一種白喉疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種白喉疫苗的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中白喉疫苗生產(chǎn)周期過長(zhǎng)，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生硫酸銨污染，終產(chǎn)品雜蛋白過多，產(chǎn)品副反應(yīng)過大的問題，一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1)白喉?xiàng)U菌菌種復(fù)蘇、發(fā)酵培養(yǎng)，制備白喉菌液；2)將所述白喉菌液離心，三次過濾處理，然后進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換，從而得到白喉毒素；3)對(duì)所述白喉毒素脫毒，然后用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換；4)對(duì)脫毒的白喉毒素進(jìn)行純化。高速離心去除菌體，超濾濃縮、洗換替代活性炭吸附和硫酸銨鹽析，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟只需短短一天，簡(jiǎn)化了工藝步驟，縮短了生產(chǎn)周期，提高了生產(chǎn)效率，增加操作步驟的可控性。
【專利說明】一種白喉疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，特別是指一種白喉疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白喉疫苗由白喉?xiàng)U菌菌種制成，白喉?xiàng)U菌菌體分泌出來的毒素是單一的多肽鏈，不含糖基和輔基，蛋白質(zhì)由560個(gè)氨基酸組成，分子量為62kDa，是一種酶原，只有在蛋白酶的作用下，將其切成缺口毒素，才具有生物活性。白喉類毒素包括A、B兩個(gè)片段，其中B片段是手提結(jié)合和穿膜片段，A片段是毒性片段，通過阻抑蛋白合成中的酶活性，最終引起細(xì)胞死亡，它對(duì)遠(yuǎn)端組織和器官也可產(chǎn)生毒性，尤其是心臟及外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0003]我國(guó)目前的白喉疫苗簡(jiǎn)要生產(chǎn)過程為:菌種復(fù)蘇傳代，擴(kuò)增至一定量，上發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，所采用的產(chǎn)毒培養(yǎng)基為Pope及Ling-good培養(yǎng)基,Pope及Ling-good培養(yǎng)基均是以蛋白酶(胰酶)消化牛肉液，加入生長(zhǎng)因子制成。該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，用于白喉?xiàng)U菌培養(yǎng)都能達(dá)到較高的產(chǎn)毒水平。但缺點(diǎn)是胰酶消化牛肉蛋白的工藝復(fù)雜難以控制，且不適于大批量的生產(chǎn)，消化的牛肉蛋白各批之間差異較大，質(zhì)量難于控制，不利于后處理工藝的優(yōu)化。然后將發(fā)酵罐的培養(yǎng)物經(jīng)甲苯處理過后，收集于一個(gè)大容器，加入活性炭、硫酸銨進(jìn)行脫色，過濾收集上清液，此實(shí)驗(yàn)過程需I到2天，添加硫酸銨二次鹽析3~4天，透析去除銨離子又耗費(fèi)3~7天，然后用甲醛脫毒30~42天，透析去除甲醛3~7天，傳統(tǒng)工藝用硫酸銨鹽析沉淀蛋白的實(shí)驗(yàn)步驟較多，操作繁瑣，后處理難度較大，且生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的硫酸銨廢液，活性炭在后處理過程中有一定的殘留。經(jīng)硫酸銨沉淀獲得的白喉毒素含有較多雜蛋白，純度較差， 導(dǎo)致終產(chǎn)品的副作用較大，最主要的是生產(chǎn)一批白喉疫苗周期過長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提出一種白喉疫苗的制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中白喉疫苗生產(chǎn)周期過長(zhǎng)，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生硫酸銨污染，終產(chǎn)品雜蛋白過多，產(chǎn)品副反應(yīng)過大的問題。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]I)白喉?xiàng)U菌菌種復(fù)蘇、發(fā)酵培養(yǎng)，制備白喉菌液；
[0007]2)將所述白喉菌液離心，三次過濾處理，然后進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換，從而得到
白喉毒素；
[0008]3)對(duì)所述白喉毒素脫毒，然后用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換；
[0009]4)對(duì)脫毒的白喉毒素進(jìn)行純化。
[0010]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的具體方法:將離心除菌后的白喉菌液經(jīng)0.22 μ m — 0.1 μ m濾膜過濾，然后經(jīng)300KD中空纖維柱過濾，再用10KD的中空纖維柱進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾剩余體積為原體積的1/5時(shí)，進(jìn)行透析洗換，洗換液為0.9% NaCl溶液，洗換3~5個(gè)體積。
[0011]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟3)中脫毒是在保持pH值為7.4~7.6，添加80~150mM賴氨酸，0.4~0.6%甲醛，置35~37°C下進(jìn)行，且脫毒時(shí)間為25~45天，透析洗換是用0.9% NaCl溶液洗濾3~5個(gè)體積。
[0012]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟3)中切向流超濾系統(tǒng)是使用截留分子量為1KD的Quixstand中空纖維柱進(jìn)行超濾。
[0013]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟4)中純化方法為分子篩層析法，其中分子篩填料為 S^hacryl S-300HR。
[0014]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟I)中發(fā)酵培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L蛋白胨、2.5g/L麥芽糖、2.5ml/L乳酸，lml/L Mueller氏I號(hào)液、2ml/L Mueller氏II號(hào)液、濃度低于0.10mg/ml的鐵離子。
[0015]高速離心去除菌體，超濾濃縮、洗換替代活性炭吸附和硫酸銨鹽析，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟只需短短一天，縮短了生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率，增加操作步驟的可控性，且制品中無外源物質(zhì)引入安全性增加；采用中空纖維柱方法去除脫毒劑甲醛，時(shí)間僅為I天，縮短工藝操作時(shí)間，在封閉條件下操作，減少產(chǎn)品在空氣中暴露的時(shí)間，減少污染風(fēng)險(xiǎn)，增加了操作的安全性，純化脫毒的白喉毒素采用分子篩層析法，其中分子篩填料為Sephacryl S-300HR,由于Sephacryl S-300HR采用了親水的、剛性的烯丙基葡聚糖/雙丙烯酰胺交聯(lián)填料,具有最大回收率、最小非特異吸附，且有長(zhǎng)期的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。經(jīng)純化后的白喉毒素純度更高，雜蛋白含量更低，安全性更好。且合成培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的牛肉消化液培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單易控，不含有影響制品質(zhì)量和安全性的物質(zhì)；質(zhì)量可控的培養(yǎng)基也使發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量可控性更高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0017]圖1為本發(fā)明一種白喉疫苗的制備方法的工藝流程圖；
[0018]圖2為白喉?xiàng)U菌的生長(zhǎng)曲線圖；
[0019]圖3為白喉?xiàng)U菌的產(chǎn)毒曲線圖；
[0020]圖4為純化白喉毒素紫外監(jiān)測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]如圖1所示，一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0023]I)白喉?xiàng)U菌菌種復(fù)蘇、發(fā)酵培養(yǎng)，制備白喉菌液；
[0024]2)將所述白喉菌液離心，三次過濾處理，然后進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換，從而得到
白喉毒素；[0025]3)對(duì)所述白喉毒素脫毒，然后用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換；
[0026]4)對(duì)脫毒的白喉毒素進(jìn)行純化。
[0027]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟2)的具體方法:將離心除菌后的白喉菌液經(jīng)0.22 μ m — 0.1 μ m濾膜過濾，然后經(jīng)300KD中空纖維柱過濾，再用1KD的中空纖維柱進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾剩余體積為原體積的1/5時(shí)，進(jìn)行透析洗換，洗換液為0.9% NaCl溶液，洗換3~5個(gè)體積。
[0028]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟3)中脫毒是在保持pH值為7.4~7.6，添加80~150mM賴氨酸，0.4~0.6%甲醛，置35~37°C下進(jìn)行，且脫毒時(shí)間為25~45天，透析洗換是用0.9% NaCl溶液洗濾3~5個(gè)體積。
[0029]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟3)中切向流超濾系統(tǒng)是使用截留分子量為1KD的Quixstand中空纖維柱進(jìn)行超濾。
[0030]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟4)中純化方法為分子篩層析法，其中分子篩填料為 S^hacryl S-300HR。
[0031]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟I)中發(fā)酵培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L蛋白胨、2.5g/L麥芽糖、2.5ml/L乳酸，lml/L Mueller氏I號(hào)液、2ml/L Mueller氏II號(hào)液、濃度低于0.10mg/ml的鐵離子。
[0032]具體實(shí)施例 [0033]實(shí)驗(yàn)I)白喉?xiàng)U菌發(fā)酵培養(yǎng)
[0034]實(shí)驗(yàn)材料:
[0035]菌種:白喉?xiàng)U菌PW8株(CMCC38007)
[0036]培養(yǎng)基:采用改良的合成培養(yǎng)基:酸水解酪蛋白20g/L、蛋白胨5g/L、麥芽糖2.5g/L、乳酸2.5ml/L,Mueller氏I號(hào)液lml/L、II號(hào)液2ml/L ;培養(yǎng)液的鐵離子濃度低于0.1Omg/ml ο
[0037]補(bǔ)液:20%麥芽糖，Mueller氏1、II號(hào)液，I %谷氨酸溶液。
[0038]主要設(shè)備:50L發(fā)酵罐(上海萬(wàn)木青生物工程有限公司)
[0039]實(shí)驗(yàn)方法:
[0040]待白喉菌種復(fù)蘇，在改良液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，370C，培養(yǎng)72小時(shí)后，刮取菌膜傳液體培養(yǎng)基上搖瓶，37°C培養(yǎng)48小時(shí)。按酸水解酪蛋白20g/L、蛋白胨5g/L、麥芽糖2.5g/L、乳酸2.5ml/L配制液體培養(yǎng)基30L，調(diào)節(jié)pH值至7.6，鐵離子含量0.10mg/mL.液體培養(yǎng)基滅菌后，加入Mueller氏I號(hào)液lml/L、II號(hào)液2ml/L，按10%的菌種濃度接種搖瓶菌種，設(shè)置發(fā)酵條件:轉(zhuǎn)速250rpm、培養(yǎng)溫度35°C、pH7.8，通氣量10L/min發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)期間，控制DO維持在10%，通入氧氣量4L/min，剩余為壓縮空氣。24小時(shí)后，當(dāng)pH低于7.8時(shí)開始補(bǔ)液。補(bǔ)液速度維持在3~5ml/min。發(fā)酵過程中，每隔4個(gè)小時(shí)取樣一次，檢測(cè)菌濃度、毒素絮狀單位。
[0041]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:如圖2所示，溶解氧維持在10%左右時(shí)，白喉?xiàng)U菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌濃度也逐漸上升(吸光度值逐漸增加)，產(chǎn)毒也逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為40h時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，此時(shí)白喉菌的產(chǎn)毒能力也達(dá)到了最大值，可以進(jìn)行收獲。由結(jié)果可見，采用該工藝發(fā)酵培養(yǎng)白喉?xiàng)U菌生長(zhǎng)良好，產(chǎn)毒穩(wěn)定，產(chǎn)毒達(dá)170Lf絮狀單位以上，如圖3。
[0042]實(shí)驗(yàn)2)白喉毒素的精制[0043]實(shí)驗(yàn)材料及樣品:
[0044]過濾系統(tǒng):Durapore0.22 μ m、0.1 μ m, Millipore ；
[0045]ΒΤ300，保定蘭格恒流泵有限公司
[0046]中空纖維濾柱:UFP-500-E-4X2MA，GE;UFP-10-E_H22LA，GE
[0047]切向流處理系統(tǒng):Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE
[0048]樣品:離心處理后的收獲液，樣品量10L。
[0049]實(shí)驗(yàn)方法:
[0050]收獲的白喉菌液，首先經(jīng)離心(8000~1000rpm)去除菌體，再將收獲液經(jīng)
0.22μπι —0.Ιμπι的濾膜過濾，然后再經(jīng)300KD中空纖維過濾。通過不同孔徑的過濾處理，去除不同大小的雜蛋白及代謝產(chǎn)物。最后采用1KD的中空纖維柱進(jìn)行超濾濃縮處理，設(shè)定蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為320rmp，過膜壓力為1psi在25°C進(jìn)行超濾，當(dāng)超濾剩余體積為原體積的1/5時(shí)，進(jìn)行透析洗換，洗換液為0.9% NaCl溶液，洗換3-5個(gè)體積。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:處理樣品的回收率在90%以上，樣品的純度達(dá)2000Lf/mg，符合現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》不低于1 500Lf/mg的要求。
[0052]實(shí)驗(yàn)3)脫毒
[0053]實(shí)驗(yàn)材料及樣品:
[0054]中空纖維濾柱:UFP-10-E-H22LA，GE
[0055]切向流處理系統(tǒng):Quixstand中空纖維膜分離系統(tǒng)，GE
[0056]樣品:精致白喉毒素樣品量1L。
[0057]實(shí)驗(yàn)方法:
[0058]將精制白喉毒素稀釋至300Lf/ml,然后加入賴氨酸使其終濃度為80~150mM,再加入38%的甲醛使其終濃度分別為0.4~0.6%，調(diào)節(jié)pH至7.4~7.6，然后放置在35~37°C條件下脫毒30天。脫毒過程中，監(jiān)測(cè)pH變化，保持pH值在7.4~7.6。脫毒結(jié)束后，用1KD中空纖維超濾濃縮,然后用0.9% NaCl溶液洗濾3~5個(gè)體積,去除殘余甲醒。
[0059]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過檢測(cè)脫毒樣品，得脫毒實(shí)驗(yàn)合格，毒性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)也合格，脫毒過程樣品的損失率不超過5%。
[0060]實(shí)驗(yàn)4)白喉毒素純化
[0061]實(shí)驗(yàn)材料及樣品:
[0062]層析柱:XK16X70，GE
[0063]紫外檢測(cè)儀:HD-9707，上海精科
[0064]蠕動(dòng)泵:BT100_2J，保定蘭格恒流泵有限公司
[0065]分子篩填料:SephacrylS-300HR, GE
[0066]樣品:精致脫毒后的收獲液30ml
[0067]實(shí)驗(yàn)方法:
[0068]使用0.9% NaCl緩沖液平衡層析柱2個(gè)柱體積，采用280nm紫外檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，校正基線零點(diǎn)，取精致脫毒后的白喉類毒素溶液，以10ml/min的速度上樣。上樣結(jié)束后，用
0.9% NaCl緩沖液以10ml/min的速度進(jìn)行洗脫，收集A280處檢測(cè)得到的蛋白峰，檢測(cè)收集得到蛋白峰純度及回收率。
[0069]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:使用S-300分子篩分離脫毒后的白喉類毒溶液，可以有效去除雜蛋白，得到純度更高的白喉類毒素，紫外監(jiān)測(cè)結(jié)果見圖4。蛋白峰純度在2000Lf/mg蛋白氮，回收率90%以上。
[0070]實(shí)驗(yàn)5)吸附白喉疫苗配制
[0071]將純化后的白喉類毒素調(diào)整吸附pH值至5.0~6.0，然后加入氫氧化鋁吸附劑按白喉毒素30Lf/0.5ml (每I人次用量0.5ml)配方進(jìn)行吸附，調(diào)整氫氧化鋁含量至1.0~
1.5mg,最后調(diào)整pH值至5.8~7.2。
[0072]測(cè)定配制疫苗的效價(jià)為55IU/0.5ml，符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》的要求。
[0073]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而 已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)白喉?xiàng)U菌菌種復(fù)蘇、發(fā)酵培養(yǎng)，制備白喉菌液； 2)將所述白喉菌液離心，三次過濾處理，然后進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換，從而得到白喉毒素； 3)對(duì)所述白喉毒素脫毒，然后用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮、透析洗換； 4)對(duì)脫毒的白喉毒素進(jìn)行純化。
2.如權(quán)利要求1所述的一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于: 所述步驟2)的具體方法:將離心除菌后的白喉菌液經(jīng)0.22 μ m — 0.1 μ m濾膜過濾，然后經(jīng)300KD中空纖維柱過濾，再用1KD的中空纖維柱進(jìn)行超濾濃縮，當(dāng)超濾剩余體積為原體積的1/5時(shí)，進(jìn)行透析洗換，洗換液為0.9% NaCl溶液，洗換3~5個(gè)體積。
3.如權(quán)利要求1所述的一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于: 所述步驟3)中脫毒是在保持pH值為7.4~7.6，添加80~150mM賴氨酸，0.4~0.6 %甲醛，置35~37°C下進(jìn)行，且脫毒時(shí)間為25~45天，透析洗換是用0.9% NaCl溶液洗濾3~5個(gè)體積。
4.如權(quán)利要求1 所述的一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于: 所述步驟3)中切向流超濾系統(tǒng)是使用截留分子量為1KD的Quixstand中空纖維柱進(jìn)行超濾。
5.如權(quán)利要求1所述的一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于: 所述步驟4)中純化方法為分子篩層析法，其中分子篩填料為Sephacryl S-300HR。
6.如權(quán)利要求1所述的一種白喉疫苗的制備方法，其特征在于: 所述步驟I)中發(fā)酵培養(yǎng)采用合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L 蛋白胨、2.5g/L 麥芽糖、2.5ml/L 乳酸，lml/L Mueller 氏 I 號(hào)液、2ml/L Mueller 氏 II號(hào)液、濃度低于0.10mg/ml的鐵離子。
【文檔編號(hào)】A61K39/05GK104027797SQ201410276097
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】耿星濤, 樊可, 陶亮, 馬世勇, 許小媛, 賈福利, 劉彪, 賈濤 申請(qǐng)人:山東亦度生物技術(shù)有限公司