一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明miR-185是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控RAGE基因的一種miRNA分子，其可抑制食管癌細胞的轉(zhuǎn)移。miR-185/RAGE的發(fā)現(xiàn)為食管癌分子靶向治療提供了一新靶點。
【專利說明】一種mi RNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]食管癌是我國發(fā)病率極高的一種惡性腫瘤，其死亡率居全國惡性腫瘤死亡率的第二位。由于早期癌細胞浸潤局限于粘膜上皮細胞內(nèi)，未累及食管壁肌層，患者癥狀不明顯，極易漏診、誤診，目前尚未發(fā)現(xiàn)理想的食管癌分子診斷生物標志物。分子靶向治療，是在細胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(該位點可以是一個基因片段)，來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進入體內(nèi)會特異地選擇致癌位點結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞。因此，深入研宄與食管癌發(fā)病機制相關(guān)的基因，不僅具有重要的學(xué)術(shù)價值，而且具有巨大的應(yīng)用前景和社會效益。
[0003]晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorfor advanced glycat1n end products，RAGE)是細胞表面分子免疫球蛋白超家族成員之一，因與晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycat1n end products，AGEs)相互作用被發(fā)現(xiàn)并因此得名。RAGE通過與其配體結(jié)合，激活細胞內(nèi)包括NF- K B，Racl/Cdc 42，p38 MAPK, JNK/SAPK，ERKI/2等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與疾病的生理和病理過程。最新研宄提示，RAGE配體并不是一段簡單的多肽，而是一個配體家族。繼 AGEs 之后，高遷移率蛋白 BI (high mobility group BLHMGBl/ Amphoterin)和SlOO/鈣粒蛋白是新發(fā)現(xiàn)的RAGE配體。HMGBl和S100/鈣粒蛋白可由腫瘤細胞分泌，通過RAGE-配體激活細胞，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如增強細胞因子和生長因子的表達，促進細胞迀移，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-K B等。在不同種類腫瘤中RAGE差異表達。我們前期對RAGE及其變體在食管癌中的表達進行了研宄。發(fā)現(xiàn)食管發(fā)生癌變時高表達RAGE，且僅與癌浸潤深度有關(guān)，當侵及肌層及外層后，其表達水平高于局限在黏膜及黏膜下層者。目前，對于食管癌中RAGE表達如何被miR調(diào)節(jié)及其怎樣影響食管癌細胞關(guān)鍵性生理功能，尚不清楚。
[0004]微小RNA (miRNA, miR)是約19~24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，具有高度保守性，能夠與革E基因3’非翻譯區(qū)(Untranslated Reg1ns，UTR)互補結(jié)合，降解目的基因mRNA或抑制其翻譯，負調(diào)控基因表達。我們前期綜合運用多種生物信息學(xué)軟件分析提示miR-185可能作用于RAGE基因，但具體調(diào)控機制尚未經(jīng)過一系列實驗證實。最近還研宄表明，腫瘤組織的miR表達譜較正常組織有較大差異，加之腫瘤組織可能存在缺血、壞死、破潰等改變，腫瘤細胞內(nèi)的miR極可能釋放入血，如miR-21、miR-223和miR-17_92表達簇等miR均在多種腫瘤中被證實表達增高，而在腫瘤患者血液中亦檢測到這種表達變化。血液不同于其他體液，來源于全身各處，血液中的蛋白質(zhì)可與miR分子結(jié)合在一起，具有良好的穩(wěn)定性。因此，血循環(huán)miR作為生物標記物進行疾病檢測展示出良好的臨床應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是: 一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。
[0007]所述食管癌是與RAGE表達的相關(guān)的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻譯區(qū)預(yù)測靶位。
[0008]通過過表達miR-185抑制食管癌細胞的侵襲和迀移并抑制肺組織癌細胞轉(zhuǎn)移。
[0009]本發(fā)明miR-185是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控RAGE基因的一種miRNA分子，其可抑制食管癌細胞的轉(zhuǎn)移。miR-185/RAGE的發(fā)現(xiàn)為食管癌分子靶向治療提供了一新靶點。
[0010]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

【具體實施方式】
[0011]一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。
[0012]所述食管癌是與RAGE表達的相關(guān)的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻譯區(qū)預(yù)測靶位。
[0013]通過過表達miR-185抑制食管癌細胞的侵襲和迀移并抑制肺組織癌細胞轉(zhuǎn)移。
[0014]本發(fā)明miR-185是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控RAGE基因的一種miRNA分子，其可抑制食管癌細胞的轉(zhuǎn)移。miR-185/RAGE的發(fā)現(xiàn)為食管癌分子靶向治療提供了一新靶點。
[0015]材料和方法 1.臨床樣本
食管癌標本28例(其中男19例，女9例，年齡50~82歲，中位年齡62歲)由南通大學(xué)附屬醫(yī)院提供。標本為未經(jīng)手術(shù)、放療和化療等治療的初診患者血液標本，經(jīng)EDTA抗凝、1000 X g、15分鐘離心后-70度保存。對照組為南通大學(xué)附屬醫(yī)院正常體檢者血液共35例。
[0016]2.細胞株及細胞培養(yǎng)
人食管癌細胞系Eca-109購自中國科學(xué)院細胞庫上海保藏中心。Kyse-30、TE-1l和TE-10購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。Eca-109、TE-1l和TE-10和Kyse-30細胞分別用RPMI1640、DMDM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μ g /mL鏈霉素)，5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2-3 d換液一次。
[0017]3.質(zhì)粒的合成與轉(zhuǎn)染
miR-185 mimic激動劑和對照質(zhì)粒，miR-185Agomir激動劑和對照質(zhì)粒均購自廣州銳博生物科技有限公司。收集處于生長對數(shù)期的食管癌細胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細胞2~3次，以去除殘余的青霉素和鏈霉素。細胞計數(shù)，將細胞懸液以I X 15個/mL的濃度接種至6孔板，每孔加1600 μ I無抗生素培養(yǎng)基，接種24 h后細胞融合度達到40% ;將400 μ I質(zhì)粒-1ipofectamine 2000加入含1600 μ I無抗生素培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕混勻；6 h后將含有質(zhì)粒-1ipofectamine 2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮雙抗培養(yǎng)基之后，37°C培養(yǎng)1~3 d后檢測。
[0018]4.細胞迀移和侵襲試驗
細胞迀移試驗時，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度至2X 104/ml。取細胞懸液100 μ?加入Transwell小室的上室，24孔板下室一般加入600 μ?無抗完培。常規(guī)培養(yǎng)24 ho棉簽擦去上室上面的多余培養(yǎng)基，倒置，風(fēng)干。在24孔板中加入500 μ? 0.1%結(jié)晶紫染液，染液內(nèi)有4%甲醛，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，5 min后取出，PBS清洗。倒置顯微鏡下拍照、計數(shù)(視野內(nèi)直徑上分別取4個視野)。統(tǒng)計處理。侵襲實驗時，需鋪膠。槍頭與EP管經(jīng)冰箱預(yù)冷10 min以上，等待Matrigel膠4°C充分液化。將24孔板和Transwell小室在冰上擺放水平，快速的將30 μ? Matrigel膠加入到小室的上室底層，快速均勻鋪平，擺放平整，等待凝固；將鋪好的膠置于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱中30 min，待膠上層出現(xiàn)“白色層”時，取出待用，期間處理已接種的細胞，待用，培養(yǎng)48 h后觀測。
[0019]5.細胞免疫熒光檢測RAGE表達
羊抗人多克隆RAGE抗體購自美國R&D公司。鼠抗人單克隆β-actin抗體購自美國B1vis1n公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗羊二抗購自美國KPL公司。HRP標記的羊抗鼠二抗購自美國Jackson公司。接種食管癌細胞至24孔板內(nèi)的小圓片上，I d后細胞密度約達50%~70%;長有細胞的蓋玻片用0.01 M PBS洗滌3次；4%多聚甲醛4 °C固定30min后0.01 M PBS洗滌，5 minX 3次；加二抗正常封閉血清封閉(0.3% TritonX-1OO +10%胎牛血清，余PBS補足)，室溫孵育30 min，傾去，勿洗；將小園片放載玻片上，加RAGE—抗，4 °C孵育過夜；0.01 M PBS洗滌后加二抗(FITC標記)，室溫孵育2~4 h ；0.01 M PBS洗滌后加Hoeschst (1:1000)，10 min, 0.01 M PBS洗滌，5 minX 3次；倒扣小圓片，吸多余液體，封片。
[0020]6.Western blotting 檢測 RAGE 蛋白水平
將50 μ g總蛋白與5 X樣品緩沖液混合，100 °C變性，離心，加入樣品孔中。SDS-PAGE電泳(80V，20 min ;100V，90min)，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(300 mA，2 h)。含5%脫脂奶粉的
IX TBS-T封閉過夜。I X TBS-T緩沖液漂洗3次，每次5 min,滴加羊抗人RAGE抗體(稀釋濃度為I: 1000)或鼠抗人β-actin抗體(I: 1000)，4°C孵育10 h。1XTBS-T漂洗5次，加入HRP標記的兔抗羊(或羊抗鼠)抗體，4°C孵育2 h，I X TBS-T漂洗3次。加ECL發(fā)光劑I?10 min內(nèi)顯影、定影，膠片洗滌干燥后保存。
[0021]7.雙熒光素酶報告基因檢測
利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-185與RAGE 3’UTR結(jié)合序列；根據(jù)結(jié)合位點，化學(xué)合成RAGE基因3’UTR片段；重組至psiCHECK_2，生物信息學(xué)預(yù)測miR-185與RAGE基因的靶結(jié)合位點，并針對該位點進行定點突變。調(diào)整細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異；熒光素酶報告載體分別轉(zhuǎn)染進入miR-185 mimic+野生型RAGE組、miR-185 mimic+突變型RAGE組及miR-185陰性對照(NC)組中，檢測熒光素酶活性。注:psiCHECK-2 Vector以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)參。
[0022]8.食管癌細胞株及食管癌患者血漿miR-185的實時熒光定量PCR檢測
Trizol法(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA質(zhì)量和濃度。血楽miR按QIAGEN miRNeasy Mini試劑說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄(SuperScript?III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)按美國Fermentas公司試劑說明書進行。miR-185逆轉(zhuǎn)錄引物和RTFQ-PCR引物由廣州銳博生物科技有限公司提供。
[0023]9.動物實驗
用200 μ I PBS稀釋轉(zhuǎn)染miR-185 Agomir或?qū)φ盏?廣州銳博生物科技有限公司合成)Eca-109細胞。將2 X 15 Eca_109細胞經(jīng)尾靜脈注射至裸鼠。6周后處理裸鼠，肺組織經(jīng)固定、包埋后制成切片行HE染色，觀察腫瘤細胞的數(shù)量。
[0024]10.統(tǒng)計學(xué)分析
使用 SigmaPlot 11.0 軟件進行統(tǒng)計分析。Kruskal-Wallis one way analysis ofvariance on ranks方法計算直，K0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0025]結(jié)果
1.miR-185對RAGE表達的調(diào)控機制
通過對RTFQ-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最終的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性10 min，95°C15 s、62°Cl min，40個循環(huán)。將同一份標本進行5倍倍比稀釋，取上述稀釋物及陰性對照擴增后，擴增曲線效率=87.313，R2=0.998，斜率=-3.669，截距=38.82。進行熔解曲線分析并對擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析其特異性，未發(fā)現(xiàn)明顯雜帶。取上述倍比稀釋標本(低、中、高值)，每個標本連續(xù)測5 d，每天重復(fù)3次，根據(jù)循環(huán)閾值計算變異系數(shù)(CV)，以評價所建方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示，批內(nèi)CV為0.38%~0.64%，批間CV為3.71%~4.34%。上述表明，RTFQ-PCR檢測miR-185的方法具有線性范圍寬、特異和重復(fù)性好等優(yōu)點。
[0026]采用RTFQ-PCR方法檢測四種食管細胞株(Kyse-30、Eca-109, TE-1l和TE-10)中miR-185的表達，并采用RTFQ-PCR和Western blotting檢測RAGE表達。結(jié)果表明，Eca-109和TE-1l細胞株RAGE表達顯著高于Kyse-30和TE-10細胞株，而miR-185在四種細胞株中的表達量差異不明顯。因此，最終確定Eca-109和TE-1l為后續(xù)研宄使用的細胞株。
[0027]通過多種生物信息學(xué)軟件分析得到miR-185與RAGE3’ UTR區(qū)結(jié)合的靶位點序列。經(jīng)靶序列擴增、克隆、電泳及測序所得克隆序列與miR-185靶序列一致，將構(gòu)建完成miR-185-reporter 載體(ps1-CHECK-2)及內(nèi)參質(zhì)粒、突變質(zhì)粒、miR-185 mimic 和 miR-185對照分別按既定分組共轉(zhuǎn)染293 T細胞，經(jīng)48 h常規(guī)培養(yǎng)后，進行雙熒光素酶活性檢測及數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，與RAGE+NC組相比，RAGE+miR-185組的熒光素酶活性明顯抑制(K0.01);與RAGE-mut+NC相比，RAGE-mut+ miR-185組的熒光素酶活性無明顯變化(m.05)。說明miR-185存在與RGAE 3’ UTR區(qū)的互補結(jié)合序列并且可通過互補結(jié)合靶向抑制RAGE表達。
[0028]通過轉(zhuǎn)染miR-185 mimic和對照，觀察miR-185和RAGE表達量的變化。50 nMmiR-185 mimic和對照均分別轉(zhuǎn)染Eca-109和TE-1I兩種細胞株，48 h收集細胞行RTFQ-PCR檢測兩種食管癌細胞中miR-185和RAGE的表達，72 h后行細胞免疫熒光法檢測RAGE表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-185 mimic組較轉(zhuǎn)染miR-NC組，miR-185含量顯著增高而兩種食管癌細胞中RAGE表達受到抑制。上述結(jié)果表明低表達miR-185可上調(diào)食管癌中RAGE表達。
[0029]2.miR-185對食管癌迀移和侵襲的影響
Transwell迀移試驗表明，miR-185 mimic組和對照組的穿膜細胞數(shù)分別為:52±16vs.490±26 (TE-1l) ;164±13 vs.493±40 (Eca-109)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(代0.05)。Transwell侵襲試驗表明，miR-185 mimic組和對照組的穿膜細胞數(shù)分別為:26±3 vs.66±7 (TE-1l) ;16±2 vs.54±4 (Eca-109)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(K0.05)。動物實驗顯示，miR-185 Agomir組轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞明顯少于miR-185 Agomir對照(NC)組(代0.05)。
[0030]3.miR-185在食管癌患者血液中的含量
以U6為內(nèi)參，用SYBR Green I RTFQ-PCR檢測28例食管癌患者和35例健康體檢者血楽 miR-185 的相對表達量分別為 0.500 (95% Cl 0.248 - 1.676)，2.410 (95% C1.612 -5.671)。結(jié)果顯示，食管癌患者血漿miR-185的相對表達量低于健康體檢者(片0.002);根據(jù)食管癌患者與健康體檢者數(shù)據(jù)結(jié)果繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)以miR-185作為診斷指標時，ROC曲線下面積(AUC)為0.7，說明miR-185在食管癌輔助分子診斷方面發(fā)揮一定作用。
[0031]討論
RAGE是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤侵襲相關(guān)性基因，RAGE蛋白是細胞表面分子免疫球蛋白超家族的一個多配體成員，是一跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。與不同配體結(jié)合后，在生理病理過程中發(fā)揮作用。RAGE在不同種類的惡性腫瘤組織和惡性轉(zhuǎn)化細胞中差異表達，并且與腫瘤細胞增殖、運動和侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。我們首次發(fā)現(xiàn)食管癌組織RAGE表達量顯著高于其遠端正常組織。RAGE在食管癌侵及肌層及外層后表達明顯高于局限在黏膜及黏膜下層者，提示其高表達可能與腫瘤侵襲深度有關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌細胞分化程度、?!分期無關(guān)。對此調(diào)節(jié)機制的深入研宄，將有力促進食管癌診斷標志物的探尋和發(fā)病分子機制研宄。miR是約19~24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，具有高度保守性，能夠與靶基因3’ UTR互補結(jié)合，降解目的基因mRNA或抑制其翻譯，負調(diào)控基因表達。miR如何調(diào)控RAGE表達及其在食管癌中的應(yīng)用尚不清楚。
[0032]為了闡明miR-185和RAGE基因之間的關(guān)系，我們對體外生長的食管癌細胞進行miRNA模擬的轉(zhuǎn)染促進miR-185的表達，運用RTFQ-PCR、We stern blotting和雙熒光素酶報告基因的技術(shù)從蛋白和基因兩個水平來驗證兩者之間的靶向調(diào)節(jié)作用，最終證明miR-185可以直接調(diào)控RAGE基因。
Li等發(fā)現(xiàn)miR-25在晚期胃癌患者組織和血液中表達明顯升高，應(yīng)用miR-25抑制劑轉(zhuǎn)染胃癌細胞系HGC-27 and SGC-7901，發(fā)現(xiàn)低水平的miR-25能夠抑制腫瘤細胞的迀移和轉(zhuǎn)移，進一步發(fā)現(xiàn)將miR-25抑制劑轉(zhuǎn)染載體經(jīng)靜脈注入裸鼠，其肺轉(zhuǎn)移灶的形成明顯降低、腹部淋巴結(jié)數(shù)量明顯減少。我們通過檢測臨床標本發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血miR-185含量顯著低于正常對照者。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的特點是不影響腫瘤細胞的成瘤性，但可以明顯改變腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。為了探索miR-185對食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，我們轉(zhuǎn)染miR-185模擬物及對照至食管癌細胞株進Transwell小室侵襲和迀移實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-185后RAGE表達降低，食管癌細胞株的穿膜細胞數(shù)明顯減少。進一步，通過構(gòu)建裸鼠食管癌模型行靜脈注射miR-185模擬物，6周后取肺組織行HE染色，發(fā)現(xiàn)miR-185模擬物較對照組可顯著減少轉(zhuǎn)移的食管癌細胞。
[0033]綜上，miR-185是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控RAGE基因的一種miRNA分子，其可抑制食管癌細胞的轉(zhuǎn)移，在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。miR-185/RAGE的發(fā)現(xiàn)為食管癌分子靶向治療提供了一新靶點。
【權(quán)利要求】
1.一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用，其特征是:所述食管癌是與RAGE表達的相關(guān)的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻譯區(qū)預(yù)測靶位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種miRNA在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用，其特征是:通過過表達miR-185抑制食管癌細胞的侵襲和迀移并抑制肺組織癌細胞轉(zhuǎn)移。
【文檔編號】A61P35/00GK104491877SQ201410752341
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】景蓉蓉, 崔明, 王惠民, 鞠少卿, 叢輝 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院