靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物，其是由納米脂質(zhì)體及其包被的以突變型BiK(BikDD)為目的基因的T-VISA高效特異性真核表達(dá)載體(T-VISA-BikDD)兩部分組成。本發(fā)明的納米脂質(zhì)體具有低毒、轉(zhuǎn)染效率高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，包裹基因治療質(zhì)粒T-VISA-BikDD后，能高度靶向癌細(xì)胞并高效表達(dá)目的基因，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，毒副作用低?？捎糜谥委煱ǖ幌抻诜伟?。
【專利說(shuō)明】靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種靶向抑制肺癌細(xì)胞的 基因藥物及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌（Lung cancer)，是一種源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤。目前，肺癌是 世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家位列癌癥死因首位，在我國(guó)肺癌也是 發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中超過(guò)80%為非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)，5年存活率不超過(guò)10%。傳統(tǒng)治療方法副作用大，患者的中位存活期 (Median Survival Time)不到1年。對(duì)于晚期NSCLC患者，無(wú)論是放療或綜合治療，雖然取 得了一定的治療效果，但就其療效及生存率而言，遠(yuǎn)不能令人滿意。因此，迫切需要探索高 效靶向殺滅肺癌細(xì)胞的新型藥物。
[0003] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，以及對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制等認(rèn)識(shí)的日益深化，基 因治療作為一種高效性、特異性、靶向性強(qiáng)的治療方法，越來(lái)越受到重視，已成為繼放化療 和手術(shù)治療之后極有發(fā)展前景的治療方法。但目前基因治療存在基因表達(dá)效率低，靶向 性差的缺點(diǎn)。申請(qǐng)?zhí)枺?01210063812. 1和201210064390. X中公開(kāi)一種以人端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶基因（hTERT)腫瘤特異性啟動(dòng)子，高效靶向腫瘤細(xì)胞載體T-VISA(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier, VISA)，并與多個(gè)抑癌基因或促凋亡基因（如BikDD、 PEA15、miR34等）結(jié)合，在高特異性滅殺乳腺癌、前列腺癌及肺癌等體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均取得良 好的效果。
[0004] 脂質(zhì)體作為新型基因藥物輸送載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)藥物被脂質(zhì)體包裹后，可降 低藥物毒性，減少藥物用量，可進(jìn)行靶向給藥，提高藥物療效。目前市面上商品化的脂質(zhì)體 多為普通脂質(zhì)體，在某些腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞中基本無(wú)轉(zhuǎn)染效率，更無(wú)法應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi) 做轉(zhuǎn)染研究，而且作為載體，目前使用的脂質(zhì)體靶向分布不理想，穩(wěn)定性較差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高效特異靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因治療藥物，可全身給 藥，效率高，藥效確切，毒副作用低，能特異殺滅肺癌細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述基因藥物的制備方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物，所述基因藥 物為納米脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒T-VISA-BikDD。
[0008] 其中，質(zhì)粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，或Seq ID No. 1所示 的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白的核苷酸序 列。
[0009] 所述納米脂質(zhì)體的制備方法為：將氨基甲?；懝檀寂c磷脂酰乙醇胺按1:2的 摩爾比混合，加入有機(jī)溶劑溶解，使氨基甲酰基膽固醇的濃度為1. 18mg/mL，將上述溶液置 于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，在60°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一層附著于燒瓶?jī)?nèi)壁上的脂膜；然后加入雙 蒸水，使氨基甲酰基膽固醇與磷脂酰乙醇胺的摩爾濃度為20mM/L，所得溶液經(jīng)超聲處理 5min (采用200w超聲波細(xì)胞破碎儀，超聲5s，間歇5s)，依次通過(guò)0· 45 μ m、0. 22 μ m的濾膜， 收集通過(guò)0. 22 μ m的聚碳酸酯膜濾膜的濾液即得納米脂質(zhì)體?？蓪⑺黾{米脂質(zhì)體放入潔 凈的離心管中，用氮?dú)獬涮铍x心管，將脂質(zhì)體存放于離心管中，置于4°C避光保存。
[0010] 其中，納米脂質(zhì)體的平均粒徑為l〇〇nm，所述有機(jī)溶劑為氯仿與甲醇按等體積比混 合配制。所制備的納米脂質(zhì)體可體內(nèi)外高效低毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，穩(wěn)定性好，并具有高效腫瘤靶向 的特性，可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用，用于治療肝癌、肺癌、胃癌等，應(yīng)用前景廣闊。
[0011] 本發(fā)明靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物的粒徑約為150-300nm。平均粒徑約為 244nm〇
[0012] 本發(fā)明還提供所述基因藥物的制備方法，將納米脂質(zhì)體加入到注射用水中，得到 的納米脂質(zhì)體溶液中脂質(zhì)體的濃度為8mM，另將T-VISA-BikDD質(zhì)粒加入到注射用水中使質(zhì) 粒濃度為〇. 6 μ g/ μ 1，然后將納米脂質(zhì)體溶液和T-VISA-BikDD質(zhì)粒溶液混合靜置20min， 即得。
[0013] 本發(fā)明采用薄膜分散法制備的納米脂質(zhì)體，平均直徑約為l〇〇nm，容許其穿透極細(xì) 的毛細(xì)血管并被細(xì)胞攝取。將該納米脂質(zhì)體與基因治療質(zhì)粒T-VISA-BikDD結(jié)合，可達(dá)到靶 向分布理想、1?效、低毒、穩(wěn)定性好等目的，為臨床提供一種1?效1?特異抑制腫瘤的基因藥 物。
[0014] 通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物具 有顯著的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。在體外能高效殺滅一般肺腺癌細(xì)胞系（如H1299、H1975、 H1437、H322、A549等），在裸鼠動(dòng)物模型中可抑制肺腺癌細(xì)胞H1299的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)裸鼠的生 存時(shí)間，對(duì)裸鼠行為無(wú)明顯影響，無(wú)死亡發(fā)生。
[0015] 本發(fā)明提供的包裹T-VISA-BikDD質(zhì)粒的納米脂質(zhì)體基因藥物，利用氨基甲酰基 膽固醇與磷脂酰乙醇胺按1:2的摩爾比作為制備脂質(zhì)體的主要材料，同時(shí)利用超聲波儀處 理，得到合適粒徑的空白納米脂質(zhì)體。該納米脂質(zhì)體粒徑適當(dāng)，平均粒徑約為l〇〇nm，容許其 穿透極細(xì)的毛細(xì)血管并被細(xì)胞攝取。脂質(zhì)體包裹基因或質(zhì)粒后，平均粒徑約為244nm，在體 夕卜，可安全高效轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞；在體內(nèi)，易穿過(guò)腫瘤毛細(xì)血管壁，可在腫瘤部位聚集靶向腫 瘤細(xì)胞，使其產(chǎn)生高效轉(zhuǎn)染并產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。另外，本發(fā)明采用薄膜分散法制備納米脂質(zhì) 體，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0016] 本發(fā)明的高效特異靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物，其是由納米脂質(zhì)體及其包被的 以突變型BiK(BikDD)為目的基因的T-VISA高效特異性真核表達(dá)載體（T-VISA-BikDD)兩 部分組成。本發(fā)明的納米脂質(zhì)體具有低毒、轉(zhuǎn)染效率高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，包裹基因治療質(zhì) 粒T-VISA-BikDD后，能高度靶向癌細(xì)胞并高效表達(dá)目的基因，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，毒副作用 低?？捎糜谥委煱ǖ幌抻诜伟?。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得的納米脂質(zhì)體的粒徑及其分布，其 中脂質(zhì)體即指空白納米脂質(zhì)體，TV-BiKDD脂質(zhì)體是指納米脂質(zhì)體包裹了 T-VISA-BiKDD質(zhì) 粒。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中肺癌細(xì)胞H1975和H1299轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒48h各組細(xì)胞死 亡率。
[0019] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中肺癌細(xì)胞H1975和H1299轉(zhuǎn)染不同濃度T-VISA-BikDD 質(zhì)粒48h各組細(xì)胞死亡率。
[0020] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中T-VISA-BikDD脂質(zhì)體不同轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷 作用。
[0021] 圖5-圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中活體成像儀動(dòng)態(tài)觀察裸鼠靶基因 Luciferase表達(dá) 結(jié)果；其中，A:5d，B: 14d，C:20d，D:26d，圖5是模型組，圖6是低劑量組，圖7是高劑量組；模 型組表示只尾靜脈給予注射用水的空白對(duì)照；低劑量組表示T-VISA-BIKDD劑量為15 μ g/ 只，高劑量組表示T-VISA-BIKDD劑量為30 μ g/只。
[0022] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例3中T-VISA-BikDD脂質(zhì)體在動(dòng)物模型中抑制肺癌生長(zhǎng)的示 意圖；其中，模型組表示只尾靜脈給予注射用水的空白對(duì)照；低劑量組表示T-VISA-BIKDD 劑量為15 μ g/只；高劑量組表示T-VISA-BIKDD劑量為30 μ g/只。
[0023] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例3中給予不同處理的肺癌原位裸鼠模型的生存曲線示 意圖；其中，模型組表示尾靜脈給予注射用水的空白對(duì)照；T-VISA-BIKDD治療組表示 T-VISA-BIKDD 劑量為 15 μ g/ 只。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0025] 實(shí)施例1高效特異靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物及其制備方法
[0026] 高效特異靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物，其制備方法如下：
[0027](一）納米脂質(zhì)體的制備
[0028] 1、從4°C冰箱中取出3β[Ν_(Ν'，N'-二甲基氨基乙基）]氨甲?；?膽固醇 (DC-CH0L)與二油?；字Ｒ掖及罚―OPE)，恢復(fù)至室溫，水浴加熱旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀至60°C。
[0029] 2、稱取 33mg DC-CH0L 和 99mg DOPE，放入 250mL 圓底燒瓶中。
[0030] 3、向圓底燒瓶中加入14mL氯仿和14mL甲醇。
[0031] 4、旋轉(zhuǎn)燒瓶，使其充分混合。
[0032] 5、打開(kāi)真空泵，在60°C的水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1.2h，充分除盡有機(jī)溶劑，并在燒瓶壁 上形成一層脂質(zhì)薄膜。
[0033] 6、用封口膜封住瓶口，將圓底燒瓶置于真空干燥器中，室溫下過(guò)夜，避光。
[0034] 7、向圓底燒瓶中，加雙蒸水8.8mL。室溫放置15min。
[0035] 8、在水浴超聲波清洗器（200w)中對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行超聲處理5min，再使用超聲波 細(xì)胞破碎儀（200w)超聲5min (超聲5s，間歇5s)。
[0036] 9、將所制得的脂質(zhì)體依次通過(guò)0. 45 μ m和0. 22 μ m的濾膜，最后將脂質(zhì)體放入潔 凈的離心管中，即得新型納米脂質(zhì)體。
[0037] 10、用氮?dú)獬涮铍x心管10s，可將上述制備的新型納米脂質(zhì)體存放于離心管中，置 于4°C避光保存?zhèn)溆茫ǚ乐箍諝膺M(jìn)入）。
[0038] (二）脂質(zhì)體包被質(zhì)粒T-VISA-BikDD
[0039] 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將實(shí)驗(yàn)所用試劑（納米脂質(zhì)體、質(zhì)粒溶液、PBS)在室溫放置不少于15 分鐘；取濃度為1 μ g/ μ 1的T-VISA-BikDD質(zhì)粒溶液60 μ 1 (含有60 μ g的T-VISA-BikDD 質(zhì)粒）加入裝有40 μ 1 PBS溶液的小離心管中，用移液槍頭輕輕吹打3次，混勻，得到100 μ 1 濃度為〇. 6 μ g/μ 1的T-VISA-BikDD質(zhì)粒溶液；迅速將100 μ 1稀釋后的質(zhì)粒溶液加入到 100 μ 1濃度為8mM的納米脂質(zhì)體中（用1. 5ml小離心管保存），用移液槍頭輕輕吹打3次， 混勻，得到200 μ 1的T-VISA-BikDD質(zhì)粒-納米脂質(zhì)體混合液（其中含有T-VISA-BikDD質(zhì) 粒60 μ g，濃度為0. 3 μ g/ μ 1)，混合液室溫放置20min，即得。
[0040] 最后，經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)，納米脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒后的粒徑為150nm-300nm，結(jié)果如 圖1所示。
[0041] 實(shí)施例2靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物的體外細(xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)
[0042] (一）轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞H1975和H1299實(shí)驗(yàn)
[0043] 1、分組與質(zhì)粒用量：pGL-3空載體組、CMV-BIKDD質(zhì)粒組和T-VISA-BikDD質(zhì)粒組。 每組4個(gè)復(fù)孔；質(zhì)粒用量均為0. 8 μ g，轉(zhuǎn)染時(shí)間為48h。
[0044] 2、待轉(zhuǎn)染細(xì)胞株!11975和!11299按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24h時(shí)用胰酶消化貼壁細(xì)胞，重懸于含血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 按4X 104個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0045] 3、新型納米脂質(zhì)體、pGL-3、CMV-BIKDD和T-VISA-BikDD質(zhì)粒等試劑于室溫放置 15-20min，肉眼可見(jiàn)溶液呈均勻渾濁狀但無(wú)沉淀。按一定比例混合納米脂質(zhì)體和質(zhì)粒（脂 質(zhì)體原濃度為8mM,推薦比例為脂質(zhì)體（μ 1):質(zhì)粒（μ g) = 1. 0-2. 5:1)。標(biāo)記管1 :加入 0· 8 μ g質(zhì)粒DNA到50 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻，室溫放置5min ;標(biāo)記管2 :加入1 μ 18mM脂 質(zhì)體到50 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻，室溫放置5min。迅速將管1中的液體加入到管2,上下 吹打2次后，室溫下靜置20min。
[0046] 4、將培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基去掉，加入400μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基，然后加入100μ 1質(zhì) 粒-脂質(zhì)體混合液至孔中。37 °C，5 % C02孵育4-6小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成有血清培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)并于轉(zhuǎn)染48h后使用MTT法計(jì)算各組細(xì)胞死亡率。結(jié)果見(jiàn)圖2。與空載pGL-3質(zhì)粒組相 t匕，CMV-BIKDD質(zhì)粒組和T-VISA-BikDD (即TV-BikDD)質(zhì)粒組對(duì)兩株肺癌細(xì)胞H1975\H1299 的誘導(dǎo)凋亡作用較為顯著，P〈〇. 05。
[0047] (二）不同劑量（0· 4 μ g、0. 8 μ g、l. 6 μ g)T-VISA-BikDD質(zhì)粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作 用比較
[0048] 1、分組與質(zhì)粒用量：高劑量組1. 6 μ g T-VISA-BikDD質(zhì)粒、中劑量組0. 8 μ g T-VISA-BikDD質(zhì)粒、低劑量組0. 4μ g T-VISA-BikDD質(zhì)粒。每組4個(gè)復(fù)孔；轉(zhuǎn)染時(shí)間為48h。
[0049] 2、同實(shí)驗(yàn)（一）中步驟2?4方法進(jìn)行待轉(zhuǎn)染細(xì)胞株H1975和H1299培養(yǎng)、質(zhì) 粒-脂質(zhì)體復(fù)合物的制備和轉(zhuǎn)染。由圖3可知，T-VISA-BIKDD質(zhì)粒對(duì)肺癌細(xì)胞H1975和 H1299具有不同程度的殺傷作用，且存在一定的劑量依賴關(guān)系，最佳質(zhì)粒用量為0. 8 μ g。
[0050] (三）T-VISA-BikDD脂質(zhì)體不同轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用比較
[0051] 1、分組與質(zhì)粒用量：根據(jù)轉(zhuǎn)染時(shí)間不同分為24h、48h、72h三組，每組4個(gè)復(fù)孔，質(zhì) 粒用量均為0.8 μ g。
[0052] 2、同實(shí)驗(yàn)（一）中步驟2?4方法進(jìn)行待轉(zhuǎn)染細(xì)胞株H1975和H1299培養(yǎng)、質(zhì) 粒-脂質(zhì)體復(fù)合物的制備和轉(zhuǎn)染。由圖4可知，T-VISA-BIKDD質(zhì)粒對(duì)肺癌細(xì)胞H1975和 H1299殺傷作用存在一定的時(shí)間依賴關(guān)系，48h達(dá)到最高。
[0053] 實(shí)施例3 T-VISA-BikDD脂質(zhì)體的體內(nèi)動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn) [0054] 1、肺癌細(xì)胞培養(yǎng)
[0055] 帶熒光素酶（Luciferase)基因的肺癌細(xì)胞株H1299,按照常規(guī)的方法進(jìn)行復(fù)蘇培 養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時(shí)，用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞活性>90%，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0056] 2、裸鼠肺癌原位模型的的建立
[0057] 取雌性BALB/c裸鼠，5-6周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用1% (10mg/ml)的戊巴比妥鈉 (55mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，將裸鼠置于右側(cè)臥位，四肢適當(dāng)固定。消毒左側(cè)胸壁皮膚，采 用經(jīng)皮穿刺的方式，用lml的一次性注射器將0. lml細(xì)胞濃度為IX 106/0. lml的肺癌細(xì)胞 懸液注射入裸鼠的左側(cè)肺部，注射過(guò)程中注意控制刺入針頭的深度。整個(gè)操作過(guò)程在細(xì)胞 收集后1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。
[0058] 肺癌裸鼠模型建立后，裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，每周稱量2次體 重。在注射肺癌細(xì)胞懸液后的第4天，用1%的戊巴比妥鈉（55mg/kg)腹腔注射麻醉肺癌 原位模型組裸鼠，然后腹腔注射1〇〇μ 1的D-luciferin溶液（含有D-luciferin2-3mg)， 10-15min后置于小動(dòng)物活體成像儀下檢測(cè)裸鼠肺部的熒光強(qiáng)度以確定模型是否成功。
[0059] 3、確定為肺癌原位模型的裸鼠隨機(jī)分為三組，每組數(shù)量10只。第一組為模型組， 不加藥，尾靜脈給予注射用水；第二組為低劑量組，每只尾靜脈注射含15 μ g T-VISA-BikDD 質(zhì)粒的脂質(zhì)體；第三組為高劑量組，每只尾靜脈注射含30 μ g T-VISA-BikDD質(zhì)粒的脂質(zhì)體。 每周給藥2次，每次注射間隔不少于3天，共6次。
[0060] 4、結(jié)果：T-VISA-BikDD脂質(zhì)體在動(dòng)物模型中可抑制肺癌生長(zhǎng)
[0061] 在Balb/c裸鼠中原位接種肺癌H1299細(xì)胞（H1299-luc細(xì)胞系，穩(wěn)定表達(dá) luciferase蛋白），5天后，通過(guò)尾靜脈注射T-VISA-BikDD脂質(zhì)體，每周兩次，連續(xù)三周，用 Xenogen IVIS活體成像儀動(dòng)態(tài)觀察靶基因 Luciferase表達(dá)（結(jié)果見(jiàn)圖5-7)，通過(guò)活體成 像監(jiān)測(cè)腫瘤生物信號(hào)強(qiáng)弱動(dòng)態(tài)觀察腫瘤發(fā)生發(fā)展和生存時(shí)間（結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9)。結(jié)果表 明，T-VISA-BikDD有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。
[〇〇62] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 〈110>廣州市軍科泰特醫(yī)藥科技有限公司 〈120>靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物及其制備方法 <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 7412 <212> DNA 〈213> 質(zhì)粒（T-VISA-BikDD) <400> 1 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc gcggctcgta tgttgtgtgg 180 aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccactag 240 tccgaggcct cgagatctat cgatgcatgc catggtaccc gggagctcga attcgaagct 300 tctgcagacg cgtcgacgga tccttatcga ttttaccaca tttgtagagg ttttacttgc 360 tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 420 tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 480 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 540 atcttatcat gtctgctcga agcggccggc cgccccgact ctagtcgagc ccgtaccgag 600 ctcgaattcc aggcggggag gcggcccaaa gggagatccg actcgtctga gggcgaaggc 660 gaagacgcgg aagaggccgc agagccggca gcaggccgcg ggaaggaagg tccgctggat 720 tgagggccga agggacgtag cagaaggacg tcccgcgcag aatccaggtg gcaacacagg 780 cgagcagcca tggaaaggac gtcagcttcc ccgacaacac cacggaattg tcagtgccca 840 acagccgagc ccctgtccag cagcgggcaa ggcaggcggc gatgagttcc gccgtggcaa 900 tagggagggg gaaagcgaaa gtcccggaaa ggagctgaca ggtggtggca atgccccaac 960 cagtgggggt tgcgtcagca aacacagtgc acaccacgcc acgttgcctg acaacgggcc 1020 acaactcctc ataaagagac agcaaccagg atttatacaa ggaggagaaa atgaaagcca 1080 tacgggaagc aatagcatga tacaaaggca ttaaagcagc gtatccacat agcgtaaaag 1140 gagcaacata gttaagaata ccagtcaatc tttcacaaat tttgtaatcc agaggttgat 1200 tgtcgagggc tagatctgca gaattcggct ttcacttgag cagcaggtgc aggcccccgc 1260 tgagcagcgg cagcagcagc gccagcagca gcagcagcgc cagcagcacc tgttcgcagg 1320 acacccagga cccggggttc ggggatctcc agaacctcat tatgttctcc ttaagtgtgg 1380 tgaaaccgtc catgaaactt ctaagaacat ccctgatgtc ctcagtctgg tcgtagatga 1440 aagccagacc caggctgtgc atggccacct cggagagctg ggccaggcgc ggggccctga 1500 ggctcacgtc catctcgtcc ccgatgcagg ccagccgcag ggccaatgcg tcactgccct 1560 ccatgcattc caaagaatcg aagtcctcca tagggtccag gtcctcttca tcgtcatcca 1620 tgccaagaac ctccatggtc gggggttcca ggagctgctc atacaggagg gtctccatca 1680 agatgtctct ggagaggggt cttacttcag acatggtggc aattccagca cactggcggc 1740 cgttactagt ggatctcgag acaccactcg acacggcacc agctcaatca gtcacagtgt 1800 aaaaaagggc caagtgcaga gcgagtatat ataggactgg ggatcctcta gagtcggagt 1860 actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 1920 gtcctccgag cggagtactg tcctccggac ctgcaggcat gcaagcttgt attctatagt 1980 gtcacctaaa tgagctcggt acctatcgat agagaaatgt tctggcacct gcacttgcac 2040 tggggacagc ctattttgct agtttgtttt gtttcgtttt gttttgatgg agagcgtatg 2100 ttagtactat cgattcacac aaaaaaccaa cacacagatg taatgaaaat aaagatattt 2160 tattgcggcc ggccgctcta gaaatctagc tgatatagtg tggctcaaaa ccttcagcac 2220 aaatcacacc gttagactat ctggtgtggc ccaaaccttc aggtgaacaa agggactcta 2280 atctggcagg atattccaaa gcattagaga tgacctcttg caaagaaaaa gaaatggaaa 2340 agaaaaagaa agaaaggaaa aaaaaaaaaa aaaagagatg acctctcagg ctctgagggg 2400 aaacgcctga ggtctttgag caaggtcagt cctctgttgc acagtctccc tcacagggtc 2460 attgtgacga tcaaatgtgg tcacgtgtat gaggcaccag cacatgcctg gctctgggga 2520 gtgccgtgta agtgtatgct tgcactgctg aatgcttggg atgtgtcagg gattatcttc 2580 agcacttaca gatgctcatc tcatcctcac agcatcacta tgggatgggt attactggcc 2640 tcatttgatg gagaaagtgg ctgtggctca gaaagggggg accactagac cagggacact 2700 ctggatgctg gggactccag agaccatgac cactcaccaa ctgcagagaa attaattgtg 2760 gcctgatgtc cctgtcctgg agagggtgga ggtggacctt cactaacctc ctaccttgac 2820 cctctctttt agggctcttt ctgacctcca ccatgatact aggaccccat tgtattctgt 2880 accctcttga ctctatgacc cccactgccc actgcatcca gctgggtccc ctcctatctc 2940 tattcccagc tgggtaccga gctcggatcc actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt 3000 cgcccttata tctagaggcc cctccctcgg gttaccccac agcctaggcc gattcgacct 3060 ctctccgctg gggccctcgc tggcgtccct gcaccctggg agcgcgagcg gcgcgcgggc 3120 ggggaagcgc ggcccagacc cccgggtccg cccggagcag ctgcgctgtc ggggccaggc 3180 cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc gcgctcccca cgtggcggag 3240 ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc 3300 ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc agccccctcc gggcctccca 3360 gcccccccct ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc ggcgcgagtt tcaggcagcg 3420 ctgcgtcctg ctgcgcacgt ggggcggccc tagcctcctg aaagatgaag ctactgtctt 3480 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac 3540 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa 3600 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac 3660 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt 3720 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg 3780 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata 3840 gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg 3900 tatcgccgga attcctgcag cccgggggat ccgccccccc gaccgatgtc agcctggggg 3960 acgagctcca cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg ctagacgatt 4020 tcgatctgga catgttgggg gacggggatt ccccgggtcc gagatccgcc cccccgaccg 4080 atgtcagcct gggggacgag ctccacttag acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg 4140 acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt tgggggacgg ggattccccg ggtccgagat 4200 cctctagaaa tgtcgatcga cagcttggga tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg 4260 tgacataatt ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt 4320 taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttaa attcacagtc 4380 ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt catgatcata atcagccata 4440 ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 4500 aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 4560 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 4620 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatcgcggcc gctctagaac 4680 tagtggatcg atccccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt 4740 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 4800 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4860 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 4920 cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta 4980 agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccttagcg 5040 cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 5100 gctctaaatc ggggtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 5160 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg 5220 ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag 5280 ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg 5340 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca 5400 acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 5460 gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 5520 agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatggg gggggggggg 5580 aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 5640 catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 5700 ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 5760 ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga 5820 agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 5880 cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 5940 attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag 6000 cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 6060 tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 6120 tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 6180 ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt 6240 tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 6300 ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 6360 accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 6420 ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 6480 tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta 6540 cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 6600 ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 6660 gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 6720 ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 6780 aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 6840 gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 6900 gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 6960 aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 7020 cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 7080 tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 7140 ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 7200 atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 7260 cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 7320 ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 7380 gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga ag 7412
【權(quán)利要求】
1. 一種靶向抑制肺癌細(xì)胞的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物為納米脂質(zhì)體包裹 的質(zhì)粒 T-VISA-BikDD ; 其中，質(zhì)粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示； 納米脂質(zhì)體的制備方法為：將氨基甲?；懝檀寂c磷脂酰乙醇胺按1:2的摩爾比混 合，加入有機(jī)溶劑溶解，使氨基甲?；懝檀嫉臐舛葹?. 18mg/mL，將上述溶液置于旋轉(zhuǎn)燒 瓶中，在60°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一層附著于燒瓶?jī)?nèi)壁上的脂膜；然后加入雙蒸水，使氨 基甲?；懝檀寂c磷脂酰乙醇胺的摩爾濃度為20mM/L，所得溶液經(jīng)超聲處理5min，依次通 過(guò)0. 45 μ m、0. 22 μ m的濾膜，收集通過(guò)0. 22 μ m的聚碳酸酯膜濾膜的濾液即得納米脂質(zhì)體； 其中，納米脂質(zhì)體的平均粒徑為l〇〇nm，所述有機(jī)溶劑為氯仿與甲醇按等體積比混合配制。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因藥物，其特征在于，超聲處理采用200w超聲波細(xì)胞破碎 儀，超聲5s，間歇5s。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因藥物，其特征在于，所述基因藥物的粒徑為 150_300nm。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述基因藥物的制備方法，其特征在于，將納米脂質(zhì)體加入到 注射用水中，得到的納米脂質(zhì)體溶液中脂質(zhì)體的濃度為8mM，另將T-VISA-BikDD質(zhì)粒加入 到注射用水中使質(zhì)粒濃度為0. 6 μ g/ μ 1，然后將納米脂質(zhì)體溶液和T-VISA-BikDD質(zhì)粒溶 液混合靜置20min，即得。
【文檔編號(hào)】A61K47/28GK104043133SQ201410310707
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】陳光明, 饒桂榮, 羅肇璋, 謝小明, 齊穎 申請(qǐng)人:廣州市軍科泰特醫(yī)藥科技有限公司