天麻素防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了天麻素防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，天麻素對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞無毒性作用，不影響細(xì)胞增殖；對(duì)過氧化氫造成的MC3T3-E1的凋亡具有保護(hù)作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)；對(duì)H2O2造成的MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護(hù)作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)，從而通過改善成骨細(xì)胞凋亡和分化抑制及間接抑制破骨細(xì)胞活化來對(duì)骨質(zhì)疏松起保護(hù)作用。在去勢小鼠骨松模型中，天麻素可以改善血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善股骨遠(yuǎn)端和腰椎的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)，提高股骨遠(yuǎn)端的骨生成速率，表明天麻素能夠通過抑制氧化應(yīng)激而改善骨微結(jié)構(gòu)，發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松的作用。
【專利說明】天麻素防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于骨質(zhì)疏松的防治【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及天麻素防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，0P)是退行性、全身性、代謝性骨骼疾病，是由多種病因?qū)е碌墓墙M織骨量丟失、結(jié)構(gòu)改變和生物力學(xué)性能減退，容易發(fā)生骨折，嚴(yán)重威脅中老年人的身心健康。
[0003]氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體內(nèi)高活性物質(zhì)如R0S(Reactive oxygenspecies)產(chǎn)生過多，超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡的一種狀態(tài)。生理范圍內(nèi)的ROS在調(diào)節(jié)人體正常的功能如細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要的作用。然而，高濃度的ROS可以導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，弓丨起疾病的發(fā)生。
[0004]近年來，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中起重要作用。過量氧自由基(ROS)的產(chǎn)生可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成骨分化，造成MSCs和成骨細(xì)胞(OB)凋亡，促進(jìn)破骨細(xì)胞(OC)活化和功能增強(qiáng)，導(dǎo)致骨吸收和骨形成失衡，引起骨微結(jié)構(gòu)改變和骨量降低。
[0005]天麻是一種具有高度生物活性的藥用植物，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥中。天麻素(gastrodin)是其主要活性成分，天麻的大部分功效是通過天麻素發(fā)揮的。天麻素具有多項(xiàng)生理功能:松弛肌肉、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)和抗氧化等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供天麻素防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0008]天麻素在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0009]含天麻素的植物提取物在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0010]天麻素在制備用于改善成骨細(xì)胞前體細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用。
[0011]天麻素在制備用于抗成骨細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
[0012]天麻素在制備用于抗成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化抑制的藥物中的應(yīng)用。
[0013]天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中ALP活性的藥物中的應(yīng)用。
[0014]天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中促成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達(dá)水平的藥物中的應(yīng)用。
[0015]天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中抑制RANKL和IL_6水平的藥物中的應(yīng)用。
[0016]天麻素的給藥量至少為lmg/kg。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0018]天麻素對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)無毒性作用jiMC3T3_El的凋亡具有保護(hù)作用；并且可以改善氧化應(yīng)激狀態(tài)J^MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護(hù)作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)。在去勢小鼠模型中，天麻素可以改善血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，改善股骨遠(yuǎn)端和腰椎的松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)，提高股骨遠(yuǎn)端的骨生成速率。
[0019]MC3T3-E1細(xì)胞是研究成骨細(xì)胞生長、分化的較常用的細(xì)胞模型，鑒于天麻素對(duì)MC3T3-E1的作用，其對(duì)成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，促進(jìn)骨形成，并通過抑制骨吸收因子來抑制破骨細(xì)胞的活化，降低骨吸收，最終起到防治骨質(zhì)疏松的作用。卵巢切除小鼠模型為常用的絕經(jīng)后骨松模型，通過連續(xù)腹腔注射給與不同劑量天麻素，明顯改善了血清氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，表明其能夠發(fā)揮預(yù)防及治療絕經(jīng)后骨松的作用。
[0020]天麻素為純天然物質(zhì)，用藥較安全，毒副作用小。
[0021]因此，天麻素可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是應(yīng)用在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1-1為不同濃度天麻素對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響。
[0023]圖1-2為天麻素對(duì)H2O2造成的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
[0024]圖2為天麻素改善細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS水平的檢測結(jié)果。
[0025]圖3-1為天麻素在H2O2作用后，對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的作用。
[0026]圖3-2為天麻素在H2O2作用后，對(duì)細(xì)胞基質(zhì)鈣鹽沉積的作用。
[0027]圖3-3為天麻素對(duì)4種細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)水平的影響。
[0028]圖4A和圖4B為天麻素在H2O2作用后對(duì)兩種骨吸收因子RANKL和IL_6表達(dá)的影響。
[0029]圖5-1A和圖5-1B為天麻素改善小鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和GSH水平的檢測結(jié)果。
[0030]圖5-2為天麻素改善OVX小鼠股骨遠(yuǎn)端和第四腰椎松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的Micro-CT結(jié)果。
[0031]圖5-3為天麻素提高OVX小鼠股骨遠(yuǎn)端的骨生成速率的檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0033]MC3T3-E1為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系，可以向成骨細(xì)胞進(jìn)行分化，是研究成骨細(xì)胞生長、分化的較常用的細(xì)胞模型，過氧化氫(H2O2)處理也是較常用的體外氧化應(yīng)激模型，出于觀察天麻素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡和分化的影響，及其抗氧化損傷的作用，所以選擇MC3T3-E1作為細(xì)胞模型，H2O2處理為體外氧化應(yīng)激模型。卵巢切除(去勢)小鼠模型作為動(dòng)物模型，是常用的模擬婦女絕經(jīng)后骨松模型。
[0034]1、天麻素對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致MC3T3-E1凋亡的保護(hù)作用
[0035]1.1單純天麻素對(duì)細(xì)胞的毒性作用
[0036]將MC3T3-E1細(xì)胞以2 X 13個(gè)/mL接種到96孔板上，待細(xì)胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為:a -MEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素))，加含濃度O (空白對(duì)照組)、0.1、1、10 μ M天麻素的無血清培養(yǎng)基至孔板中，分別培養(yǎng)24h、48h和72h，觀察天麻素對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響。在觀察點(diǎn)，利用MTT法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。
[0037]結(jié)果如圖1-1所示，橫坐標(biāo)為不同濃度的天麻素作用時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對(duì)照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，不同濃度的天麻素在觀察時(shí)間內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的增殖并無明顯影響。
[0038]1.2天麻素對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致MC3T3-E1凋亡的保護(hù)作用
[0039]分組情況:空白對(duì)照組；單純H2O2處理組；0.I μ M天麻素+H2O2 ；1 μ M天麻素+H2O2 ；10 μ M 天麻素 +H2O2。
[0040]將MC3T3-E1細(xì)胞以2 X 13個(gè)/mL接種到96孔板上，待細(xì)胞長滿后，棄掉培養(yǎng)基，加含濃度O、0.1、1、10 μ M天麻素的無血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)24h，加入H2O2 (300 μ M)，再培養(yǎng)24h，利用MTT法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。
[0041]結(jié)果如圖1-2所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力值，以各組的吸光度OD值同空白對(duì)照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2作用后，細(xì)胞活性降低，經(jīng)不同濃度天麻素作用后細(xì)胞活性增加，同單純H2O2處理組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖中的#號(hào)表示:同空白對(duì)照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05，< 0.01。這表明用天麻素處理后能夠保護(hù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致MC3T3-E1的凋亡。
[0042]綜上所述，經(jīng)天麻素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞作用，即不同濃度天麻素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后施加H2O2干預(yù)，通過MTT細(xì)胞活性檢測，結(jié)果表明單純H2O2作用可以導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，造成細(xì)胞凋亡，而0.1、1、10μΜ天麻素預(yù)處理，對(duì)這種損傷具有保護(hù)作用。因此，天麻素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
[0043]2、天麻素抗氧化作用檢測
[0044]MC3T3-E1細(xì)胞鋪滿后，在天麻素和/或H2O2作用下，處理方法同上(1.2中)，進(jìn)行氧化應(yīng)激相關(guān)檢測。
[0045]根據(jù)ROS檢測試劑盒，利用熒光探針DCFH-DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)行檢測。細(xì)胞爬片，0.1、1、10 μ M天麻素預(yù)處理24h，300 μ M H2O2作用24h，然后進(jìn)行原位裝載探針，加入10 μ M DCFH-DA,孵育20min，用a -MEM培養(yǎng)液洗3次，去除未結(jié)合的探針，利用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。
[0046]結(jié)果如圖2所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為ROS生成，以各組的吸光度OD值同空白對(duì)照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高很明顯，而0.1、1、10μΜ天麻素預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)的ROS水平降低。圖中的#號(hào)表示:同空白對(duì)照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純H2O2處理組相比，*Ρ < 0.05，#Ρ < 0.01。因此，天麻素可以改善細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS水平。
[0047]3、天麻素對(duì)氧化應(yīng)激造成MC3T3-E1成骨分化抑制的保護(hù)作用
[0048]天麻素對(duì)氧化應(yīng)激造成MC3T3-E1成骨分化抑制的保護(hù)作用:實(shí)驗(yàn)分組同上(1.2中)，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，加入地塞米松0.1uM, 1mM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。在6和14天，給予0.1、1、10μΜ天麻素預(yù)處理24h，然后加入300 μ M H2O2 處理 24h。
[0049]3.1根據(jù)堿性磷酸酶定量試劑盒(上海杰美)進(jìn)行ALP定量，收集細(xì)胞，裂解后，提取蛋白。測定蛋白濃度，然后根據(jù)試劑盒的說明，進(jìn)行ALP定量檢測。
[0050]結(jié)果如圖3-1所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為ALP活力值，以各組的吸光度OD值同空白對(duì)照組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。單純H2O2作用后，細(xì)胞ALP活性表達(dá)同空白對(duì)照組相比顯著下降，天麻素作用后，ALP活性表達(dá)升高，同單純H2O2作用組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并呈劑量依賴性。圖中的#號(hào)表示:同空白對(duì)照組相比，#P<0.05,##P<0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05，#P < 0.01。ALP為成骨細(xì)胞分化中期的關(guān)鍵表達(dá)蛋白，為檢測成骨細(xì)胞分化的特異性指標(biāo)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致ALP活性降低，對(duì)成骨分化為抑制作用，但經(jīng)天麻素作用后，ALP表達(dá)增加，改善了氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞成骨分化的抑制作用。
[0051]3.2鈣化結(jié)節(jié)染色:用PBS沖洗培養(yǎng)細(xì)胞，多聚甲醛固定后，I %茜素紅染色30min，用水沖洗5次，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)沉積。
[0052]分組情況:①空白對(duì)照組；②單純H2O2處理組過0.1 μ M天麻素+H2O2 ;(D I μ M天麻素 +H2O2 ； (5) 10 μ M 天麻素 +H2O2。
[0053]結(jié)果如圖3-2所示，單純H2O2作用后鈣化結(jié)節(jié)形成較少，但是天麻素預(yù)處理后，結(jié)節(jié)面積有增加。鈣結(jié)節(jié)形成為成骨分化的礦化階段，氧化應(yīng)激可以抑制成骨細(xì)胞分化，而天麻素可以通過改善氧化應(yīng)激來改善成骨分化。
[0054]3.3成骨基因的RT-PCR檢測:實(shí)驗(yàn)分組同上(1.2中)，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，加入0.1uM地塞米松，1mM甘油磷酸鈉以及50ug/mL抗壞血酸進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。6天后，給予0.1、1、10 μ M天麻素預(yù)處理24h，然后加入300 μ M H2O2處理24h。用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的mRNA，根據(jù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的程序，對(duì)目的基因Alp、Collal、0cn及Opn進(jìn)行定量檢測。
[0055]結(jié)果如圖3-3所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以各組相對(duì)于空白對(duì)照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用后，細(xì)胞成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達(dá)水平下降，天麻素作用后，可以顯著促進(jìn)成骨基因表達(dá)。圖中的#號(hào)表示:同空白對(duì)照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純H2O2處理組相比，*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。Alp、CollaU Ocn及Opn基因分別為成骨細(xì)胞分化中期和后期的關(guān)鍵基因，決定著細(xì)胞的分化水平。H2O2抑制成骨分化基因的表達(dá)，而天麻素作用后，成骨分化基因表達(dá)有上調(diào)，說明天麻素可以改善H2O2導(dǎo)致的成骨細(xì)胞分化抑制。
[0056]4、天麻素對(duì)骨吸收因子的表達(dá)影響
[0057]天麻素對(duì)氧化應(yīng)激刺激骨吸收因子增加的抑制作用:分組同上(1.2中)，將細(xì)胞鋪于6孔板上，鋪滿后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，6天后，給予天麻素處理，然后加入H2O2,裂解細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)檢測RANKL和IL-6的表達(dá)情況。
[0058]結(jié)果如圖4所示(其中圖4Α為RANKL的檢測結(jié)果，圖4Β為IL_6的檢測結(jié)果)，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)為骨吸收因子的相對(duì)表達(dá)量，以各組相對(duì)于空白對(duì)照組的百分率來表述。由圖可見，H2O2作用后，細(xì)胞表達(dá)的RANKL和IL-6水平增加，天麻素預(yù)處理可以抑制骨吸收因子的表達(dá)。圖中的#號(hào)表示:同空白對(duì)照組相比，#P〈0.05，##P〈0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純H2O2處理組相比，*P < 0.05, #P < 0.01。RANKL和IL-6為成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以活化破骨細(xì)胞，進(jìn)而引起骨吸收增強(qiáng)，導(dǎo)致骨量降低，因此，天麻素可以通過抑制RANKL和IL-6的表達(dá)，來抑制破骨細(xì)胞的活化，進(jìn)而減少骨量的丟失。
[0059]綜合以上表明:天麻素對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)無毒性作用，不影響細(xì)胞增殖；對(duì)H2O2造成的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)的凋亡具有保護(hù)作用；并且在其分化過程中改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)；對(duì)H2O2造成的MC3T3-E1成骨分化抑制具有保護(hù)作用；可以抑制骨吸收因子的表達(dá)，從而通過改善成骨細(xì)胞凋亡和分化抑制間接抑制破骨細(xì)胞活化來對(duì)骨質(zhì)疏松起保護(hù)作用。
[0060]5.動(dòng)物骨松模型的建立
[0061]40只8周大BALB/c雌性小鼠，體重為20_22g。本實(shí)驗(yàn)中四組小鼠的初始體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在切除卵巢前，先將它們置于實(shí)驗(yàn)室條件下I周(即通氣良好的20°C恒溫環(huán)境中，每12小時(shí)光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)。適應(yīng)I周后，用戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)進(jìn)行麻醉,小鼠被切除卵巢(去勢，η = 30)或者假手術(shù)(η = 10)。卵巢切除是通過背側(cè)入路切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)意味著手術(shù)找到雙側(cè)卵巢，但不切除，直接縫合關(guān)閉切口。小鼠被隨機(jī)分為四組:不處理組(假手術(shù)組，Sham);不處理組(單純卵巢切除組，0VX);低劑量天麻素給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予lmg/kg體重的天麻素溶液，OVX+Gastrodind));高劑量天麻素給藥組(卵巢切除后每日通過腹腔注射給予10mg/kg體重的天麻素溶液，OVX+Gastrodin (10))。天麻素溶解于去離子水中，通過腹腔注射對(duì)不處理組小鼠注射同體積去離子水。手術(shù)后I周開始給藥，連續(xù)給藥12周時(shí)間。給藥完成后，麻醉下通過心臟采血獲得血液標(biāo)本，并進(jìn)行離心。提取每只小鼠的左側(cè)股骨和第四腰椎，清除粘連的肌肉組織，妥善固定。
[0062]5.1使用脂質(zhì)過氧化物MDA檢測試劑盒檢測各組血液樣本。在脂質(zhì)過氧化過程中硫代巴比妥酸與MDA結(jié)合生成顯色復(fù)合物，其最大吸收峰在532nm，利用酶標(biāo)儀在此處讀數(shù)。同樣，使用GSH檢測試劑盒檢測各組血液樣本。GSH的檢測是根據(jù)GSH與二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)形成一個(gè)產(chǎn)物，此產(chǎn)物通過酶標(biāo)儀在412nm處讀數(shù)檢測。
[0063]結(jié)果如圖5-1A和圖5-1B所示，橫坐標(biāo)為各組的作用方式，縱坐標(biāo)分別為MDA活力和GSH活力，以各組的吸光度OD值同假手術(shù)組的OD值進(jìn)行比較的百分?jǐn)?shù)來表述。由圖可見，單純H2O2處理后，血清中的MDA水平明顯升高，GSH水平明顯降低；而給予高、低劑量天麻素處理后，血清中的MDA水平降低，GSH水平升高。圖中的#號(hào)表示:同假手術(shù)組相比，#Ρ〈0.05，##Ρ〈0.01 ;圖中的*號(hào)表示:同單純卵巢切除組相比，*Ρ < 0.05，**Ρ < 0.01。因此，天麻素可以改善血清中的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
[0064]5.2顯微CT檢測骨微結(jié)構(gòu):第四腰椎和股骨遠(yuǎn)端的骨微結(jié)構(gòu)通過探索軌跡SP預(yù)臨床標(biāo)本顯微CT進(jìn)行檢測。分辨率為8mm,管電壓為50kV,管電流為0.1mA。通過一個(gè)桌面顯微CT處理軟件進(jìn)行重建和3D定量分析。所有標(biāo)本的掃描環(huán)境和分析方法相同。股骨掃描區(qū)域限定為遠(yuǎn)端干垢端，并且向近端的初級(jí)松質(zhì)近末端區(qū)域延伸2.0mm0在排除了顱骨及尾終板區(qū)后，椎體的松質(zhì)骨區(qū)域被包含在每一個(gè)顯微CT選區(qū)中。在這些待掃描的區(qū)域中，松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨的分界為內(nèi)皮質(zhì)骨面。選定的感興趣區(qū)的3D參數(shù)用于數(shù)據(jù)分析，包括:骨礦物質(zhì)密度、連接密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度和相對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)。進(jìn)行掃描分析的操作者對(duì)標(biāo)本的處理過程單盲。
[0065]結(jié)果如圖5-2所示，分組:a:假手術(shù)組；b:單純卵巢切除組；c:卵巢切除+天麻素(lmg/kg) ；d:卵巢切除+天麻素(10mg/kg)。相對(duì)于假手術(shù)組，卵巢切除導(dǎo)致了小鼠松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的損害，表現(xiàn)為骨礦物質(zhì)密度、連接密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及相對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)的下降。同時(shí)，卵巢切除后結(jié)構(gòu)模型指數(shù)和骨小梁分離度明顯提高。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，高、低劑量天麻素給藥明顯逆轉(zhuǎn)了卵巢切除引起的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化趨勢，起到保持第四腰椎及股骨遠(yuǎn)端小梁骨骨量的作用。因此，天麻素能夠?qū)^經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)揮預(yù)防及治療作用。
[0066]5.3突光素雙標(biāo)記法檢測骨生成速率(bone format1n rate):在小鼠處死前的第12天和第2天分別肌肉注射四環(huán)素(20mg/kg)和鈣黃綠素(5mg/kg)來進(jìn)行熒光素標(biāo)記。處死小鼠后取左側(cè)股骨，依次進(jìn)行固定、脫水、包埋和切片(ΙΟμπι)。在放大200倍條件下，測定四環(huán)素標(biāo)線與鈣黃綠素標(biāo)線間的距離。得到平均距離后，再除以天數(shù)，即可確定骨生成速率。
[0067]結(jié)果如圖5-3所示，所有組中，新生骨被標(biāo)記上了四環(huán)素和鈣黃綠素?zé)晒?。相?duì)于假手術(shù)組，單純卵巢切除組的骨生成速率明顯降低。然而，高、低劑量天麻素處理后，骨生成速率明顯升高。綜上，天麻素能夠通過提高骨生成速率而起到保護(hù)松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的作用。
[0068]因此，天麻素可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是在防治骨質(zhì)疏松藥物的制備中應(yīng)用。
[0069]而天麻素是天麻中主要活性成分之一，那么含有天麻素的天麻提取物也具有相應(yīng)的應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.天麻素在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
2.含天麻素的植物提取物在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
3.天麻素在制備用于改善成骨細(xì)胞前體細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用。
4.天麻素在制備用于抗成骨細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
5.天麻素在制備用于抗成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化抑制的藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中ALP活性的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中促成骨分化基因Alp、CollaUOcn及Opn表達(dá)水平的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，天麻素在制備用于提高成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中抑制RANKL和IL-6水平的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1?8中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，天麻素的給藥量至少為lmg/kg0
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK104127425SQ201410314697
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】孟國林, 黃強(qiáng), 高博, 楊柳, 羅卓荊 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)