫和混勻后，PBS稀釋至1.5ml，500g離心6min ;去除上清液，然后用適量完全培養(yǎng)基充分重懸細胞，取10 μ I用于細胞計數(shù)，經(jīng)計數(shù)，每只小鼠可提取細胞數(shù)目約5*105個細胞。
[0052]實施例4.呼吸道上皮細胞的原代培養(yǎng)及鑒定
[0053]呼吸道上皮細胞培養(yǎng)
[0054](I)以24孔板為例，每孔500 μ I完全培養(yǎng)基培養(yǎng)體系(培養(yǎng)基見專利CN102505005A)，加入適量細胞(具體細胞數(shù)量根據(jù)實際實驗要求確定)，注意混勻，避免細胞成堆無法展開；
[0055](2)十字搖勻后，在實驗臺上放置30min后，轉(zhuǎn)移至孵育箱中，每天進行換液處理(相同的體系)，待細胞貼壁后可即可開展后續(xù)實驗。
[0056]呼吸道上皮細胞形態(tài)鑒定
[0057](I)剛分離下來的氣道上皮細胞呈圓形，有些成小團或成片，一般在24h左右可見細胞貼壁并完全展開，鏡下觀察，純度約為95%，僅有少量的成纖維細胞混雜其中；
[0058](2)培養(yǎng)5d后細胞融合度達到較高水平即形成典型的細胞島(圖7)，并可以看到快速的纖毛擺動，這是呼吸道上皮細胞所獨有的生物學行為。
[0059]由于分離的細胞部位來源于氣管內(nèi)壁，該部位唯一有節(jié)律性運動的細胞只有呼吸道上皮細胞，同時，這種規(guī)則的擺動又是呼吸道上皮細胞的典型特征，故以此特征作為該細胞的標志，且說明細胞生長良好，其生理功能接近在體水平。
【權(quán)利要求】
1.一種進行原代呼吸道上皮細胞分離的雙材質(zhì)中空套管，其特征在于，所述的雙材質(zhì)中空套管由， (1)管徑細、強度高的硅膠管構(gòu)成的插入氣管的內(nèi)層套管，和 (2)管徑粗、韌性大、可對折并通過止血鉗封閉的鐵氟龍中空管構(gòu)成的外層套管套接而成； 并且硅膠管的外徑等于鐵氟龍中空管的內(nèi)徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙材質(zhì)中空套管，其特征在于，所述的套接為通過可用于外科手術(shù)的醫(yī)用粘合劑粘合，所述的醫(yī)用粘合劑優(yōu)選為文錦超能380硅膠粘硅膠膠水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙材質(zhì)中空套管，其特征在于，所述的硅膠管優(yōu)選為GA-1073硅膠管。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙材質(zhì)中空套管，其特征在于，所述的硅膠管套接與鐵氟龍中空管內(nèi)的長度取決于分離原代呼吸道上皮細胞的模型動物種類和兩種材質(zhì)管的長度，優(yōu)選為娃膠管長度的四分之一。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙材質(zhì)中空套管，其特征在于:所述的中空套管用于小鼠原代呼吸道上皮細胞分離，GA-1073硅膠管的外徑等于鐵氟龍管的內(nèi)徑，為小鼠氣管平均內(nèi)徑.0.8mm，GA-1073娃膠管長度為20mm，鐵氟龍管的長度為25mm。
【文檔編號】A61B10/02GK104473664SQ201410823161
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月24日
【發(fā)明者】李煜生, 任杰 申請人:南方醫(yī)科大學