一種含有miRNA-324的藥物組合物及其用途
【專利摘要】一種含有miRNA-324的藥物組合物及其用途，藥物組合物包括有效劑量的miRNA-324及其藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料；所述載體為殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體或納米顆粒，通過口服或注射，藥物組合物的核苷酸序列為：5’-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3’；用于治療心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。本發(fā)明的藥物組合物制備工藝簡(jiǎn)單，藥效明顯，使用方便，治療環(huán)境友好。
【專利說明】一種含有mi RNA-324的藥物組合物及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種內(nèi)源性非編碼小RNAs的新藥及其用途， 尤其是一種含有miRNA-324的藥物組合物及其預(yù)防或治療心臟疾病的用途。

【背景技術(shù)】：
[0002] 心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍 內(nèi)每年有一千七百多萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和；隨著 人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過癌 癥成為第一大致死原因。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部近期公布的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，我國(guó)18歲及以 上居民高血壓患病率為18. 8%，估計(jì)全國(guó)患病人數(shù)1. 6億多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗 死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相關(guān)心臟疾病的病人達(dá)幾千萬。目前關(guān)于心臟疾病發(fā)病機(jī) 理尚不完全清楚，心臟疾病的預(yù)防、診斷和治療尚不能達(dá)到讓人滿意的效果，急需開發(fā)新的 技術(shù)、方法用于心臟病的診斷、防治。miRNA是新近研宄發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分 子，許多研宄表明miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表 達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物具 有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。單一的miRNA可以同時(shí)作用于多個(gè)靶基因的mRNA的表達(dá)，藥物作 用于一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)參與心臟發(fā)病基因的表達(dá)，影響多個(gè)信號(hào)通路，從整體上達(dá) 到治療疾病的目的。由于miRNA在心臟病理狀態(tài)下表達(dá)水平不同，因此可以通過檢測(cè)miRNA 的表達(dá)水平來預(yù)測(cè)診斷疾病。
[0003] 細(xì)胞凋亡（apoptosis)又稱程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件 下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程，它是一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、由基因控制及一 系列酶參與的過程，對(duì)正常胚胎發(fā)育，維持細(xì)胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保 證多細(xì)胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下， 如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡；由于成熟的心肌細(xì) 胞不能分裂增殖，心肌細(xì)胞過度凋亡必然會(huì)使心肌細(xì)胞數(shù)目減少，這一點(diǎn)可能是一些心臟 疾病發(fā)病的機(jī)理。目前研宄發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過調(diào)控凋亡相關(guān)靶蛋白的表達(dá)參與細(xì)胞凋亡 的發(fā)生，這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的，所以尋找心臟中特異表達(dá)的、參與心肌細(xì) 胞凋亡的miRNA，闡明其作用機(jī)理，對(duì)于開發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、治療具有 及其重要的意義和應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，尋求提供一種含有miRNA-324的藥 物組合物及其預(yù)防或治療心臟疾病的用途。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的含有miRNA-324的藥物組合物包 括miRNA-324和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料；所用的miRNA-324的序列為 5' -CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3 ;所述載體為殼聚糖、膽固醇、納米顆粒和脂質(zhì)體中的一種 或多種；所述病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種，優(yōu)選 的，本發(fā)明中選擇的病毒載體為腺病毒載體；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水 中的一種或多種。
[0006] 本發(fā)明中所述的藥物組合物中過表達(dá)miRNA-324的病毒載體感染滴度為1016PFU。
[0007] 藥物劑型為口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種，優(yōu)選的為注射 用小水針劑或注射用凍干粉針。
[0008] 本發(fā)明的含有miRNA-324的藥物組合物，用于治療心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌 肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。
[0009] 本發(fā)明涉及的含有miRNA-324的核苷酸序列的藥物組合物在心臟中高表達(dá)、 心肌缺血損傷和缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中，miRNA-324表達(dá)顯著下調(diào)；通過構(gòu)建 miRNA-324過表達(dá)腺病毒或miRNA-324轉(zhuǎn)基因小鼠加強(qiáng)miRNA-324的表達(dá)能夠抑制心肌 細(xì)胞凋亡及心肌缺血損傷，心肌梗死面積減少；心肌缺血再灌注損傷后，過表達(dá)miRNA-324 能夠減輕缺血再灌注損傷所致的凋亡，減小心肌梗死面積，過表達(dá)miRNA-324還能改善缺 血再灌注損傷所致的心功能的損傷，抑制內(nèi)源性的miRNA-324能夠加重缺血再灌注損傷； miRNA-324通過抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心臟具有保護(hù)作用，miRNA-324對(duì)許多心臟疾病具有 潛在的預(yù)防和治療價(jià)值；給予miRNA-324反義核苷酸抑制miRNA-324的表達(dá)則能夠誘導(dǎo)心 肌細(xì)胞凋亡，心肌缺血損傷會(huì)加重。
[0010] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的藥物組合物與現(xiàn)有技術(shù)相比，心肌細(xì)胞缺氧或心肌缺血損傷過程 miRNA-324表達(dá)顯著下調(diào)，miRNA-324的下調(diào)能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生；miRNA-324在缺 血再灌注動(dòng)物模型的心肌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miRNA-324的心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠， 可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，心肌梗死面積減少，心功能顯著改善。通過構(gòu)建能夠過表達(dá) miRNA-324的腺病毒從冠狀動(dòng)脈注射入小鼠心臟，發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷程度明顯被抑制，動(dòng)物 模型證明miRNA-324對(duì)缺血性心臟病的治療作用，將miRNA-324與載體包裝形成藥物分子， 通過口服或注射用于防治心臟疾病和改善心臟功能，阻止心肌纖維化及心肌重構(gòu)的發(fā)生； 其藥物組合物制備工藝簡(jiǎn)單，藥效明顯，使用方便，治療環(huán)境友好。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1為心肌缺血損傷及低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中miRNA-324表達(dá)水平的變 化的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為原代心肌細(xì)胞缺氧處理miRNA-324表達(dá)水平的試驗(yàn)結(jié)果示 意圖；B為小鼠心肌缺血miRNA-324表達(dá)水平的試驗(yàn)結(jié)果示意圖。
[0012] 圖2為miRNA-324抑制心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為原代心肌細(xì)胞 感染miRNA-324腺病毒miRNA-324過量表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖中B為 原代心肌細(xì)胞感染miRNA-324腺病毒miRNA-324過量表達(dá)對(duì)細(xì)胞色素 C的釋放作用實(shí)驗(yàn)結(jié) 果示意圖。
[0013] 圖3為miRNA-324過表達(dá)抑制心肌缺血損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為小鼠經(jīng) 注射冠動(dòng)脈miRNA-324病毒后，其心臟的左心室面積（LV)所占的百分比和危險(xiǎn)區(qū)總面積 (AAR)所占的百分比實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖中B為小鼠經(jīng)注射冠動(dòng)脈miRNA-324模擬物病毒 后對(duì)缺血再灌注手術(shù)（I/R)引起的心肌凋亡的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
[0014] 圖4為小鼠靜脈注射miRNA-324后再進(jìn)行心肌缺血再灌注后24小時(shí)與野生型小 鼠再灌24小時(shí)后的心功能狀況比較，圖中A為miRNA-324過量表達(dá)對(duì)小鼠的左室舒張末 內(nèi)徑（LVIDd)的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖中B為miRNA-324過量表達(dá)對(duì)左室收縮末內(nèi)徑 (LVIDs)的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖中C為miRNA-324過量表達(dá)對(duì)短軸截短率（FS)的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
[0015] 圖5為小鼠靜脈注射miRNA-324抑制劑抑制內(nèi)源性miRNA-324及抑制劑陰性對(duì) 照后缺血再灌注所致的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為心肌細(xì)胞凋亡的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意 圖，圖中B為心肌梗死面積的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】：
[0016] 下面結(jié)合附圖并通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，其實(shí)驗(yàn)小鼠均購(gòu)自北京醫(yī)科大 學(xué)，品系均為C57。
[0017] 實(shí)施例1、
[0018] 心肌缺血及心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中miRNA-324表達(dá)情況檢 測(cè)，本實(shí)施例對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用本?shí)驗(yàn)室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠 原代心肌細(xì)胞（大鼠乳鼠購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)，大鼠品系為Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代 心肌細(xì)胞的制備可參見以下文獻(xiàn)：W. -Q. Tan, etal, Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ； 283(44) :29730-29739)，低氧培養(yǎng)箱（氧濃度低于1% )培養(yǎng)不同時(shí)間，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-324的表達(dá)水平，如圖IA所示，miRNA-324表達(dá)水平在低氧處理 IOmin?180min內(nèi)顯著下調(diào)。
[0019] 本實(shí)施例以假手術(shù)處理的大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞作為對(duì)照組，采用結(jié)扎大鼠冠狀 動(dòng)脈建立心肌缺血模型，缺血不同時(shí)間取心臟缺血區(qū)及非缺血區(qū)心肌組織，提取總RNA，實(shí) 時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-324的表達(dá)水平，如圖IB所示，結(jié)果顯示缺血IOmin? 60min心肌缺血組織較非缺血組織及非缺血模型組miRNA-324表達(dá)水平顯著下降。
[0020] 實(shí)施例2、
[0021] miRNA-324抑制心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，本實(shí)施例涉及的miRNA-324腺病毒的構(gòu)建 采用Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV系統(tǒng)。按照公司說明書構(gòu)建相應(yīng)載體及 腺病毒，具體方法如下：提取大鼠心臟的基因組，以其為模板，PCR擴(kuò)增miRNA-324及其上 下游兩端各將近200個(gè)bp的序列（PCR體系50 μ L，PCR條件如下：95°C 3min-個(gè)循環(huán)； 95°C 30s，56°C 30s，72°C Imin共28個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min)，將該擴(kuò)增片段用spe I 和xho I進(jìn)行雙酶切，再將腺病毒載體pSilencer Adeno CMVL 0穿梭載體（pSilencer Adeno CMVLOshuttle vector載體）（購(gòu)自Ambion公司）進(jìn)行雙酶切后與酶切后的 片段進(jìn)行連接，即將片段克隆入腺病毒載體中，Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架 (Adenovirus LacZ Backbone)，共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞，購(gòu)自上海研生生化試劑 有限公司），包裝腺病毒，擴(kuò)增收集病毒，測(cè)定病毒滴度。
[0022] 本實(shí)施例中使用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為模型。感染上述的miRNA-324腺病毒過 表達(dá)miRNA-324,突變的miRNA-324腺病毒作為對(duì)照（即miRNA-對(duì)照），病毒感染24小時(shí) 后，在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理細(xì)胞3小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；臺(tái)盼蘭染色方法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋 亡情況，結(jié)果見圖2A。同時(shí)又檢測(cè)了細(xì)胞色素 C的釋放用來證明凋亡的發(fā)生（圖2B)，其 中線粒體部分以COX IV為陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)胞質(zhì)部分以微管蛋白為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示過表達(dá) miRNA-324可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
[0023] 實(shí)施例3、
[0024] miRNA-324過表達(dá)抑制心肌缺血損傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本實(shí)施例設(shè)計(jì)的小鼠經(jīng)冠狀動(dòng) 脈注射miRNA-324模擬物可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷，以C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按 照如下方法注射miRNA-324模擬物（miRNA-324mimic)及miRNA-324模擬物陰性對(duì)照 (miRNA-324mimic NC)，并以假手術(shù)處理小鼠為作為對(duì)照組，以C57小鼠為野生型。小鼠稱 重并麻醉，仰臥位固定，剪毛并用碘酒消毒手術(shù)區(qū)；頸部正中切開氣管并插管，連動(dòng)物呼吸 機(jī)進(jìn)行正壓通氣，在胸骨左緣處及心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約3cm，逐層鈍性分離皮下組 織、肌肉，開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟；稀釋2X IO11Pfu(感染系數(shù)）腺病 毒于PBS中，終體積為200 μ L，26號(hào)導(dǎo)管從心尖進(jìn)入動(dòng)脈根部，注射病毒時(shí)同時(shí)夾閉主動(dòng) 脈及肺動(dòng)脈，持續(xù)夾閉20秒；監(jiān)測(cè)5min，待心臟恢復(fù)竇律后，清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭 注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔；等小鼠清醒后，脫離呼吸機(jī)，放回籠中，心電圖監(jiān)測(cè)整個(gè)手術(shù)過 程；注射病毒3天后進(jìn)行心臟缺血再灌注手術(shù)，具體操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于實(shí) 驗(yàn)用木板上，并進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)，頸部正中切開氣管并插管，連動(dòng)物人工呼吸機(jī)，于第四肋 間開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管；在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠 狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方2_處進(jìn)針，進(jìn)針深度0. 5_ ;以6/0帶針縫合線穿 過心肌表層，在肺動(dòng)脈圓椎旁出針；待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定IOmin后，予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前 降支（LAD)，以ST段弓背向上抬高大于0. Imv并持續(xù)0. 5h以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志，缺 血45min之后，松開結(jié)扎線開始再灌注；以ST段下降為標(biāo)志，清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭 注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔，再灌注24h用伊文氏藍(lán)雙染測(cè)定心肌梗死面積；結(jié)果顯示：注射 miRNA-324mimic的小鼠 I/R組心肌梗死面積比野生小鼠 I/R組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (p〈0. 01)，見圖3A ;其心梗面積按如下方法計(jì)算：左心室面積（left ventricle，LV)為藍(lán) 色、紅色和白色面積之和；危險(xiǎn)區(qū)總面積（area at risk，AAR)為紅色和白色面積之和；梗 死區(qū)面積（infarct area，INF)為白色面積；危險(xiǎn)區(qū)面積（AAR/LV，％ )=(危險(xiǎn)區(qū)總面積/ 左心室面積）X 100%，心梗面積（INF/AAR，％ )=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積）X 100%; 同時(shí)又檢測(cè)了注射miRNA-324mimic對(duì)I/R的凋亡的影響，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（TUNEL 法）檢測(cè)（圖3B)，結(jié)果表明注射了 miRNA-324mimic的組份與I/R組份相比凋亡率明顯的 減小，即miRNA-324對(duì)心肌具有保護(hù)作用。
[0025] 實(shí)施例4、
[0026] miRNA-324過表達(dá)顯著抑制心肌缺血再灌注引起的心功能的損傷，本實(shí)施例對(duì) 實(shí)驗(yàn)小鼠分別進(jìn)行假手術(shù)處理作為對(duì)照組，缺血再灌注手術(shù)處理作為為缺血再灌組，注射 miRNA-324模擬物后進(jìn)行缺血再灌注手術(shù)處理（作為miRNA-324模擬物）及注射miRNA-324 模擬物陰性對(duì)照后再進(jìn)行缺血再灌注手術(shù)處理（作為miRNA-324模擬物陰性對(duì)照）；以購(gòu) 自上海吉瑪公司的一段無關(guān)序列為陰性對(duì)照序列，其不抑制現(xiàn)有已知的任何基因的表達(dá)， 為了證明目標(biāo)的小RNA即miRNA-324的有效性，在購(gòu)買miRNA-324模擬物的時(shí)候公司都會(huì) 配送一個(gè)目標(biāo)小RNA的陰性對(duì)照以此來證明我們目標(biāo)小RNA的有效性；對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠各組別 進(jìn)行超聲心動(dòng)的心功能檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括（圖4A)左室舒張末內(nèi)徑（LVIDd)、（圖4B)左 室收縮末內(nèi)徑（LVIDs)和（圖4C)短軸截短率（FS)，結(jié)果表明miRNA-324模擬物的注射可 以改善缺血再灌手術(shù)造成的心功能的損傷。
[0027] 實(shí)施例5、
[0028] 抑制內(nèi)源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積， 本實(shí)施例對(duì)小鼠尾靜脈30mg/kg注射miRNA-324抑制劑及陰性對(duì)照（功能同實(shí)施例4中相 同的無序序列），以假手術(shù)處理小鼠作為對(duì)照組；三天后進(jìn)行缺血再灌注手術(shù)，再灌注3h監(jiān) 測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，再灌注24小時(shí)用伊文氏藍(lán)雙染測(cè)定心肌梗死面積；與陰性對(duì)照注射組相 比，miRNA-324抑制劑I/R組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增高（圖5A)，心肌梗死面積顯著增高（圖 5B)，說明抑制內(nèi)源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積。
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物組合物包括miRNA-324和藥學(xué) 上的載體、病毒或輔料；所用的miRNA-324的序列為5'-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3 ;所述 載體為殼聚糖、膽固醇、納米顆粒和脂質(zhì)體中的一種或多種；所述病毒載體為腺病毒載體、 慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽 水中的一種或多種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物組合物 中過表達(dá)miRNA-324的病毒載體感染滴度為1016PFU。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物劑型為 口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種。
4. 一種含有miRNA-324的藥物組合物的用途，其特征在于用于治療心肌梗死、心肌缺 血損傷、心肌肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK104491878SQ201410803075
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】王昆, 李培峰 申請(qǐng)人:青島大學(xué)