流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含(禽類大流行)流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體的多肽、多核苷酸、方法、組合物和疫苗。
【專利說明】流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/US2007/075585,國際申請日為2007年8月 9日，進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?200780029510. X"，發(fā)明名稱為"流感血凝素和神經(jīng)氨 酸酶變體"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 每年眾多個體感染不同品系和類型的流感病毒，因此對抗多種和不斷演化的流感 病毒株的疫苗不僅對于公共衛(wèi)生很重要，同時具有商業(yè)重要性。嬰兒、老年人、缺乏醫(yī)療條 件的人群以及免疫削弱的人群對于此類感染具有很高的致死風(fēng)險。此類流感感染的復(fù)雜性 在于新的流感病毒株容易演化并在不同物種間傳播，因此迫使新的疫苗不斷產(chǎn)生。
[0004] 近50年生產(chǎn)了數(shù)種能夠?qū)Υ祟惒煌鞲胁《?病毒株產(chǎn)生特異性保護(hù)性免疫應(yīng) 答的疫苗，包括完全病毒疫苗、分裂病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒病毒疫苗。然而，盡管任 一這些疫苗類型的合適劑型都可產(chǎn)生系統(tǒng)的免疫應(yīng)答，但減毒病毒疫苗的優(yōu)勢在于還可在 呼吸道內(nèi)刺激局部黏膜免疫。本發(fā)明人和同事為生產(chǎn)疫苗在產(chǎn)生流感病毒及其片段方面進(jìn) 行了大量工作；參見例如，2002年10月23日提交的美國申請?zhí)?0/420, 708 ;2004年5月 24日提交的60/574, 117 ;2003年4月25日提交的10/423, 828 ;2004年6月12日提交的 60/578,962 ;以及2004年6月16日提交的10/870, 690,其公開內(nèi)容納入文本作參考。
[0005] 因?yàn)椴煌鞲胁《局甑某掷m(xù)出現(xiàn)（或再現(xiàn)），因此持續(xù)需要新的流感疫苗。通常利 用新出現(xiàn)病毒株的抗原部分創(chuàng)造此類疫苗，因此，急需新的、新出現(xiàn)的或新重現(xiàn)的病毒株的 多肽和多核苷酸（尤其是抗原性基因序列）。
[0006] 本發(fā)明提供了可用于數(shù)種類型疫苗的生產(chǎn)及研究、診斷等的新的和/或新分離的 流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體。瀏覽下述內(nèi)容后還可明了其它多種益處。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明包括分離或重組多肽，其選自：SEQ ID N0:1 - SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO:21 -SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:33 -SEQ ID NO:38 編碼的任 一種多肽；SEQ ID NO: 11 -SEQ ID NO:20 或 SEQ ID NO:27 -SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO: 39 - SEQ ID NO:44編碼的任一種多肽；僅僅是編碼SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 20或 SEQ ID N0:27 -SEQ ID N0:32 或 SEQ ID N0:39 -SEQ ID N0:44 的多肽的開放閱讀框； SEQ ID N0:ll-20 或 SEQ ID N0:27-32 或 SEQ ID N0:39-44 多肽的任何可選（如，無信號 肽的成熟形式，或開放閱讀框外無5'和3'序列，或表達(dá)于病毒（如流感）表面的序列）形 式；多核苷酸序列編碼的任何多肽，該多核苷酸序列在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO:21 至 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33-38 或 SEQ ID NO:45 的多 核苷酸序列基本上全長雜交；以及，上述包含血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽序列的任何片段，或 血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽片段，優(yōu)選產(chǎn)生特異性結(jié)合本發(fā)明全長多肽的抗體的片段。在各 種實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離或重組多肽與任何上述多肽的約300個毗連氨基酸殘基基本 相同。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明所包括的分離或重組多肽中包含與任何上述多肽中相 互毗連的至少約350個氨基酸；至少約400個氨基酸；至少約450個氨基酸；至少約500個 氨基酸；至少約520個氨基酸；至少約550個氨基酸；至少約559個氨基酸；至少約565個 氨基酸；或至少約566個氨基酸基本相同的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，多肽序列（如 本文"序列"所列舉的）包含少于565、559等等個氨基酸。在此類實(shí)施方式中，較短的列舉 多肽任選含有少于565、559等等個氨基酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明多肽任選包括融合 蛋白、有前導(dǎo)序列的蛋白、前體多肽、有分泌信號或定位信號的蛋白、或有表位標(biāo)簽如E-標(biāo) 簽或His表位標(biāo)簽的蛋白。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的多肽含有與至少一條上述多 肽具有至少85 %，至少90 %，至少93 %，至少95 %，至少98 %，至少98. 5 %，至少99 %，至少 99. 2%，至少99. 4%，至少99. 6%，至少99. 8%，或至少99. 9%序列相同性的序列。本發(fā)明 血凝素序列能同時含有具有未修飾或修飾的多堿性切割位點(diǎn)（從而使病毒在雞蛋中生長） 的序列。血凝素多肽序列SEQ ID勵5:11、13、15、17、19、27、29、31、39、41或43含有內(nèi)源性 氨基端信號肽序列，然而，本發(fā)明血凝素多肽序列也含有血凝素多肽的成熟（氨基端信號 肽已切割）形式。利用本領(lǐng)域任何數(shù)種方法可常規(guī)測定并預(yù)測任何流感病毒株的任何血凝 素多肽序列的切割位點(diǎn)。
[0009] 在其它方面，本發(fā)明包括具有上文所列舉的一種或多種多肽或其片段的組合物。 本發(fā)明也包括與多克隆抗血清特異性結(jié)合的多肽，所述多克隆抗血清抗含有至少一種上文 所述氨基酸序列或其片段的抗原。此類對上述多肽具有特異性的抗體也是本發(fā)明的特點(diǎn)。 本發(fā)明的多肽任選具有免疫原性。
[0010] 本發(fā)明也包括免疫原性組合物，該免疫原性組合物含有一種或多種上文所述免疫 有效量多肽，以及對個體給予生理上可接受載體中的任何上述免疫有效量多肽以產(chǎn)生對抗 流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。
[0011] 此外，除了含有此類免疫有效量的重組流感病毒的免疫原性組合物之外，本發(fā)明 還包括含有上述一種或多種多肽或多核苷酸的重組流感病毒。通過給予生理上可接受載體 中的此類重組免疫病毒以刺激個體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法也 是本文的一部分。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明包括分離或重組核酸，所述分離和重組核酸選自：多核苷酸序 列 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO:21 至 SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:33 至 SEQ ID NO: 38,或SEQ ID N0:45(或其互補(bǔ)序列），編碼多肽SEQ ID NO: 11 至SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO:27 至 SEQ ID NO:32 或 SEQ ID NO:39 至 SEQ ID NO:44(或其互補(bǔ)多核苷酸 序列）的任何多核苷酸序列，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述任何多核苷酸序列全長基本雜交的 多核苷酸序列，和包含此類多核苷酸序列的全部或片段的多核苷酸序列，其中優(yōu)選編碼血 凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽或血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽片段的序列。本發(fā)明也包括分離或重組 核酸，所述分離或重組核酸編碼的氨基酸序列與上述核酸編碼的任何多肽至少約300個氨 基酸基本相同，或與上述核酸編碼的多肽至少約350個氨基酸；至少約400個氨基酸；至少 約450個氨基酸；至少約500個氨基酸；至少約502個氨基酸；至少約550個氨基酸；至少 約559個氨基酸；至少約565個氨基酸；至少約566個氨基酸基本相同。此外，在氨基酸長 度少于如566、565、559等的情況下（參見例如，"序列"），應(yīng)理解的是長度任選小于566、 565、559等。本發(fā)明也包括上述任何編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽、或一種或多種血凝素 或神經(jīng)氨酸酶多肽的一個或多個片段的核酸。本發(fā)明的其它方面包括編碼多肽（任選血凝 素或神經(jīng)氨酸酶多肽）的分離或重組核酸，其序列與上述至少一種多核苷酸具有至少98% 相同性，至少98. 5%相同性，至少99%相同性，至少99. 2%相同性，至少99. 4%相同性，至 少99. 6%相同性，至少99. 8%相同性，或至少99. 9%相同性。本發(fā)明還包括通過突變或重 組一種或多種上述多核苷酸序列而產(chǎn)生的編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽的分離或重組核 酸。本發(fā)明的多核苷酸序列能優(yōu)選包括，如前導(dǎo)序列、前體序列或表位標(biāo)簽序列或類似物中 的一種或多種，并可任選編碼融合蛋白（如，具有一種或多種其它序列）。
[0013] 在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有上述兩種或多種核酸的組合物（如，包含 至少約2、5、10、50或更多種核酸的文庫）?？扇芜x通過切割（如，機(jī)械切割、化學(xué)切割或利 用限制性核酸內(nèi)切酶/RNA酶/DNA酶酶解等）一種或多種上述核酸生產(chǎn)此類組合物。本發(fā) 明的其它組合物包括，如在三磷酸脫氧核糖核苷酸和熱穩(wěn)定性核酸聚合酶的存在下將一種 或多種上述核酸孵育產(chǎn)生的組合物。
[0014] 本發(fā)明還包括含有至少一種上述核酸或其切割或擴(kuò)增片段或其產(chǎn)物的細(xì)胞。此 類細(xì)胞可任選表達(dá)此核酸編碼的多肽。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括含有任何上述核酸的 載體（如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、病毒片段等）。此類載體任選包括表達(dá)載體。本發(fā)明 優(yōu)選的表達(dá)載體包括但不限于：含有POl I啟動子和終止子序列的載體或使用POl I和 ρο? Π 啟動子"poll/polll 啟動子系統(tǒng)"的載體（如 Zobel 等，Nucl. Acids Res. 1993， 21:3607 ;US20020164770 ;Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA1999,96:9345 ;Fodor 等， J. Virol. 1999,73:9679 ;和US20030035814)。被此類載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也在當(dāng)前發(fā)明的范圍 內(nèi)。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有一種或多種上述核酸（如編碼血凝素和/或 神經(jīng)氨酸酶的核酸）或其一種或多種片段的病毒（如流感病毒）。包含此類病毒的免疫原 性組合物也是本發(fā)明的一部分。此類病毒能包含重配病毒，如6:2重配病毒（如，含有來自 一種或多種供體病毒的6個基因編碼區(qū)和來自一種或多種任選含有血凝素和/或神經(jīng)氨 酸酶的上述核苷酸序列（或其一種或多種片段）的2個基因編碼區(qū)）。本發(fā)明的重配病毒 (任選活病毒）可包含一種或多種如冷敏感、冷適應(yīng)性或減毒的供體病毒。例如，重配病毒 可包含如A/Ann Arbor/6/60，PR8等。本發(fā)明的重配病毒可排除A/Ann Arbor/6/60。本發(fā) 明的一個優(yōu)選實(shí)施方式是重配流感病毒，其中病毒為6:2重配流感病毒并包含來自A/Ann Arbor/6/60的6個基因編碼區(qū)以及編碼選自SEQ ID N0:ll-20、SEQ ID N0S:27-32和SEQ ID N0S:39-44的多肽的2個基因編碼區(qū)。在一個備選實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配流感病毒 包括6:2重配流感病毒，其中所述病毒含有來自除A/Ann Arbor/6/60外的一種或多種供 體病毒的6個基因編碼區(qū)以及編碼選自SEQ ID N0S:11-20、SEQ ID N0S:27-32和SEQ ID NOS: 39-44的多肽的2個基因編碼區(qū)。在另一備選實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配流感病毒包含 6:2重配流感病毒，其中所述病毒含有來自除A/Ann Arbor/6/60外的一種或多種供體病毒 的6個基因編碼區(qū)以及來自任何大流行流感病毒株的HA或NA多肽的2個基因編碼區(qū)。在 允許核酸表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有流感病毒的宿主細(xì)胞制造重組流感病 毒并從一種或多種宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離重組流感病毒的方法也是本發(fā)明的一部分。
[0016] 在本文其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括免疫有效量的含有上述任何重組流感病毒的 免疫原性組合物。其它實(shí)施方式包括通過給予免疫有效量的任何上述重組流感病毒（任選 在生理上有效的載體中）刺激免疫個體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對抗流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的 方法。
[0017] 本發(fā)明的其它方面包括在允許核酸表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述任 何宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生分離或重組多肽以及從一種或多種宿主細(xì)胞或細(xì)胞生長培養(yǎng)基中分 離多肽的方法。
[0018] 免疫原性組合物也是本發(fā)明特征。例如，包含任何一種或多種上述多肽和/或核 酸以及任選賦形劑（如藥學(xué)上可接受的賦形劑）或一種或多種藥學(xué)上可接受給藥組分的免 疫原性組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物也能包含任何一種或多種上述病毒（如，與一種 或多種藥學(xué)上可接受的給藥組分一起）。
[0019] 通過對個體給予有效量的任何上述病毒（或免疫原性組合物）在個體中產(chǎn)生免疫 原性反應(yīng)的方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，通過給予一定量的一種或多種上述病毒（或免 疫原性組合物）以有效產(chǎn)生對抗病毒感染的免疫原性反應(yīng)，從而在個體中預(yù)防或治療病毒 感染（如病毒性流感）也在本發(fā)明范圍內(nèi)。此類治療的個體包括哺乳動物（如人）。此類 方法也包括對個體體內(nèi)給藥以及對個體的一種或多種細(xì)胞體外或離體給藥。此外，此類方 法還包括給予含有病毒和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，以一定量給予個體從而有效預(yù) 防或治療病毒感染。
[0020] 在其它方面，本發(fā)明包括含有編碼一種或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神 經(jīng)氨酸酶多肽的核酸序列以及編碼一種或多種A/Ann Arbor/6/60多肽的核酸序列的組合 物。此外，本發(fā)明包括含有編碼一種或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多 肽的核酸序列以及編碼一種或多種PR8或A/Ann Arbor/6/60多肽的核酸序列的組合物。此 類序列能包括本文"序列"所列舉的那些。此外，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式包括含有編碼一種 或多種大流行流感病毒株血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多肽的核酸序列以及在6:2重配株中編 碼所選主體（backbone)病毒株的核酸序列的組合物。此類組合物優(yōu)選包括選自本文"序 列"中編碼血凝素和神經(jīng)氨酸酶的序列以及主體病毒株，其中主體病毒株為PR8或A/Ann Arbor/6/60。本發(fā)明也包括如上所述的此類組合物，其中血凝素包含修飾的多堿性切割位 點(diǎn)。本發(fā)明也包括含有上述組合物的減毒的活流感疫苗。
[0021] 參照附圖和附錄閱讀以下詳述后，將完全明白本發(fā)明的這些和其它目的和特征。
[0022] 附圖簡要說明
[0023] 圖1 :顯示對VN/1203/2004的HA基因進(jìn)行工程改造修飾，以移除多堿性切割位 點(diǎn)。
[0024] 圖2 :顯示鼻內(nèi)給予H5N1 ca重配病毒在雞內(nèi)不復(fù)制的結(jié)果。
[0025] 圖3 :顯示H5N1/AA ca候選疫苗對小鼠不致死。
[0026] 圖4 :顯示1997和2004H5Nlca重配病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制受限。
[0027] 圖5 :顯示重配的H5N1/AA ca流感病毒在小鼠肺部復(fù)制受限。
[0028] 圖6 :顯示小鼠單次鼻內(nèi)疫苗給藥后得到血清HAI Ab滴度。
[0029] 圖7 :顯示小鼠單次鼻內(nèi)疫苗給藥后得到血清中和Ab滴度。
[0030] 圖8 :顯示H5Nlca重配病毒在用50、500或5000LD5(I野生型H5N1病毒的致死性刺 激中保護(hù)小鼠。
[0031] 圖9 :顯示對同源和異源H5N1刺激病毒在小鼠肺部復(fù)制的保護(hù)功效。
[0032] 圖10 :顯示對同源和異源H5N1刺激病毒在小鼠上呼吸道復(fù)制的保護(hù)功效。
[0033] 圖11 :顯示在小鼠中2004H5Nlca疫苗對抗高劑量（IO5TCID5ci)同源或異源H5Nlwt 病毒刺激的保護(hù)功效。
[0034] 圖12 :顯示在小鼠中1997和2003H5Nlca疫苗對抗高劑量（IO5TCID5ci)同源或異源 H5N1野生型病毒刺激的保護(hù)功效。
[0035] 圖13 :顯示在小鼠中2004H5Nlca疫苗對抗低或高劑量（IO5TCID5ci)同源H5N1野生 型病毒刺激的保護(hù)功效。
[0036] 圖14 :顯示對A/Netherland/219/03HA的HA基因進(jìn)行工程改造修飾，以移除多堿 性切割位點(diǎn)。
[0037] 圖15 :H5Nlca疫苗在小鼠中引發(fā)血清中和抗體的滴度。在每一劑量疫苗給藥前 (放血前（prebleed))和28天后收集血清；未檢測到的滴度指定值為10。
[0038] 圖16 :H6ca病毒在雪貂中減毒。*肺EID5Q/g ;鼻甲PFU/g。鼻內(nèi)接種IO7TCID5tl，感 染后第3天收集組織。
[0039] 圖17 :H6ca疫苗在雪貂中的免疫原性。
[0040] 圖18(a)和18(b) :H6ca疫苗在雪貂中的功效。在肺部（a)和鼻甲（b)內(nèi)檢測病 毒滴度。疫苗：單次給藥71og1(lPFU。刺激 ：71og1(lPFU ;刺激后三天。
[0041] 圖19 :H7N3BC04ca病毒在雪貂中減毒。接種物：0. 5mL107TCID5Q鼻內(nèi)接種。在感 染后第3天收集組織。
[0042] 圖20 :H7N3BC2004ca在小鼠中具有免疫原性。a :抗ck/BC/CN-6/04wt的血清中和 抗體滴度的倒數(shù)幾何均值。b :p〈0. 05 (曼恩-惠特尼U檢驗(yàn)）（Mann-Whitney U-test)，與 感染28天后的中和滴度相比。。
[0043] 圖21 (a) -21⑴：小鼠體內(nèi)H7N3BC04ca有效對抗H7病毒的致死刺激。對抗 50LD5(lA/ck/BC/CN-7/04致死刺激的功效：單次免疫四周后（a)，單次免疫八周后（b)，或兩 次免疫八周后（2次給藥相隔四周）（c)。對抗50LD 5(lA/NL/219/03致死刺激的功效：單次 免疫四周后（d)，單次免疫八周后（e)，或兩次免疫八周后（2次給藥相隔四周）（f)。對抗 50LD 5(lA/tk/Eng/63致死刺激的功效：單次免疫四周后（g)，單次免疫八周后（h)，或兩次免 疫八周后（2次給藥相隔四周）（i)。
[0044] 圖22(a)和（b) :H7N3BC04ca疫苗在小鼠中有效。8周時在（a)鼻甲和（b)肺部 測定病毒滴度。
[0045] 圖23(a)和（b) :H9N2G9/AA ca在雪貂中減毒。在（a)鼻甲和（b)肺部測定病毒 滴度。
[0046] 圖24(a)和（b) :H9N2ca疫苗在小鼠中的功效。
[0047] 圖25 :健康成人中H9N2G9/AA ca的復(fù)制高度受限。
[0048] 圖26 :健康成人中對107_°TCID5QH9N2G9/AA ca的HI抗體應(yīng)答。
[0049] 圖27 :健康成人中H5N1VN2004A/AA ca的復(fù)制高度受限。
[0050] 圖28 :健康成人中對106 7TCID5QVN2004A/AA ca的HI抗體應(yīng)答。
[0051] 發(fā)明詳述
[0052] 本發(fā)明包括流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶多肽和多核苷酸序列，以及包含此類序列的 載體、組合物等和其使用方法。本發(fā)明的其它特點(diǎn)在此詳述。
[0053] 定義
[0054] 除非另有說明，本文所用的一切技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】一般技術(shù) 人員通常理解的含義相同。下列定義作為對本領(lǐng)域定義的補(bǔ)充，并指導(dǎo)本發(fā)明，并不需要?dú)w 因于任何相關(guān)或不相關(guān)的場合，如任何共有的專利或申請。盡管任何與本發(fā)明所述類似或 等同的方法和材料可用于實(shí)踐測試本發(fā)明，但本文描述了優(yōu)選的材料和方法。因此，本文所 用術(shù)語僅出于描述特定實(shí)施方式的目的，而不是限制本發(fā)明。
[0055] 除非另有清楚指示，本說明和附加權(quán)利要求所使用的單數(shù)形式"一種"、"一個"和 "那"包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，提及"一個病毒"包括多數(shù)病毒；提及"一種宿主細(xì)胞" 包括宿主細(xì)胞的混合物。
[0056] 依照上下文，"氨基酸序列"是氨基酸殘基的聚合物（蛋白質(zhì)、多肽等）或代表氨基 酸聚合物的字符串。
[0057] 依照上下文，術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"指單鏈或 雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、嵌合體或其類似物。如本文所用術(shù)語任選包括 天然產(chǎn)生核苷酸的類似物的聚合物，其具有天然核苷酸的本質(zhì)屬性，能夠與單鏈核酸以與 天然產(chǎn)生核苷酸（如肽核酸）類似的方式雜交。除非另有指示，本發(fā)明特定的核酸序列不 僅包括明確指示的序列，還任選包括互補(bǔ)序列?？蓮娜魏沃付ǘ嗪塑账嵝蛄写_定給定核酸 或互補(bǔ)多核苷酸序列（如，互補(bǔ)核酸）。
[0058] 術(shù)語"核酸"或"多核苷酸"也包含任何單體單位的物理字符串，能與核苷酸串對 應(yīng)，包括核苷酸聚合物（如，典型的DNA或RNA聚合物）、PNA、修飾的寡核苷酸（如，含有溶 液中非典型生物學(xué)RNA或DNA的寡核苷酸，如2' -0-甲基寡核苷酸）等。核酸可以是單鏈 或雙鏈。
[0059] "亞序列"是整條序列的任何部分，直至并包含完整序列。通常，亞序列短于全長序 列。"獨(dú)特亞序列"指未在先前測定的任何流感多核苷酸或多肽序列中發(fā)現(xiàn)的亞序列。
[0060] 關(guān)于多肽的術(shù)語"變體"指與參考序列比較改換了一個或多個氨基酸的氨基酸序 列。變體能具有"保守"變換，其中替換的氨基酸具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用異亮氨酸 替換亮氨酸?；蛘?，變體能具有"非保守"變換，如，用色氨酸替換甘氨酸。相似的小變化也 可包括氨基酸缺失或插入或兩者均有。利用本領(lǐng)域熟知計算機(jī)程序可指導(dǎo)測定哪些氨基酸 殘基可被替換、插入或缺失而不破壞生物學(xué)或免疫學(xué)活性，例如，DNASTAR軟件。保守取代 的例子也在本文有所描述。
[0061] 術(shù)語"基因"廣泛用于指任何具有生物學(xué)功能的核酸。因此，基因包括編碼序列和 /或其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"基因"應(yīng)用于特定的基因組序列，以及該基因組序列編 碼的CDNA或mRNA。
[0062] 基因也包括非表達(dá)核酸區(qū)段，例如，形成其它蛋白的識別序列的區(qū)段。非表達(dá)調(diào)節(jié) 序列包括"啟動子"和"增強(qiáng)子"，調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，導(dǎo)致毗鄰或相近序列的轉(zhuǎn) 錄。"組織特異性"啟動子或增強(qiáng)子是在特定組織類型或細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動子或增 強(qiáng)子。
[0063] 如上下文所指示，"基因表達(dá)"或"核酸表達(dá)"指將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA (任選包括RNA 的修飾，如剪接）、將RNA翻譯為多肽（可能包括后續(xù)多肽修飾，如，翻譯后修飾），或同時轉(zhuǎn) 錄和翻譯。
[0064] "開放閱讀框"或"0RF"是DNA或RNA (如基因）的可能翻譯閱讀框架，它可被翻譯 成為多肽。即，開放框架不被終止密碼子打斷。然而，值得注意的是術(shù)語ORF未必表示該多 核苷酸實(shí)際翻譯為多肽。
[0065] 術(shù)語"載體"指在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞組件間增殖和/或轉(zhuǎn)移核酸所采用的方法。 載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、前病毒（pro-virus)、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等，它們自 我復(fù)制并能整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的染色體。載體也可為裸露RNA多核苷酸、裸露DNA多核苷 酸、在同一鏈內(nèi)含有DNA和RNA的多核苷酸、多聚賴氨酸偶聯(lián)的DNA或RNA、肽偶聯(lián)的DNA或 RNA、脂質(zhì)體偶聯(lián)的DNA或類似物質(zhì)，它們不進(jìn)行自主復(fù)制。在許多但非全部的一般實(shí)施方 式中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。
[0066] "表達(dá)載體"是能夠促進(jìn)摻入其中的核酸表達(dá)及復(fù)制的載體，如質(zhì)粒。通常，要表達(dá) 的核酸"可操作性的連接于"啟動子和/或增強(qiáng)子，并受啟動子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控 制。
[0067] "雙向表達(dá)載體"特征在于兩個供選啟動子從位于兩個啟動子之間的核酸的相反 方向出發(fā)，因此可從兩個方向起始表達(dá)，導(dǎo)致如正（+)或有義鏈和負(fù)（-)或反義鏈RNA的轉(zhuǎn) 錄。
[0068] "多肽"是含有兩個或多個氨基酸殘基（如肽或蛋白）的聚合物。聚合物任選包含 修飾如糖基化等。多肽的氨基酸殘基可為天然或非天然的，并且可為未取代、未修飾、取代 或修飾的。
[0069] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"分離的"指生物學(xué)材料，如病毒、核酸或蛋白，基本脫 離通常伴隨的或天然產(chǎn)生的環(huán)境相互作用的組分。分離的生物學(xué)材料任選包含在天然環(huán)境 中未發(fā)現(xiàn)與該生物學(xué)材料伴隨的其它材料，如細(xì)胞或野生型病毒。例如，若材料在其自然環(huán) 境中，如細(xì)胞，可將材料置于細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)此材料的環(huán)境位置（如基因組或遺傳元件）。例 如，如果通過非天然產(chǎn)生的方法將其引入基因組（如載體，如質(zhì)?；虿《据d體，或擴(kuò)增子） 中非該核酸本來的座位時，該天然產(chǎn)生的核酸（如編碼序列、啟動子、增強(qiáng)子等）就成為分 離的。此類核酸也稱作"異源"核酸。例如，分離的病毒是所處環(huán)境（如，細(xì)胞培養(yǎng)體系或 純化自細(xì)胞培養(yǎng)物）并非野生型病毒的本來環(huán)境（如感染個體的鼻咽腔）的病毒。
[0070] 當(dāng)術(shù)語"嵌合"或"嵌合物"涉及病毒時，表明該病毒包括源自一種以上親本病毒 株或來源的遺傳和/或多肽組分。同樣，術(shù)語"嵌合"或"嵌合物"涉及病毒蛋白時，表明該 蛋白包括源自一種以上親本病毒株或來源的多肽組分（即氨基酸亞序列）。
[0071] 術(shù)語"重組體"指該材料（如核酸或蛋白）由人干涉被人工地或合成地（非天然） 改變?？稍谠摬牧系奶烊画h(huán)境或狀態(tài)，或?qū)⒉牧蠌闹幸瞥觯M(jìn)行改變。詳細(xì)說，例如，當(dāng)通過 重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生流感病毒時，該流感病毒是重組的。例如，"重組核酸"是通過將核酸重 組產(chǎn)生的，例如，通過克隆、DNA重排或其它步驟，或通過化學(xué)或其它誘變產(chǎn)生的；"重組多 肽"或"重組蛋白質(zhì)"是通過重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生的；"重組病毒"，如，重組流感病毒是通過 重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生。
[0072] 當(dāng)術(shù)語"重配"涉及病毒時，表明該病毒包含源自一種以上親本病毒株或來源的遺 傳和/或多肽組分。例如，7:1重配株包含源于第一個親本病毒的7個病毒基因組區(qū)段（或 基因區(qū)段）以及一個補(bǔ)充性病毒基因組區(qū)段，如，編碼本發(fā)明血凝素或神經(jīng)氨酸酶的區(qū)段。 6:2重配株包含6個基因組區(qū)段，最常見的來自第一親本病毒的6個內(nèi)部基因以及兩個補(bǔ)充 區(qū)段，如，來自不同親本病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶。
[0073] 當(dāng)術(shù)語"引入"涉及異源或分離的核酸時，指將核酸摻入真核或原核細(xì)胞中，其中 核酸可被摻入到細(xì)胞的基因組中（如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子， 或者瞬時表達(dá)（如轉(zhuǎn)染mRNA)。該術(shù)語包含此類方法如"感染"、"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"。 在本發(fā)明的上下文中，可使用多種方法將核酸引入細(xì)胞中，包括電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì) 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染（脂轉(zhuǎn)染）（Iipofection)等。
[0074] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"指含有異源核酸如載體，并支持核酸的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌（E. coli)，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲、兩棲類、鳥類或 哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。示范性宿主細(xì)胞可包括例如Vero (非洲綠猴腎）細(xì)胞、BHK (幼 倉鼠腎）細(xì)胞、原代雞腎（PCK)細(xì)胞、Madin-Darby狗腎（MDCK)細(xì)胞、Madin-Darby牛腎 (MDBK)細(xì)胞、293細(xì)胞（如293T細(xì)胞）和COS細(xì)胞（如C0S1、C0S7細(xì)胞）等。
[0075] 流感病毒的"免疫有效量"是足以提高個體（如人）自身對隨后接觸流感病毒產(chǎn) 生免疫應(yīng)答的用量?？蓹z測誘導(dǎo)免疫水平，如通過檢測中和分泌和/或血清抗體的量，如通 過空斑中和、補(bǔ)體固定、酶聯(lián)免疫吸附或微中和實(shí)驗(yàn)來檢測。
[0076] 對抗病毒的"保護(hù)性免疫應(yīng)答"指經(jīng)過疾病防護(hù)的個體后續(xù)暴露于和/或被此類 流感病毒感染時，個體（如人）展示的免疫應(yīng)答。在一些例子中，流感病毒（如天然循環(huán)） 仍能引起感染，但不能引起嚴(yán)重感染。通常，保護(hù)性免疫應(yīng)答使得宿主產(chǎn)生血清和分泌抗體 水平可檢測到，所述宿主產(chǎn)生血清和分泌抗體能體外和體內(nèi)中和同一病毒株和/或亞組的 病毒（也可能為不同的、非疫苗株和/或亞組）。
[0077] 本文所用"抗體"為包含一個或多個完全或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白 基因片段編碼的多肽的蛋白。認(rèn)可的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、 Υ、δ、ε和μ恒 定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為Υ、μ、α、δ 或ε，進(jìn)而分別定義了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白（抗 體）結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每一四聚體由兩對同樣的多肽鏈對組成，每對具有一條"輕"鏈 (約25kD)和一條"重"鏈（約50-70kD)。每一條鏈的N末端定義了約100-110個或更多 氨基酸的可變區(qū)，它們主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語輕鏈可變區(qū)（VL)和重鏈可變區(qū)（VH)分別 指這些輕鏈和重鏈?？贵w以免疫球蛋白的形式或以不同肽酶消化產(chǎn)生的明確的數(shù)個片段的 形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區(qū)二硫連接以下消化抗體產(chǎn)生F(ab)'2，F(xiàn)(ab)'2是 Fab二聚體，本身是通過二硫鍵與VH-CHl連接的輕鏈。在緩和條件下還原F (ab) ' 2打斷絞 鏈區(qū)的二硫連接從而將（Fab'）2二聚體轉(zhuǎn)化成為Fab'單體。Fab'單體實(shí)質(zhì)上是具有部分 絞鏈區(qū)的Fab (參見《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology)，W. E. Paul編，紐約瑞文出版 社（Raven Press) (1999)，其中有關(guān)于其它抗體片段更詳細(xì)的描述）。既然通過消化完整抗 體定義不同的抗體片段，熟練技術(shù)人員意識到可通過化學(xué)或重組DNA方法全新合成此Fab' 片段。因此，本文所用術(shù)語抗體包含抗體或通過完整抗體修飾的或使用重組DNA方法全新 合成的片段?？贵w包括，如，多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，單鏈抗體包括單鏈 Fv (sFv或scFv)抗體,其中可變的重鏈和可變的輕鏈連接在一起（直接或通過肽接頭），形 成連續(xù)多肽，以及人源化或嵌合抗體。
[0078] 流感病毒
[0079] 本發(fā)明的多肽和多核苷酸，如SEQ ID NO :1-45,為流感HA和NA序列的變體。通 常，流感病毒由含區(qū)段化單鏈RNA基因組的內(nèi)部核蛋白核心以及由基質(zhì)蛋白排列成的外部 脂蛋白包膜組成。流感病毒基因組由8段線性（-)鏈核糖核酸（RNA)和6個內(nèi)部核心多肽 組成，所述核糖核酸編碼免疫原性血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)蛋白，所述內(nèi)部核心多肽 是：核衣殼核蛋白（NP);基質(zhì)蛋白（M);非結(jié)構(gòu)蛋白（NS);和3個RNA聚合酶（PA、PB1、PB2) 蛋白。復(fù)制過程中，基因組RNA在宿主細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄成為（+)鏈信使RNA和（-)鏈基因組 cRNA。8個基因組區(qū)段中的每一個都包裝成為核糖核蛋白復(fù)合物，其中除了 RNA外還含有 NP和聚合酶復(fù)合物（PB1、PB2和PA)。
[0080] 流感通常分為甲型流感和乙型流感。每一甲型流感和乙型流感病毒均含有8段具 負(fù)極性的單鏈RNA。甲型流感基因組編碼11個多肽。區(qū)段1-3編碼3個多肽，組成RNA-依 賴性RNA聚合酶。區(qū)段1編碼聚合酶復(fù)合物蛋白PB2。剩下的聚合酶蛋白PBl和PA分別由 區(qū)段2和區(qū)段3編碼。此外，某些流感株的區(qū)段1編碼小蛋白PB1-F2,由PBl編碼區(qū)內(nèi)的另 一閱讀框產(chǎn)生。區(qū)段4編碼在感染過程中參與細(xì)胞粘附和進(jìn)入的血凝素（HA)表面糖蛋白。 區(qū)段5編碼與病毒RNA關(guān)聯(lián)的主要結(jié)構(gòu)組分，核衣殼核蛋白（NP)多肽。區(qū)段6編碼神經(jīng)氨 酸酶（NA)包膜糖蛋白。區(qū)段7編碼兩個基質(zhì)蛋白Ml和M2,它們由差異剪接的mRNA翻譯。 區(qū)段8編碼兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2,它們由另路剪接的mRNA變體翻譯。乙型流感的8 個基因組區(qū)段編碼11個蛋白。三個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。區(qū) 段4編碼HA蛋白。區(qū)段5編碼NP。區(qū)段6編碼NA蛋白和NB蛋白。蛋白質(zhì)NB和NA均由 順反子mRNA的交疊閱讀框翻譯而來。乙型流感的區(qū)段7也編碼兩個蛋白：Ml和BM2。最小 區(qū)段編碼兩個產(chǎn)物：NSl翻譯自全長RNA，而NS2翻譯自剪接mRNA變體。
[0081] 流感病毒疫苗
[0082] 本文的序列、組合物和方法主要但非只關(guān)于產(chǎn)生流感病毒疫苗。歷史上，首先使用 選擇或基于經(jīng)驗(yàn)預(yù)測的相關(guān)株的病毒株在含胚雞蛋中產(chǎn)生流感病毒疫苗。最近，在一種批 準(zhǔn)的減毒溫度敏感型主株中合并所選血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抗原產(chǎn)生重配病毒。在雞蛋 中將病毒培養(yǎng)物傳代數(shù)次后，回收病毒并任選滅活病毒，如使用甲醛和/或β -丙內(nèi)酯滅活 (或用于減毒的活疫苗）。因此，將認(rèn)識到HA和NA序列（如，SEQ ID NO :1-45)在構(gòu)建流 感疫苗時尤其有用。本發(fā)明包括含有大流行流感株HA和/或NA序列的病毒/疫苗（包括 其中HA序列含有修飾的多堿性切割位點(diǎn)，如本文所述修飾）；并包括其中病毒/疫苗含有 ca主體如A/AA/6/60或PR8主體。
[0083] 在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組和重配疫苗的嘗試受阻的原因是一些批準(zhǔn)用于疫苗生 產(chǎn)的病毒株無法在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下有效生長。然而，發(fā)明人和同事先前的工作提供了 一種在培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組和重配病毒的載體系統(tǒng)及方法，因此，使快速生產(chǎn)對應(yīng)一種或多 種所選抗原性病毒株的疫苗成為可能，如，A或B株，不同亞型或亞株等，如，含有本文HA 和/或NA序列。參見，用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)（Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus)，2002 年 10 月 23 日提交的美國申請?zhí)?60/420,708, 2003年4月25日提交的美國申請?zhí)?0/423,828,以及2004年5月24日提交的美國申請?zhí)?60/574, 117。通常，將培養(yǎng)物維持于恒溫器控制的恒溫（使溫度不超過35°C )、濕度和CO2控 制系統(tǒng)中，如細(xì)胞培養(yǎng)箱。通過將對應(yīng)主流感病毒的基因組區(qū)段的載體子集與源于感興趣 病毒株的補(bǔ)充區(qū)段（如，本文HA和/或NA抗原性變體）聯(lián)合引入，易于獲得重配流感病毒。 通常，基于需給藥疫苗相關(guān)所需特性選擇主病毒株。例如，用于疫苗生產(chǎn)，如，用于減毒的活 疫苗生產(chǎn)，主供體病毒株可選自減毒表型、冷適應(yīng)和/或溫度敏感型。如本文其它部分及美 國專利申請?zhí)?0/423, 828等所釋，本發(fā)明的不同實(shí)施方式使用A/Ann Arbor (AA)/6/60流 感株作為"主體"，在其基礎(chǔ)之上加上HA和/或NA基因（如本文所列的那些序列等）來創(chuàng)造 所需重配病毒。因此，例如，在6:2重配株中，2個基因（即NA和HA)來自于期望對之產(chǎn)生 免疫原性反應(yīng)的流感株，而其它6個基因來自于Ann Arbor株，或其它主體病毒株，等。Ann Arbor病毒的冷適應(yīng)性、減毒和溫度敏感屬性很有用。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)被意識到的是本文中的HA 和NA序列能夠與數(shù)種其它病毒基因或病毒類型發(fā)生重配（如數(shù)種不同"主體"，如PR8等， 其包含出現(xiàn)于重配株的其它流感基因，即非HA和非NA基因）。
[0084] 本文中的不同實(shí)施方式可包含用于大流行流感的具有本文HA和/或NA序列的減 毒活疫苗。此類疫苗通常包含如SEQ ID NO :11-20、27-32或39-44的HA和/或NA序列， 或SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38或45的對應(yīng)編碼核苷酸序列。疫苗病毒株（如重配株） 在雞蛋中生長造成的一個問題是禽類病毒株（它可能涉及大流行）能殺死生產(chǎn)疫苗的雞 蛋，因此通過使用傳統(tǒng)（非質(zhì)粒拯救）重配株生產(chǎn)難以操作、制造等。因?yàn)榇祟惽莶《局昴?引起人類流感及可能大流行因此對其很感興趣。因此，使用質(zhì)粒拯救系統(tǒng)產(chǎn)生/操作流感 重配株及大流行病毒株，如不同的禽類序列（如本文HA和NA序列），是急需的，也是本發(fā)明 的特色。然而，應(yīng)當(dāng)意識到的是當(dāng)前序列也可能用于非質(zhì)粒或傳統(tǒng)的系統(tǒng)。
[0085] 水禽（以及其它種類）能被15個血凝素（HA)和9個神經(jīng)氨酸酶（NA)亞型的甲型 流感病毒感染。這種鳥類作為存儲庫可將新流感亞型引入人群并造成大流行。2003年荷蘭 禽類H7N7甲型流感病毒感染人以及早些時候香港和中國禽類H5N1和H9N2病毒感染人的 發(fā)現(xiàn)引發(fā)了對這些（以及其它）亞型有引起大流行可能的關(guān)注。因此，需要疫苗保護(hù)人受 到甲型禽流感病毒的感染。對抗人流感病毒的減毒甲型流感病毒活疫苗最近在美國得到許 可。參見如上。此類疫苗為重配的HlNl和H3N2病毒，其中A/AnnArbor(AA)/6/60(H2N2) 冷適應(yīng)性（ca)病毒的內(nèi)部蛋白基因使重配病毒具有AA ca病毒冷適應(yīng)、減毒和溫度敏感的 表型（即從非Ann Arbor病毒株得到血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因的那些）。將經(jīng)典遺傳重配 和基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)生含有來自甲型流感病毒（H4-H14亞型）的禽類血 凝素和神經(jīng)氨酸酶基因以及來自AA ca病毒的6個內(nèi)部基因區(qū)段的重配病毒。此類重配病 毒是本發(fā)明的特色。參見下列HA和NA基因序列。因?yàn)锳A ca病毒相關(guān)表型出現(xiàn)在重配病 毒中，因此這些病毒具有在候選疫苗中需要的生物學(xué)性質(zhì)。產(chǎn)生并評價這些作為疫苗種病 毒的重配病毒是大流行準(zhǔn)備的重要步驟。預(yù)計臨床試驗(yàn)?zāi)艽_定此類減毒活的大流行疫苗的 安全性、感染性以及免疫原性。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括含有來自禽類和豬的大流行抗 原性基因 HA和/或NA的重配病毒（如疫苗中使用的那些）、除本文列舉外的大流行病毒 株，以通過質(zhì)粒拯救重配（如，重配A/Ann Arbor6/60 ( S卩，A/AA/6/60)和PR8等）生產(chǎn)大 流行疫苗。也包括構(gòu)建和使用此類病毒和疫苗的方法。本文所用"大流行病毒株"定義為 不在人群中流動的流感毒株A病毒亞型，由疾病控制中心（Centers for Disease Control) 或世界衛(wèi)生組織（World Health Organization)宣布或通常為科學(xué)領(lǐng)域所承認(rèn)為大流行菌 株。
[0086] 在本文的不同實(shí)施方式中，抗原性序列（如HA序列）以及病毒和來自此類病毒的 疫苗含有修飾的多堿性切割位點(diǎn)。一些高致病性禽大流行流感病毒株在血凝素序列內(nèi)包 含多個堿性氨基酸切割位點(diǎn)。參見例如，Li等，T. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999。在本發(fā)明的典型實(shí)施方式中，與產(chǎn)生目前序列的野生型序列相比，此類切割位點(diǎn)的序 列經(jīng)過修飾或更改（如，使其不能切割或減少了切割等）。因?yàn)橐吧托蛄星懈钗稽c(diǎn)的不 同序列，在不同病毒株中此類修飾/更改是不同的。例如，通常，本文序列中移除（與wt相 比）成熟H5的位置326-329上的4個多堿性殘基（RRKK)。參見"序列"。在各種實(shí)施方式 中，可通過多種方式修飾多堿性切割位點(diǎn)（這些均包含于本發(fā)明范圍內(nèi)）。例如，一次可移 除多堿性切割位點(diǎn)的一個氨基酸（如，移除一個R，移除兩個R，移除RRK，或移除RRKK)。此 夕卜，切割位點(diǎn)直接上游的氨基酸殘基也可被移除或更改（如，R變?yōu)門等）；切割位點(diǎn)直接下 游的氨基酸編碼核苷酸也同樣可被修飾。參見例如，圖1所示切割位點(diǎn)的修飾。此外，流感 病毒血凝素多肽序列含有氨末端信號肽序列，因此，本發(fā)明的血凝素多肽序列包含血凝素 多肽的成熟（氨基末端信號肽切割）形式以及血凝素的預(yù)切割形式。利用本領(lǐng)域任何數(shù)種 方法可常規(guī)檢測任何流感株的任何血凝素多肽序列的切割位點(diǎn)。
[0087] 應(yīng)用于任選包含當(dāng)前序列的病毒（通常用于疫苗或疫苗生產(chǎn)）的術(shù)語"溫度敏感 型"、"冷適應(yīng)性"和"減毒的"為本領(lǐng)域所熟知。例如，對甲型流感株而言，術(shù)語"溫度敏感 型"(ts)表明與33°C相比病毒在39°C時表現(xiàn)出100倍甚至更多的減弱，或者對乙型流感株 而言，與33°C相比，在37°C時表現(xiàn)出100倍甚至更多的減弱。術(shù)語"冷適應(yīng)性"(ca)表明病 毒在25°C時生長為其在33°C的100倍之內(nèi)，而術(shù)語"減毒"(att)表明病毒在雪貂的上呼吸 道內(nèi)復(fù)制但未在其肺組織中檢測到，并且不在動物中引起流感樣疾病。應(yīng)理解，病毒具有中 間表型，即病毒在39°C (對A株病毒）或37°C (對B株病毒）展現(xiàn)的減弱小于100倍，或在 25°C時生長為33°C生長的100倍以上（如200倍內(nèi)、500倍內(nèi)、1000倍、少于10,000倍）， 和/或與上氣道相比，在雪貂肺中生長減弱（即部分減毒）和/或在動物中減弱的流感樣 疾病，也是有用的病毒并可與本文的HA和NA序列聯(lián)用。
[0088] 再次，任選將本發(fā)明的HA和NA序列用于生產(chǎn)重配病毒或用于重配病毒（和/或 在其它ts、 CS、ca和/或att病毒和疫苗）。然而，值得注意的是本發(fā)明中的HA和NA序列 等不限于特定疫苗組合物或生產(chǎn)方法，因此基本能用于使用病毒株特異性HA和NA抗原的 任何疫苗類型或疫苗生產(chǎn)方法（如SEQ ID NO :11-20、27-32或39-44或編碼特定HA和NA 抗原的對應(yīng)核苷酸，如SEQ ID NO :1-10、21-26、33-38或45中的任何）。
[0089] FluMi st?
[0090] 如前文所提到的，存在數(shù)種流感疫苗類型的例子。示范性流感疫苗是FluMist?， 它是保護(hù)兒童和成人免受流感疾病侵襲的活減毒疫苗（Belshe等（1998)減毒、冷適應(yīng) 性、三價、鼻內(nèi)流感病毒活疫苗在兒童中的功效（The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl T Med338:1405-12 ;Nichol等（1999)減毒、鼻內(nèi)流感病毒活疫苗在健康的有工作 成年人中的有效性：隨機(jī)對照試驗(yàn)（Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults ：a randomized controlled trial) TAMA282:137-44)。典型的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和組合物優(yōu)選適應(yīng)/用于 FluMist?疫苗生產(chǎn)。然而，應(yīng)當(dāng)被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員了解的是本文的序列、方法、組合物 等也可用于生產(chǎn)相似或者甚至不同的病毒疫苗。
[0091] FluMist?疫苗病毒株包含起源于病毒株（如野生型病毒株）的HA和NA基因區(qū)段， 疫苗還包含六個來自共有主供體病毒（MDV)的基因區(qū)段，即？81、？82、?八、即1和呢。因此 本文的HA序列是不同的FluMist?制劑的一部分。FluMist?的甲型流感毒株的MDV (MDV-A) 是在持續(xù)低溫下在原代雞腎組織培養(yǎng)物中連續(xù)傳代野生型A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) 病毒株所得（Maassab (1967)流感病毒在25攝氏度下的適應(yīng)和生長特性（Adaptation and growth characteristics of influenza virus at25degrees C)Nature213:612-4)〇MDV~A 在25°C下有效復(fù)制（ca，冷適應(yīng)性），但在38°C和39°C下生長受限（ts，溫度敏感）。此外， 該病毒在感染雪貂的肺部不復(fù)制（att，減毒）。ts表型被認(rèn)為通過限制除呼吸道最冷區(qū)域 外病毒的復(fù)制使疫苗具有減毒性。該性質(zhì)的穩(wěn)定性已在動物模型及臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)。與 化學(xué)誘變產(chǎn)生的流感株ts表型相反，MDV-A的ts特性不隨在感染倉鼠中傳代而回復(fù)也不 在兒童的流出分離物中回復(fù)（近期的一篇綜述，參見Murphy和Coelingh (2002)開發(fā)和使 用減毒的冷適應(yīng)性甲型流感和乙型流感病毒活疫苗的原理（Principles underlying the development and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virus vaccine)Virus Immunol 15:295-323)。
[0092] 在超過20, 000個成人和兒童中進(jìn)行關(guān)于12種分離6:2重配株的臨床研究表明 這些疫苗是減毒、安全有效的（Belshe等（1998)減毒、冷適應(yīng)性、三價、鼻內(nèi)流感病毒活 疫苗在兒童中的功效（The efficacy of live attenuated， cold-adapted， trivalent， intrenasal influenza vaccine in children)N Engl J Med338:1405-12 :Boyce等（2000) 通過鼻內(nèi)途徑給予健康成年人的含佐劑和不含佐劑的亞基流感疫苗的安全性和免疫原性 (Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccine administered intranasally to healthy adults)Vaccine19:217-26 ；Edwards 等（1994)用于預(yù)防甲型流感的冷適應(yīng)性和滅活疫苗的隨機(jī)對照試驗(yàn)（A randomized controlled trial of cold-adapted and inactivated vaccine for the prevention of influenza A disease)』Infect Disl69:68~76 ：Nichol 等(1999)減毒、鼻內(nèi)流感病 毒活疫苗在健康的有工作成年人中的有效性：隨機(jī)對照試驗(yàn)（Effectiveness of live， attenuated intranasal influenza vaccine in healthy,working adults ：a randomized controlled trial) TAMA282:137-44)。攜帶MDV-A六個內(nèi)部某因和野牛型病毒兩個HA和NA 基因區(qū)段的重配病毒（即，6:2重配株）一向保持ca、ts和att表型（Maassab等（1982)在 雪紹中評價冷適應(yīng)性流感疫苗（Evaluation of a cold-recombinant influenza vaccine in ferrets) .!. Infect. Pis. 146:780-900) 〇
[0093] 使用乙型流感病毒株生產(chǎn)此類重配病毒要困難一些，然而，近期工作（參見例如， 生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)，2002年10月23日提交的美國申請?zhí)?0/420, 708, 2003年4月 25日提交的美國申請?zhí)?0/423,828以及2004年5月24日提交的美國申請?zhí)?0/574, 117) 展示了一個完全來自克隆cDNA的用于產(chǎn)生乙型流感病毒的八質(zhì)粒系統(tǒng)。用于產(chǎn)生減毒甲 型和乙型流感活病毒的方法適用于疫苗制劑，如為人熟知的用于鼻內(nèi)給藥的活病毒疫苗制 劑。
[0094] 前述系統(tǒng)和方法可用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中快速生產(chǎn)重組和重配的甲型和乙型流感 病毒，包括適合用作疫苗的病毒，包括減毒的活疫苗，如合適鼻內(nèi)給藥的疫苗。本發(fā)明中的 序列（如，核苷酸序列SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38或45及核苷酸序列編碼的對應(yīng)氨基 酸SEQ ID NO :11-20,27-32或39-44)、方法等任選與先前工作涉及的，例如用于疫苗生產(chǎn) 的重配流感病毒一起或聯(lián)合使用，以生產(chǎn)疫苗用病毒。
[0095] 用于預(yù)防性疫苗給藥的方法和組合物
[0096] 如上所述或除了用于生產(chǎn)FluMist?疫苗外，本發(fā)明還可用于其它疫苗制劑。通 常，本發(fā)明重組和重配病毒（如，包含多核苷酸SEQ ID勵：1-10、21、23-26、33-38或45或 多肽SEQ ID NO: 11-20、27-32或39-44,或其片段的病毒）可以免疫有效量并在合適載體賦 形劑中預(yù)防性給藥以刺激對于一種或多種流感病毒株的特異性免疫應(yīng)答，這些流感病毒株 由HA和/或NA序列決定。通常，載體或賦形劑為藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，如滅菌水、 鹽水溶液、緩沖鹽水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其組合。根據(jù)本領(lǐng)域確定的實(shí) 驗(yàn)方法能夠有效制備此類溶液并確保無菌、pH、等滲和穩(wěn)定性。通常，選擇載體或賦形劑以 盡量減少過敏和其它不需要的反應(yīng)，并適合于特定的給藥途徑，如皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)等。
[0097] 本發(fā)明的一個相關(guān)方面提供了刺激個體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對抗流感病毒的保護(hù)性免 疫應(yīng)答的方法。在方法中，用在生理上可接受載體中的重組流感病毒（如，含有本發(fā)明HA 和/或NA分子）的免疫有效量、本發(fā)明多肽的免疫有效量和/或本發(fā)明核酸的免疫有效量 進(jìn)行給藥。
[0098] 通常，以足以刺激對一種或多種流感病毒株（即，本發(fā)明的HA和/或NA病毒株） 應(yīng)答的量給予本發(fā)明的流感病毒。優(yōu)選給予流感病毒引起對此類病毒株的保護(hù)性免疫應(yīng) 答。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員了解引起對于一種或多種流感病毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答的劑量和 方法。參見例如，USPN5, 922, 326 ;Wright 等，Infect. Immun. 37:397-400 (1982) ;Kim 等， Pediatrics52:56-63 (1973):和 Wright 等，L Pediatr. 88:931-936 (1976)。例如，每劑量提 供約I-IOOOHID5ci (人有效劑量），即約IO5-IO8Pfu (空斑形成單位）流感病毒進(jìn)行給藥。通 常，根據(jù)如年齡、身體條件、體重、性別、飲食、給藥時間和其它臨床因素在范圍內(nèi)調(diào)整劑量。 全身給予預(yù)防性疫苗制劑，如利用針和注射器或無針裝置進(jìn)行皮下或肌肉內(nèi)注射?；蛘弑?內(nèi)給予疫苗制劑，通過滴劑、大顆粒氣溶膠（大于約10微米），或噴入上呼吸道。盡管上述 任何途徑均引起保護(hù)性系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)給藥的另一益處是引起流感病毒進(jìn)入位置的 黏膜免疫。對于鼻內(nèi)給藥，經(jīng)常優(yōu)選減毒活病毒疫苗，如，減毒、冷適應(yīng)性和/或溫度敏感型 重組或重配流感病毒。參見上文。盡管優(yōu)選單次給藥刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答，但也可通過相 同或不同途徑給予額外劑量，以達(dá)到所需預(yù)防效果。
[0099] 通常，在疫苗中的本發(fā)明減毒重組流感（病毒）充分減毒，因此感染癥狀，至少嚴(yán) 重感染癥狀不會在大多數(shù)減毒流感病毒免疫的（或由于另外因素感染的）個體中發(fā)生。在 一些例子中，減毒流感病毒仍能夠產(chǎn)生輕度疾病癥狀（如輕度上呼吸疾?。┖?或傳染未 接種疫苗的個體。然而，其毒性充分消減，因此并不會在接種或隨機(jī)宿主體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的下 呼吸道感染。
[0100] 或者，利用含有本文序列的流感病毒離體或體內(nèi)靶向樹突細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答。例 如，使樹突細(xì)胞暴露于足夠量的病毒足夠長的時間以使樹突細(xì)胞捕獲流感抗原。然后利用 標(biāo)準(zhǔn)靜脈內(nèi)移植方法將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移到要接種的個體中。
[0101] 盡管優(yōu)選單次給藥刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答，但也可通過相同或不同途徑給予額外劑 量，以達(dá)到所需預(yù)防效果。例如在嬰幼兒中，也許需要多次給藥引發(fā)足夠水平的免疫。為了 維持足夠水平對抗野生型流感感染的防護(hù)，可在整個兒童期持續(xù)間隔給藥。同樣，對重復(fù)或 嚴(yán)重流感感染尤其易感的成人，例如，健康工作者、護(hù)工、幼年兒童的家庭成員、老年人以及 心肺功能受損的個體也許需要多次免疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答?？杀O(jiān)測誘導(dǎo)免 疫的水平，如通過測定分泌和血清抗體的量，并且根據(jù)需要調(diào)整劑量和重復(fù)接種以引發(fā)并 維持所需水平的保護(hù)。
[0102] 任選地，預(yù)防性給予流感病毒的制劑也含有一種或多種佐劑，以提高對流感抗原 的免疫應(yīng)答。合適的佐劑包括：完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化 鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、卡介苗（BCG)，短 小棒狀桿菌（Corynebacterium parvum)和合成佐劑QS-21。
[0103] 根據(jù)需要，流感病毒的預(yù)防性疫苗給藥可與一種或多種免疫刺激分子偶聯(lián)操作。 免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增效和預(yù)刺激活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨 化因子，如白介素（如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生長因子（如粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞（GM)-集落刺激因子（CSF));和其它免疫刺激分子，如巨噬細(xì)胞炎癥因子、Flt3配體、 B7.1、B7. 2等。免疫刺激分子可在與流感病毒同樣的制劑中給藥，或者獨(dú)立給藥。可用蛋 白（如本發(fā)明的HA和/或NA多肽，如SEQ ID N0:ll-20、27-32或39-44中任何一個）或 含有編碼蛋白的核酸的表達(dá)載體（如SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38或45任何一個）給藥 以產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。
[0104] 上述方法可用于通過體外、離體或體內(nèi)將含有編碼治療或預(yù)防有效的HA和/或NA 多肽（或肽）或HA和/或NA RNA(如反義RNA或核酶）的異源多核苷酸的本發(fā)明載體引 入靶細(xì)胞群，以便治療性和/或預(yù)防性治療疾病或失調(diào)，通常是流感。通常，編碼感興趣多 肽（或肽）或RNA的多核苷酸可操作性連接于合適的調(diào)節(jié)序列，如上文名為"表達(dá)載體"和 "附加表達(dá)原件"部分所述。任選地，可將一種以上異源編碼序列插入單一載體或病毒。例 如，除了編碼治療或預(yù)防有效的活性HA和/或NA多肽或HA和/或RNA的多核苷酸外，該 載體還可包含其它治療性或預(yù)防性多肽，如抗原、共刺激分子、細(xì)胞因子、抗體等和/或標(biāo) 記物等。
[0105] 盡管利用特定亞組的特定病毒株的減毒流感病毒接種個體能誘導(dǎo)對于不同病毒 株和/或亞組的交叉防護(hù)，如果需要可利用來自至少兩個病毒株的減毒流感病毒（如各自 代表不同的亞組）接種個體。此外，疫苗組合可任選包括大流行疫苗（如對抗大流行株如 各種禽類病毒株（參見例如，本文序列）或其它大流行病毒株的疫苗）和非大流行病毒株 的混合物。疫苗混合物（多重疫苗）能包含來自人病毒株和/或非人（如禽類和人類等） 流感株的組分。同樣，本發(fā)明的減毒流感病毒疫苗能任選與誘導(dǎo)對抗其它感染劑的保護(hù)性 免疫應(yīng)答的疫苗組合。
[0106] 本發(fā)明的多核苷酸
[0107] 本領(lǐng)域眾所周知流感病毒HA和NA多核苷酸區(qū)段包含編碼區(qū)（編碼0RF)和非編碼 區(qū)（NCR)，以及HA和NA編碼序列的5'和3'。這些NCR的一個例子是SEQ ID NO: 1-9所示 NCR(0RF外部）。同樣知道的是可制造這些NCR的引物以利于擴(kuò)增流感病毒整個HA和NA區(qū) 段。（參見例如，Hoffmann 等，Arch Virol. 2001 年 12 月；146 (12) :2275-89)。此外，還知 道流感的HA和NA的NCR可增加所得重配株的效率。因此，這些NCR的多核苷酸序列（包 括片段及其變體（如至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91% 或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約 97%、或至少約98%、或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1%、 或至少約99. 2%、或至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或 至少約99. 7%、或至少約99. 8%、或至少約99. 9%相同））在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)擴(kuò)增 任何大流行病毒株HA和NA區(qū)段時，可制造并使用多核苷酸引物與HA和NA NCR的保守區(qū) (在相關(guān)病毒株中保守）結(jié)合，以便擴(kuò)增（如通過RT-PCR)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的 HA和NA多核苷酸包含大流行病毒株HA和NA序列的NCR和ORF (包括片段及其變體（如 至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91 %或至少約92%、或至 少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、 或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1 %、或至少約99. 2%、或 至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或至少約99. 7%、或 至少約99. 8%、或至少約99. 9%相同））。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的HA和NA多核苷 酸不包含NCR，但包含大流行病毒株HA和NA序列（如SEQ ID NO : 1-9)的ORF (包括片段 及其變體（如至少約60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少約91%或至少 約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或 至少約98%、或至少約98. 5%、或至少約98. 7%、或至少約99%、或至少約99. 1 %、或至少 約99. 2%、或至少約99. 3%、或至少約99. 4%、或至少約99. 5%、或至少約99. 6%或至少約 99. 7%、或至少約99. 8%、或至少約99. 9%相同））。
[0108] 本發(fā)明的 HA 和 NA 多核苷酸，如 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 21 至 SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:33至SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:45及其片段，可任意用于產(chǎn)生數(shù) 種不同能力（capacity)，作為用于上述疫苗的備選或補(bǔ)充。本文所述其它示范性用途僅出 于說明目的而非為了限制實(shí)際使用范圍。本文也描述構(gòu)建、純化和鑒定核苷酸序列的不同 方法。在一些實(shí)施方式中，含有本發(fā)明一種或多種多核苷酸序列的核酸易于用作監(jiān)測不同 環(huán)境中對應(yīng)或相關(guān)核酸的探針，這些環(huán)境包括例如，核酸雜交實(shí)驗(yàn)，如為了尋找和/或鑒定 感染其它種屬或在不同流感爆發(fā)中（等）的同源流感變體（如，與本文序列同源等）。探針 可為DNA或RNA分子，如基因組的限制性片段或克隆DNA、cDNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄子和寡 核苷酸，并且長度可從短至約10個核苷酸的寡核苷酸到長至超過Ikb甚至更長的全長序列 或cDNA。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的探針包括所選的多核苷酸序列或亞序列，如選 自 SEQ ID N0:1 至SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:21 至SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:33至SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:45或其互補(bǔ)序列?；蛘?，使用上述指定序列之一變體的多核苷酸序列作 為探針。最通常的，此類變體包含一個或數(shù)個保守核苷酸變化。例如，選擇數(shù)對（或數(shù)套） 寡核苷酸，其中兩個（或更多）多核苷酸序列彼此保守性變異，其中一個多核苷酸序列完全 對應(yīng)第一個變體或，且其它多核苷酸序列完全對應(yīng)剩余變體。此類寡核苷酸探針對尤其有 用，如，用于特異性雜交實(shí)驗(yàn)以探測多態(tài)性核苷酸或探測同源性流感HA和NA變體，如與當(dāng) 前HA和NA序列同源的變體，感染其它種屬或在不同流感爆發(fā)（時間和/或地理上不同） 中出現(xiàn)的變體。在其它應(yīng)用中，選擇更離散的探針即選擇至少約91% (或約92%、約93%、 約 94 %、約 95 %、約 96 %、約 97 %、約 98 %、約 98. 5 %、約 98. 7 %、約 99 %、約 99. 1 %、約 99. 2%、約 99. 3%、約 99. 4%、約 99. 5%或約 99. 6%或多于約 99. 7%、約 99. 8%、約 99. 9% 或更多）相同的探針。
[0109] 本發(fā)明的探針，例如衍生自本文序列的序列，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)步驟也可用于識別 其它有用的多核苷酸序列。在一套實(shí)施方式中，如上所述，用一個或多個探針篩選產(chǎn)物表達(dá) 文庫或染色體區(qū)段文庫（如表達(dá)文庫或基因組文庫）以鑒別包含與本文序列的一個或多個 探針序列相同或序列顯著相似的克隆，即變體、同源物等。應(yīng)被理解的是除了如文庫篩選的 物理方法外，計算機(jī)輔助的生物信息學(xué)手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能 用于鑒定相關(guān)多核苷酸序列。以此方式鑒定的多核苷酸序列也是本發(fā)明特征。
[oho] 任選通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的數(shù)種方法生產(chǎn)寡核苷酸探針。最 典型的是，利用熟知的合成方法，如Beaucage和Caruthers (1981) Tetrahedron Letts22 (20) : 1859-1862所述固相亞磷酰胺三酯方法，如使用自動合成儀或如Needham-Van Devanter等(1984) Nucl Acids Res, 12:6159-6168所述制造。也可定制寡核昔酸或從本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的商品來源訂購。當(dāng)需要純化寡核苷酸時，一般進(jìn)行非變性（nature)丙烯 酰胺凝膠電泳或通過陰離子交換HPLC，如Pearson和Regnier (1983) T Chrom255:137-149 所述?？筛鶕?jù)Maxam和Gilbert (1980)在Grossman和Moldave (編）紐約科學(xué)出版社，《酶 學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 65:499-560所述化學(xué)降解方法來驗(yàn)證合成寡核苷酸的 序列。也可方便從多個熟練技術(shù)人員所知的商業(yè)來源訂購定制的寡核苷酸。
[0111] 在其它情況下，如關(guān)于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸和多肽的細(xì)胞或生物體（如，帶有包 含本發(fā)明序列病毒的那些），方便使用多肽、肽或抗體探針。例如，源于本發(fā)明任何氨基酸序 列（如SEQ ID N0:11-20、SEQ ID N0:27-32、SEQ ID N0:39-44)的分離或重組多肽、多肽片 段和肽和/或由本發(fā)明多核苷酸序列，如選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 21 至 SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:33 至 SEQ ID N0:38 以及 SEQ ID N0:45 編碼的多肽或多 肽片段易于用于鑒定和分離噬菌體展示文庫、組合文庫、多克隆血清等中的抗體。本發(fā)明的 多肽片段包含肽或多肽，其氨基酸序列包含本發(fā)明HA或NA多肽的氨基酸序列（如SEQ ID NO :11-20、SEQ ID NO :27-32和SEQ ID NOS :39-44)的至少5個毗連氨基酸殘基，或至少 10個毗連氨基酸殘基，或至少15個毗連氨基酸殘基，或至少20個毗連氨基酸殘基，或至少 25個毗連氨基酸殘基，或至少40個毗連氨基酸殘基，或至少50個毗連氨基酸殘基，或至少 60個毗連氨基酸殘基，或至少70個毗連氨基酸殘基，或至少80個毗連氨基酸殘基，或至少 90個毗連氨基酸殘基，或至少100個毗連氨基酸殘基，或至少125個毗連氨基酸殘基，或至 少150個毗連氨基酸殘基，或至少175個毗連氨基酸殘基，或至少200個毗連氨基酸殘基， 或至少250個毗連氨基酸殘基，或至少350個，或至少400個，或至少450個或至少500個， 或至少550個毗連氨基酸殘基。本發(fā)明的實(shí)施方式中優(yōu)選編碼特異性與所述多肽結(jié)合的所 述多肽片段和抗體的多核苷酸。
[0112] 對任何多肽序列或亞序列，如SEQ ID NO : 11至SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :27至 SEQ ID NO: 32和/或SEQ ID NO: 39至SEQ ID NO :44,和/或本發(fā)明多核苷酸序列，如SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :21 至 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :33 至 SEQ ID NO : 38和SEQ ID N0:45編碼的多肽序列或亞序列特異的抗體同樣具有作為評價細(xì)胞或組織中 表達(dá)產(chǎn)物的探針的價值。此外，抗體尤其適用于在組織陣列，細(xì)胞、組織或生物體中，如被未 知流感病毒或類似感染的生物體中，原位評價含有氨基酸亞序列的蛋白質(zhì)（如本文給出的 那些）或由本發(fā)明多核苷酸序列（如選自本文所示的那些）編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)?？捎脵z 測試劑直接標(biāo)記抗體，或用特定抗體的重鏈恒定區(qū)（即同種型）特異性第二抗體進(jìn)行標(biāo)記 以便間接檢測。下文提供了關(guān)于產(chǎn)生特異性抗體的另外的細(xì)節(jié)。
[0113] 診斷實(shí)驗(yàn)
[0114] 可在診斷實(shí)驗(yàn)中使用本發(fā)明的核酸序列檢測樣品中的流感病毒（和/或血凝素和 /或神經(jīng)氨酸酶）、檢測血凝素樣和/或神經(jīng)氨酸酶樣序列、利用如選自本文序列的化學(xué)合 成或重組的多核苷酸片段檢測流感臨床分離物中病毒株差異。例如，可將含有至少10-20 個核苷酸的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶序列片段用作引物以使用本領(lǐng)域熟知聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)(如逆轉(zhuǎn)錄PCR)方法擴(kuò)增核酸，或者用作核酸雜交實(shí)驗(yàn)中的探針以檢測臨床標(biāo)本中 的靶遺傳物質(zhì)，如流感RNA。
[0115] 本發(fā)明的探針，如本文給定的那些獨(dú)特亞序列，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)步驟也能用于鑒 定其它有用的多核苷酸序列（如鑒定其它流感株）。在一套優(yōu)選實(shí)施方式中，使用如上所述 的一個或多個探針篩選表達(dá)產(chǎn)物文庫和克隆病毒核酸文庫（即，表達(dá)文庫或基因組文庫） 以鑒定包含與本文序列相同或具有顯著相同性的序列的克隆。然后這些鑒定的序列各自可 用于制造探針，包括如上所述的成對或成套的變體探針。應(yīng)被理解的是除了如文庫篩選的 物理方法外，計算機(jī)輔助的生物信息學(xué)手段，如BLAST和其它序列同源性搜索算法等，也能 用于鑒定相關(guān)多核苷酸序列。
[0116] 本發(fā)明的探針在用于檢測細(xì)胞、組織或其它生物樣品（如鼻腔洗液或支氣管灌洗 液）中流感病毒的存在或測定其相同性中尤其有用。例如，本發(fā)明的探針有助于測定生物 樣品，如個體（如人個體）或模型系統(tǒng)（如培養(yǎng)細(xì)胞樣品）是否暴露于或已經(jīng)被流感或特 定流感株感染。檢測所選探針與源于（或分離自）生物樣品或模型系統(tǒng)的核酸的雜交情況 可指示是否暴露于或受到探針多核苷酸選自的病毒（或相關(guān)病毒）的感染。
[0117] 應(yīng)當(dāng)被理解的是探針設(shè)計受到目的應(yīng)用的影響。例如，在單一實(shí)驗(yàn)，如單一 DNA芯 片中，檢測數(shù)個等位基因特異性探針靶點(diǎn)相互作用時，需要所有的探針具有相近的解鏈溫 度。因此，調(diào)整探針的長度使陣列上所有探針的解鏈溫度接近相同（應(yīng)當(dāng)被理解的是當(dāng)不 同探針的GC含量不同時，需要使不同探針長度不同以達(dá)到特定的T m)。盡管解鏈溫度是探 針設(shè)計中首先考慮的因素，但可任選使用其它因素進(jìn)一步調(diào)整探針構(gòu)建，如選擇抗引物自 身互補(bǔ)等。
[0118] 載體,啟動子和表達(dá)系統(tǒng)
[0119] 本發(fā)明包括整合本文一個或多個核酸序列的重組構(gòu)建物。此類構(gòu)建物任選包括載 體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌人工染色體（BAC)、酵母人工染色體（YAC)等，其中 正向或反向插入本發(fā)明一個或多個多核苷酸序列，如包含SEQ ID NO :1至SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO:21 至 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33 至 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:45 中任何一 個或其亞序列等的多核苷酸序列。例如，插入的核酸能包含含有至少一個本發(fā)明多核苷酸 序列的全部或一部分的病毒染色體序列或cDNA。在一個實(shí)施方式中，構(gòu)建物還包括與序列 操作性連接的調(diào)節(jié)序列，包括例如啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道大量合適的載體和啟動子， 并可商業(yè)購得。
[0120] 本發(fā)明的多核苷酸可包含于數(shù)種適合產(chǎn)生正義或反義RNA，以及任選地產(chǎn)生多肽 (或肽）表達(dá)產(chǎn)物（如，本發(fā)明血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶分子或其片段）的載體中。此類 載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA ;桿狀病 毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合，病毒DNA如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、狂犬 病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等（如PCDL)?？墒褂萌魏文軌?qū)⑦z傳物質(zhì)引入細(xì)胞 并且能夠在相關(guān)宿主中復(fù)制（如果需要的話）的載體。
[0121] 在表達(dá)載體中，感興趣的HA和/或NA多核苷酸序列物理排布接近并朝向合適的 轉(zhuǎn)錄控制序列（如啟動子，任選地，一個或多個增強(qiáng)子）以指導(dǎo)mRNA合成。也就是說，感興 趣的多核苷酸序列可操作性連接于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列。此類啟動子的例子包括：LTR或 SV40啟動子、大腸桿菌Iac或trp啟動子、噬菌體λ Plj啟動子及其它知道可控制原核或真 核細(xì)胞或其它病毒中基因表達(dá)的啟動子。
[0122] 數(shù)種啟動子可用于表達(dá)載體中，以調(diào)節(jié)流感病毒基因組區(qū)段轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方 式中，使用巨細(xì)胞病毒（CMV) DNA依賴性RNA聚合酶II (Pol II)啟動子。如果需要如條件控 制表達(dá)，可替換使用其它可在特定條件下、或特定組織和細(xì)胞中，誘導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。 可用數(shù)種病毒和哺乳動物，如人的啟動子，或者根據(jù)預(yù)期特定應(yīng)用分離。例如，獲自動物和 人病毒基因組的候選啟動子包括此類啟動子，如腺病毒（如腺病毒2)、乳頭瘤病毒、乙肝病 毒、多瘤病毒以及猿病毒40 (SV40)和不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子。哺乳動物啟動子包括肌動 蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等。
[0123] 任選地，可通過包含增強(qiáng)子序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子通常較短，如，10_500bp，它是與 啟動子配合作用以增加轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA原件。從哺乳動物基因（血紅蛋白、彈性蛋白 酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素）和真核細(xì)胞病毒中分離了許多增強(qiáng)子序列?？蓪⒃鰪?qiáng)子序 列剪接到載體中異源編碼序列的5'或3'位置，但通常插入啟動子的5'位點(diǎn)。通常，選擇啟 動子和其它轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列（若需要）以優(yōu)化異源DNA在引入宿主細(xì)胞中的表達(dá)（Scharf等 (1994)熱應(yīng)力啟動子和轉(zhuǎn)錄因子（Heat stress prompter and transcription factors) Results Probl Cell Differ20:125-62 ;Kriegler 等（1990)組裝增強(qiáng)子、啟動子和剪接信 號以控制轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)（Assembly of enhancers, promoter, and splice signals to control expression of transferred gene)Methods in Enzymol 185 :512-27) 〇 任選地， 為了啟動轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增子也可包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)。
[0124] 本發(fā)明的載體也包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列，如聚腺苷酸化位點(diǎn)或終 止序列。此類序列一般位于真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'末端，偶爾位于3'末 端。在一個實(shí)施方式中，SV40聚腺苷酸化信號序列能提供雙向聚腺苷酸化位點(diǎn)，它從啟動 (_)鏈病毒基因組復(fù)制的Poll啟動子隔離了（+)鏈mRNA分子的轉(zhuǎn)錄。
[0125] 此外，如上所述，表達(dá)載體任選包含一個或多個選擇性標(biāo)記物基因以提供用于篩 選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型特征，除了以前列出的基因，諸如二氫葉酸還原酶或新霉素抗性等 標(biāo)記物可用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的選擇。
[0126] 含有如上所述的合適核酸序列以及合適的啟動子或控制序列的載體，可用于轉(zhuǎn)化 允許蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞。雖然本發(fā)明的載體可在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制，但最經(jīng)常需要將其引 入哺乳動物細(xì)胞，如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、COS細(xì)胞等用于表達(dá)。
[0127] 如其它地方所述，在各種實(shí)施方式中，本文HA和NA序列可包含于參與質(zhì)粒拯救重 配的質(zhì)粒之中。參見例如，2002年10月23日提交的美國申請?zhí)?0/420, 708 ;2004年5月 24日提交的60/574, 117 ;2003年4月25日提交的10/423, 828 ;2004年6月12日提交的 60/578, 962 ;和2004年6月24日提交的10/870, 690以及US20020164770,納入本文作為參 考。例如，本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)載體包括但不限于：含有pol I啟動子和終止子序列的載體或 使用口〇11和口〇111啟動子、〇11/?〇111啟動子系統(tǒng)"的載體（如，2(*61等，燦(31^(^(18 Res. 1993,21:3607 ;US20020164770 ;Neumann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA1999,96:9345 ; Fodor 等，J. Virol. 1999,73:9679 ;和 US20030035814)。產(chǎn)生的重配株可包含 HA 和 NA 基因 與排列在一起的來自A/Ann Arbor/6/60供體病毒株（和/或其衍生物及修飾形式）、PR8 供體病毒株主體、A/Leningrad/17供體病毒株主體的6個其它流感基因。其它主體病毒株 在如20040137013和20030147916中有描述，納入本文作為參考。
[0128] 其它表達(dá)元件
[0129] 最常見的，編碼流感病毒HA和/或NA蛋白的基因組區(qū)段包含其表達(dá)、包括翻譯為 功能性病毒蛋白質(zhì)所必需的任何其它序列。在其它情況下，可使用編碼病毒蛋白如HA和/ 或NA蛋白的小基因或其它人工構(gòu)建物。再次，在此類情況下，常常需要包括有助于異源編 碼序列有效翻譯的特定起始信號。這些信號能包括如，ATG起始密碼子和相鄰序列。為了 保證整個插入子的翻譯，將起始密碼子插入到病毒蛋白正確的閱讀框中。外源性轉(zhuǎn)錄原件 和起始密碼子可為不同來源，天然和合成均可。在所用細(xì)胞系統(tǒng)中包含合適的增強(qiáng)子可增 強(qiáng)表達(dá)效率。
[0130] 如果需要，可將編碼其它表達(dá)原件如信號序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序 列摻入載體中，通常與感興趣的多核苷酸序列在同一閱讀框內(nèi)，以便（例如）使多肽靶向表 達(dá)于所需細(xì)胞隔室、膜或細(xì)胞器中，或指導(dǎo)多肽分泌至周質(zhì)空間或細(xì)胞培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技 術(shù)人員了解此類序列，包括分泌前導(dǎo)肽、細(xì)胞器靶向序列（如核定位序列、ER駐留信號、線 粒體轉(zhuǎn)運(yùn)序列序列），膜定位/錨定序列（如終止轉(zhuǎn)運(yùn)序列、GPI錨定序列）等。
[0131] 當(dāng)需要翻譯本發(fā)明核酸序列編碼多肽時，其它翻譯特異性起始信號可提高翻譯效 率。這些信號能包括，如，ATG起始密碼子和相鄰序列、IRES區(qū)等。在一些情況下，例如，含 有摻入本發(fā)明多核苷酸序列（如在本文序列中）、翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件的編碼 序列的全長cDNA分子或染色體區(qū)段與感興趣多核苷酸序列同時插入合適的表達(dá)載體。在 這些情況下，通常無需其它翻譯控制信號。然而，當(dāng)僅插入多肽編碼序列或其部分的情況 下，常常提供外源性翻譯控制信號，包括如ATG起始密碼子用于相關(guān)序列的表達(dá)。將起始密 碼子置于合適的閱讀框中以保證感興趣多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。外源性轉(zhuǎn)錄原件和起始密碼 子的來源可以不同，天然和合成均可。通過包含對所用細(xì)胞體系合適的增強(qiáng)子可增強(qiáng)表達(dá) 效率（參見例如，Scharf D.等(1994) Results Probl Cell Differ20:125-62 ;Bittner 等 (1987)Methods in Enzymol153:516-544)。
[0132] 生產(chǎn)重組病毒
[0133] 利用重組反向遺傳學(xué)手段可遺傳工程改造并回收負(fù)鏈RNA病毒（參見例如， Palese等的USPN5, 166, 057)。起初此類方法用于工程改造病毒基因組（Luytjes等 (1989)Cell59:1107-1113 ;Enami 等(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:11563-11567) 并被成功應(yīng)用于各種區(qū)段化和非區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒，如狂犬病病毒（Schnell等 (1994) EMBO T. 13 :4195-4203) ;VSV (Lawson 等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 ： 4477-4481);麻疹病毒（Radecke 等(1995)EMBO T. 14:5773-5784);牛瘟病毒（Baron 和 Barrett (1997) T. Virol. 71 :1265-1271);人副流感病毒（Hoffman 和 Baner jee (1997) T.Virol.71:3272-3277 ；Dubin 等(1997)Virol〇gv235:323-332) ;SV5(He 等（1997) Virol〇gv237:249-260);犬瘟病毒（Gassen 等(2000) T. Virol. 74:10737-44);和仙臺 (Sendai)病毒（Park 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :5537-5541 ;Kato 等（1996) Genes to Cellsl: 569-579)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉這些制造含本發(fā)明HA和NA序列流感 病毒的方法及類似方法。根據(jù)此類方法制造的重組流感病毒就像含有本發(fā)明的一種或多種 核酸和/或多肽的重組流感病毒一樣，也是本發(fā)明的特點(diǎn)。
[0134] 細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)宿主
[0135] 本發(fā)明也涉及引入（轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染）本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，和利用重組技 術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。利用本發(fā)明載體，如表達(dá)載體遺傳學(xué)工程改造宿主細(xì)胞（即轉(zhuǎn)導(dǎo)、 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）。如上所述，載體可為質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式。合適的表達(dá)宿主的 例子包括：細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌（E. coli)、鏈霉菌（Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium);真菌細(xì)胞，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，巴斯 德畢赤酵母（Pichia pastoris)和粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa);或昆蟲細(xì)胞如果蠅 (Drosophila)和草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)。
[0136] 最常見的，使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明的HA和NA分子。流感病毒復(fù)制的合適 宿主細(xì)胞包括，如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和COS細(xì)胞，包括293T細(xì)胞、 C0S7細(xì)胞或類似細(xì)胞。通常，使用一定比例如1:1的兩種上述細(xì)胞系的共培養(yǎng)物，如MDCK 細(xì)胞和293T或COS細(xì)胞，以提高復(fù)制效率。通常，在標(biāo)準(zhǔn)商品化培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，如在添 加血清（如10%胎牛血清）的杜氏改良的易購氏培養(yǎng)基（Dulbecco' s modified Eagle' s medium)，或在無血清培養(yǎng)基中，在保持中性緩沖pH (如pH在7. 0-7. 2)的受控濕度和CO2濃 度下培養(yǎng)。任選地，培養(yǎng)基包含阻止細(xì)菌生長的抗生素，如青霉素、鏈霉素等，和/或補(bǔ)充營 養(yǎng)物，如L-谷胺酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸等，以及利于促進(jìn)生長特性的其它補(bǔ)充劑， 如胰蛋白酶、β-巰基乙醇等。
[0137] 工程改造的宿主細(xì)胞可在根據(jù)激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增插入多核苷酸序列 的需要改良的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如溫度、PH等培養(yǎng)條件通常為所選用于表達(dá)的特定宿 主細(xì)胞先前培養(yǎng)所使用的條件，并為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉并在本文引用的參考文獻(xiàn) 中，包括如，F(xiàn)reshney (1994)《動物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù)手冊》(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniaue),第3版，紐約韋利-李斯出版社(Wiley-Liss)及其引用 文獻(xiàn)。其它有用的參考文獻(xiàn)包括，如，Paul (1975)《細(xì)胞和組織培養(yǎng)》（Cell and Tissue Culture),第5版，愛丁堡利文斯頓出版社；Adams (1980)《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 技術(shù)-生化學(xué)家細(xì)胞培養(yǎng)》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists), ffork 和 Burdon 編，阿姆斯特丹埃斯威爾出版 社。關(guān)于體外產(chǎn)生流感病毒尤感興趣的組織培養(yǎng)步驟的其它細(xì)節(jié)包括，如Merten等（1996) 在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)流感病毒用于疫苗制備（Production of Influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)Cohen和Shafferman編《設(shè)計和生產(chǎn)疫苗的新策略》 (Novel Strategies in Design and Production of Vaccine),出于所有目的將其整體納 入本文。此外，易于通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定并且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知此類步驟適合本發(fā)明的改 變。
[0138] 用于生產(chǎn)流感病毒（如具有本發(fā)明HA和/或NA序列）的細(xì)胞能在含血清或無血 清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些情況下，如用于制備純化病毒時，尤其需要細(xì)胞在無血清條件下生 長?？尚∫?guī)模培養(yǎng)細(xì)胞，如，少于25ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)管或瓶中或在大瓶中震蕩培養(yǎng)，在滾瓶 中培養(yǎng)，或在培養(yǎng)瓶、瓶或反應(yīng)器培養(yǎng)物中的微載體珠上（如，DEAE-右旋糖苷微載體珠，如 灰鶴和朗更公司的多瑪薩爾（Dormacell，Pfeifer and Langen);弗洛實(shí)驗(yàn)室公司的超級珠 (Superbead，F(xiàn)low Laboratories);苯乙烯共聚三甲胺珠，如希爾萊克斯、所咯希爾、安阿伯 (Hillex，SoloHill，Ann Arbor))上培養(yǎng)。微載體珠是為每體積貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物提供更大 表面積的小球（直徑范圍為100-200微米）。例如一升培養(yǎng)基能包含2千萬個微載體珠， 這些珠提供了超過8000平方厘米的生長表面。商業(yè)病毒生產(chǎn)，如為了生產(chǎn)疫苗，經(jīng)常需要 在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐里培養(yǎng)細(xì)胞。生物反應(yīng)器容積從1升至超過100升，如，Cyt〇3生物 反應(yīng)器（奧斯莫里卡公司，明尼蘇達(dá)州明內(nèi)通卡市（〇smonics，Minnetonka，MN)) ;NBS生物 反應(yīng)器（新不倫瑞克科學(xué)公司，新澤西州埃迪遜市（New Brunswick Scientific, Edison, NJ));來自布朗生物技術(shù)國際公司（布朗生物技術(shù)公司，德國邁爾蘇金（B. Braun Biotech, Melsungen，Germany))的實(shí)驗(yàn)室和商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器。
[0139] 不考慮培養(yǎng)體積，在本發(fā)明的許多所需方面，重要的是保持培養(yǎng)物合適溫度以保 證利用溫度依賴的多質(zhì)粒系統(tǒng)（參見例如，用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)，2002年10月 23日提交的美國申請?zhí)?0/420, 708,2003年4月25日提交的美國申請?zhí)?0/423,828以及 2004年5月24日提交的美國申請?zhí)?0/574, 117)有效回收重組和/或重配流感病毒并加 熱病毒溶液進(jìn)行過濾等。通常使用調(diào)節(jié)器，如自動調(diào)溫裝置或其它感受并維持細(xì)胞培養(yǎng)體 系和/或其它溶液溫度的設(shè)備以確保合適時期（如病毒復(fù)制等）溫度處于正確水平。
[0140] 在本文的一些實(shí)施方式中（如其中從載體區(qū)段制造重配病毒），根據(jù)本領(lǐng)域熟知 的將異源核酸引入細(xì)胞的方法將含有流感基因組區(qū)段的載體引入（如轉(zhuǎn)染）宿主細(xì)胞，這 些包括例如，磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染和使用聚胺轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染。例如， 可將載體，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，如COS細(xì)胞、293T細(xì)胞或COS或293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞 的混合物，根據(jù)制造商指導(dǎo)手冊利用聚胺轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LTl (密如斯公司（Mirus))生 產(chǎn)重配病毒等。因此，在一個實(shí)施例中，用160μ 1培養(yǎng)基（優(yōu)選無血清培養(yǎng)基）稀釋的約 2 μ ITransIT-LTl將每一載體各約1 μ g引入一群宿主細(xì)胞中，總體積是200 μ 1。在室溫下 將DNA:轉(zhuǎn)染試劑混合物孵育45分鐘然后加入800 μ 1培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染混合物加入宿主細(xì) 胞，通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的其它方法培養(yǎng)細(xì)胞。因此，為了在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn) 重組或重配病毒，將各自摻入8個基因組區(qū)段（如本發(fā)明ΡΒ2、PBl、PA、NP、M、NS、HA和NA) 的載體與約20 μ I TransIT-LTl混合并轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞。任選地，在轉(zhuǎn)染前用無血清培 養(yǎng)基如Opti-MEM I替換含血清的培養(yǎng)基，并孵育4-6小時。
[0141] 或者，可使用電穿孔將此類摻入流感基因組區(qū)段的載體引入宿主細(xì)胞。例如，根據(jù) 下述步驟利用電穿孔將摻入甲型流感或乙型流感病毒的質(zhì)粒載體引入Vero細(xì)胞。簡要說， 如生長于含10%胎牛血清（FBS)的改良易購氏培養(yǎng)基（Modified Eagle' s Medium(MEM)) 的約5xl06Vero細(xì)胞重懸于0. 4ml OptiMEM中并置于電穿孔杯中。將體積多至25 μ 1的20 微克DNA加入杯中的細(xì)胞，輕拍以溫和混勻。根據(jù)廠商指導(dǎo)手冊進(jìn)行電穿孔（如，連接電 容延長器（Capacitance Extender Plus)的伯樂基因脈沖儀II)，300伏，950微法拉，恒定 時間28-33毫秒。輕拍細(xì)胞混勻并在電穿孔后約1-2分鐘直接在杯中加入含10% FBS的 0. 7mlMEM。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)6孔組織培養(yǎng)板的兩個含2ml MEM，10%FBS的孔中。洗滌電 擊杯回收任何剩余細(xì)胞并將洗滌懸液在兩孔間平分。終體積約為3. 5mL。然后在允許病毒 生長的條件下，如對于冷適應(yīng)性病毒株在33°C，孵育細(xì)胞。
[0142] 在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可使用數(shù)種表達(dá)系統(tǒng)，如基于病毒的系統(tǒng)。當(dāng)使用腺病毒 作為表達(dá)載體時，任意將編碼序列連接到含晚期啟動子和三重前導(dǎo)序列的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻 譯復(fù)合物中。插入病毒基因組非必需El和E3區(qū)將得到在感染宿主細(xì)胞中能表達(dá)感興趣多 膚的活病毒(Logan 和 Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci81:3655-3659)。此外，可使用轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子，如勞氏肉瘤病毒（RSV)增強(qiáng)子增加在哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0143] 可任選能調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以所需方式加工表達(dá)蛋白的宿主細(xì)胞株。此類蛋 白修飾包括但不限于：乙?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。將前體形式切割為 成熟形式的蛋白翻譯后加工對于正確的插入、折疊和/或功能有時重要。此外，在宿主細(xì)胞 中的位置（如在細(xì)胞表面）也很重要。不同的宿主細(xì)胞，如C0S、CH0、BHK、MDCK、293、293T、 C0S7等，對于此類轉(zhuǎn)錄后活動具有特定的細(xì)胞機(jī)器和特有機(jī)制，可對細(xì)胞進(jìn)行選擇以保證 當(dāng)前引入外來蛋白的正確修飾和加工。
[0144] 對于本發(fā)明多核苷酸或其亞序列編碼的重組蛋白的長期高產(chǎn)率生產(chǎn)而言，任選使 用穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。例如，利用含病毒來源的復(fù)制或內(nèi)源性表達(dá)原件和選擇性標(biāo)記物基因的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞系。例如，在引入載體之后，在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)胞1-2天后轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基中。選擇性標(biāo)記物的目的是產(chǎn)生選擇抗性，它的存在允 許成功表達(dá)引入序列的細(xì)胞生長和恢復(fù)。因此，如源于單一細(xì)胞類型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化抗性細(xì)胞 團(tuán)可利用適合細(xì)胞類型的合適組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增。
[0145] 可在適合表達(dá)和從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收編碼蛋白的條件下任意培養(yǎng)被編碼本發(fā)明 多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。對表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞進(jìn)行分選、分離和/或純化。根 據(jù)序列（如取決于編碼膜滯留信號或其它的融合蛋白）和/或使用的載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生 的蛋白或其片段可為分泌的、膜結(jié)合的或胞內(nèi)滯留的。
[0146] 本發(fā)明核酸對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物也能在非動物細(xì)胞，如植物、酵母、真菌、細(xì)菌等中產(chǎn) 生。除了 Sambrook，Berger和Ausubel (參見下文）以外，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)節(jié)可參見 Payne等(1992)《在液體系統(tǒng)中的棺物細(xì)胞和組織培養(yǎng)》(Plant Cell and Tissue Culture in Liauid Systems)約翰韋利森出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)，紐約；Gamborg 和 Phillips編（1995)《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)；施普林格實(shí)驗(yàn)室基本方法手冊》(Plant Cell, Tissue and Organ Culture ：Fundamental Methods Springer Lab Manual)，施普林 格弗萊格公司（Springer-Verlag)(紐約柏林海德爾堡）和Atlas和Parks編《微生物培養(yǎng) 基手冊》(The Handbook of Microbiological Media) (1993)CRC 出版社，佛羅里達(dá)州伯克 萊屯（Boca Raton，F(xiàn)L)。
[0147] 在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的用途目的可選擇數(shù)種表達(dá)載體。例如，當(dāng)生產(chǎn)抗體 需要大量多肽或其片段時，優(yōu)先使用指導(dǎo)易于大量表達(dá)純化蛋白的載體。此類載體包括但 不限于：多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，如BLUESCRIPT (司查塔基公司（Stratagene))， 其中感興趣的編碼序列，如含有本文那些序列等的編碼序列，可連接入載體并與β-半 乳糖苷酶的氨基端翻譯起始甲硫氨酸和后續(xù)7個殘基的序列在同一讀框內(nèi)，產(chǎn)生有催 化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白；ρΙΝ載體（Van Heeke和Schuster (1989) .1 Biol Chem264:5503-5509) ;pET載體（威斯康星麥迪遜的諾華基公司（Novagen，Madison WI)) 等。同樣，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中，可使用數(shù)種含有組成型或誘導(dǎo)型啟 動子如α因子、醇氧化酶和PGH的載體產(chǎn)生所需表達(dá)產(chǎn)物。參見Ausubel，同上，和Grant 等，（1987);《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 153:516-544 的綜述。
[0148] 核酸雜交
[0149] 可使用比較性雜交鑒定本發(fā)明的核酸（如SEQ ID NO :1-10、SEQ ID NO :21-26、 SEQ ID N0:33-38、SEQ ID N0:45)，包括本發(fā)明核酸的保守性變異。比較性雜交法是區(qū)別本 發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。此外，在高、超高和超超高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與如本文所示代表的核酸雜 交的靶核酸是本發(fā)明的特色。此類核酸的例子包括與給定核酸序列相比包含一個或數(shù)個沉 默或保守性核酸取代的核酸。
[0150] 當(dāng)測試靶核酸與探針雜交程度至少相當(dāng)于完全配合互補(bǔ)靶點(diǎn)的一半時，稱此測試 靶核酸與探針核酸特異性雜交，即，靶點(diǎn)與探針雜交的信噪比至少為與完全配合互補(bǔ)序列 的一半，后者的信噪比至少為觀察到任何不配合祀核酸的雜交信噪比的約5倍-10倍。
[0151] 通常在溶液中，當(dāng)核酸結(jié)合時發(fā)生"雜交"。數(shù)種已知明了的物理化學(xué)力，如氫鍵、 溶劑斥力、堿基堆積等引起核酸雜交。核酸雜交的數(shù)種實(shí)驗(yàn)方案為本領(lǐng)域所熟知。核酸雜 交的詳盡指南參見Ti jssen (1993)《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針雜交》 (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)第一部分第二章，"雜交原則概述與核酸探針實(shí)驗(yàn)策 略，'（''Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, "（埃斯威爾出版社，紐約），以及下述Ausubel，Sambrook和Berger和 Ki_el。Hames和Higgins (1995)《基因探針1》(Gene Probesl)牛津大學(xué)出版社IRL出版 社，牛津，英格蘭（Hames和Higginsl)以及Hames和Higgins (1995)《基因探針2》(Gene Probes2)牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津,英格蘭(Hames和Higgins2)提供了合成、標(biāo) 記、檢測和定量測定DNA和RNA包括寡核苷酸的詳細(xì)內(nèi)容。
[0152] 在Southern或Northern印跡中濾紙上有多于100個互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的 嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的一個例子是42°C，含Img肝素的50%福爾馬林雜交過夜。嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌條 件的例子包含〇. 2x SSC在65°C洗滌15分鐘（參見Sambrook下文中SSC緩沖液和其它核 酸雜交參數(shù)的描述）。通常在高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌以去除探針信號背景。 低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌的例子是2x SSC在40°C洗滌15分鐘。通常，在特定雜交實(shí)驗(yàn)中觀察到信噪 比比無關(guān)探針信噪比高5倍（甚至更高）表明檢測到了特異性雜交。
[0153] 雜交以后，通過一系列的洗滌去除未雜交核酸，其嚴(yán)謹(jǐn)性根據(jù)需要結(jié)果可進(jìn)行調(diào) 整。低嚴(yán)謹(jǐn)性條件（如使用高鹽和低溫）增加靈敏度，但會造成非特異性雜交信號和高背景 信號。高嚴(yán)謹(jǐn)性條件（如使用低鹽和接近^的高溫）降低背景信號，通常主要是留下特異性 信號。參見Rapley，R.和Walker，J. M.編，《分子牛.物學(xué)方法手冊》(Molecular Biomethods Handbook) (Humana 出版公司，1998)。
[0154] 核酸雜交實(shí)驗(yàn)如Southern和northern雜交上下文中的"嚴(yán)謹(jǐn)雜交洗漆條件"取 決于序列，并在不同的環(huán)境參數(shù)下"嚴(yán)謹(jǐn)雜交洗滌條件"也不同。核酸雜交的詳盡指南參見 Ti jssen (1993)，同上以及Hames和Higgins，1和2。對于任何測試核酸的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌 條件可憑經(jīng)驗(yàn)測定。例如，在確定高嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件時，逐漸增加雜交和洗滌條件（如 通過增加雜交或洗滌中的溫度、降低鹽濃度、增加去污劑濃度和/或增加有機(jī)溶劑，如福爾 馬林的濃度）直至滿足選擇的一套標(biāo)準(zhǔn)。例如，逐漸增加雜交和洗滌的條件直至探針與互 補(bǔ)靶點(diǎn)完美配合，其信噪比是觀察到的探針與不配合靶點(diǎn)雜交信噪比的5倍。
[0155] 通常，在特定雜交實(shí)驗(yàn)中，信噪比是觀察到無關(guān)探針的至少2倍（或更高，如，至少 5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更高）表明檢測到特異性雜交。本發(fā)明的上下文中檢測到 兩個序列至少發(fā)生嚴(yán)謹(jǐn)雜交表明與本文序列表提供了本發(fā)明的核酸具有相對強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相 似性。
[0156] 所選擇的"非常嚴(yán)謹(jǐn)"條件等于特定探針的熱解鏈點(diǎn)（Tm)。Tm是50%測試序列與 完美配合探針雜交時的溫度（在確定離子強(qiáng)度和PH的條件下）。出于本發(fā)明的目的，在確 定離子強(qiáng)度和pH的條件下，通常選擇低于特定序列Tm5°C的"高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?雜交和洗滌條件 (如下文注明，高嚴(yán)謹(jǐn)度條件也是相等同的術(shù)語）?？稍趪?yán)謹(jǐn)或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下鑒別與感興 趣核苷酸序列相接近或相同的靶序列（如"探針")。低嚴(yán)謹(jǐn)性條件適合互補(bǔ)性較差的序列。
[0157] "超高嚴(yán)謹(jǐn)性"雜交和洗滌條件是提高雜交和洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性直至探針與互補(bǔ) 靶點(diǎn)完美配合，其信噪比是觀察到的探針與不配合靶點(diǎn)雜交信噪比的至少10倍。在此條件 下與探針雜交的信噪比相當(dāng)于完美配合互補(bǔ)靶核酸一半的靶核酸被稱作在超高嚴(yán)謹(jǐn)條件 下與探針結(jié)合。
[0158] 在測定嚴(yán)謹(jǐn)或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交（或甚至更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交）和洗滌條件時，逐漸增加 雜交和洗滌條件（如，通過增加雜交或洗滌中的溫度、降低鹽濃度、增加去污劑濃度和/或 增加有機(jī)溶劑如甲酰胺的濃度），直至滿足所選一套標(biāo)準(zhǔn)。例如，逐漸增加雜交和洗滌條件， 直至含有本發(fā)明一個或多個多核苷酸序列，如選自本文給定的序列或獨(dú)特亞序列（如SEQ ID N0:l-10、21-26、33-38、SEQ ID N0:45)的探針和/或互補(bǔ)多核苷酸序列，與完美配合互 補(bǔ)靶點(diǎn)（再次，含有本發(fā)明一個或多個選自本文給定的序列或亞序列和/或其互補(bǔ)多核苷 酸序列的核酸）結(jié)合，根據(jù)需要，信噪比至少為觀察到的非配合靶點(diǎn)（如含有一個或多個選 自提交時公共數(shù)據(jù)庫（如Genbank)中的已知流感序列的序列或亞序列的多核苷酸序列，和 /或其互補(bǔ)多核苷酸序列）雜交的2倍（任選5倍、10倍或100倍或更多倍）。
[0159] 利用本發(fā)明的多核苷酸或其亞序列，可獲取新穎靶核酸；此類靶核酸也是本發(fā)明 的特點(diǎn)。例如，此類靶核酸包含在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與對應(yīng)本發(fā)明多核苷酸SEQ ID NO :1-10、 21-26、33-38、45的獨(dú)特寡核苷酸探針雜交的序列）。
[0160] 同樣，通過逐漸增加相關(guān)雜交實(shí)驗(yàn)的雜交和/或洗滌條件可確定甚至更高水平的 嚴(yán)謹(jǐn)性。例如，增加雜交和洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性直至與探針與完美配合互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪比 至少為任何非配合靶核酸雜交的10倍、20倍、50倍、100倍或500倍甚至更高。特定信號取 決于相關(guān)實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、放射性標(biāo)記等。在此條件下與探針雜 交的信噪比相當(dāng)于完美配合互補(bǔ)靶核酸一半的靶核酸被稱作在超超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針 結(jié)合，并且也是本發(fā)明的特點(diǎn)。
[0161] 如果核酸編碼的多肽基本相同，那么在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此不雜交的核酸仍有可能基 本相同，例如當(dāng)使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性創(chuàng)建核酸拷貝時。
[0162] 感興趣生物分子的克隆、誘變和表達(dá)
[0163] 描述應(yīng)用于本發(fā)明的分子生物學(xué)方法技術(shù)如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等的文本包 括Berger和Ki_el，《分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第152卷科學(xué)出版社公司，力口州圣地亞哥（Berger); Sambrook 等，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第 三版），第1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約2000 ( "Sambrook"）和《新編分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)方案》(Current Protocols in Molecular Biology) , F. M. Ausubel 等編，格林出版聯(lián)合 公司（Greene Publishing Associates，Inc)和約翰韋利森出版公司（John Wiley&Sons， Inc.)合資的最新實(shí)驗(yàn)方案公司（從2002年補(bǔ)充）（"Ausubel")）。這些文本描述了誘變、 使用載體、啟動子和其它關(guān)于如HA和/或NA分子等產(chǎn)生的相關(guān)話題。
[0164] 本發(fā)明任選使用不同類型的誘變，如生產(chǎn)和/或分離本發(fā)明新穎的或新分離的HA 和/或NA分子和/或進(jìn)一步修飾/誘變多肽（如，HA和NA分子，如SEQID NO :11-20或 27-32或39-44)。它們包括但不限于定點(diǎn)誘變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組（DNA重排）、利用含 尿嘧啶的模板進(jìn)行誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、利用缺口雙鏈體 DNA誘變等。其它合適的方法包括點(diǎn)錯配修復(fù)、利用修復(fù)缺陷宿主株進(jìn)行誘變、限制性選擇 和限制性純化、缺失誘變、全基因合成誘變、雙鏈打斷修復(fù)等。本發(fā)明也包括誘變，如涉及嵌 合構(gòu)建物的誘變。在一個實(shí)施方式中，可由天然產(chǎn)生分子或改變或誘變的天然產(chǎn)生分子的 信息，如序列、序列對比、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等指導(dǎo)誘變。
[0165] 上述文本和例子以及下列公開物（及其引用文獻(xiàn)）都描述了這些步驟： Sieber，等，Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001) ;Ling 等，DNA 誘變方法： 概覽(Approaches to DNA Mutagenesis :an overview), Anal Biochem254(2)： 157-178 (1997) ;Dale等，利用硫代磷酸酯方法進(jìn)行寡核苷酸定向隨機(jī)誘變 (Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method)，Methods Mol Biol57:369-374 (1996) ;I. A. Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res23,3067-8(1995) P. C. Stemmer，Nature370,389-91(1994) ;Arnold，非常 態(tài)環(huán)境下的蛋白質(zhì)工程（Protein engineering for unusual environments), Current Opinion in Biotechnology4:45〇-455 (1993) ;Bass 等，具有新 DNA 結(jié)合特異性的突 變 Trp 阻抑物(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities)， Science242:240-245 (1988) fritz等，突變的寡核苷酸定向構(gòu)建：不進(jìn)行體外酶反應(yīng)的缺 口 雙鏈體 DNA 方法（Oligonucleotide-directed construction of mutation ：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro)， Nucl Acids Resl6 ： 6987-6999(1988) Aramer等，在缺口雙鏈體DNA方法中用于寡核苷酸定向構(gòu)建突變的改 良的酶促體夕卜反應(yīng)（Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutation), Nucl Acids Resl6 :7207 (1988) ;Sakamar和Khorana，牛桿體外節(jié)鳥票呤核苷酸結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋 白）的ct亞基的基因的總合成和表達(dá)（Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)) ,Nucl Acids Resl4 :6361-6372 (1988) ;Sayers 等，基于硫代憐酸酯 的寡核苷酸定向誘變中的Y-T核酸外切酶（Y-TExonucleases in phosphorothioate-based 〇1igonuIcIeotide-directed mutagenesis)，Nucl Acids Res 16:791-802(1988)； Sayers等，溴乙錠存在下通過限制性核酸外切酶的反應(yīng)對含硫代磷酸酯的DNA進(jìn)行鏈 特異性切割(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide)， (1988)Nucl Acids Resl6 :803-814 ;Carter，改進(jìn)的利用M13載體的寡核苷酸定向誘變 (Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13vector)，Methods in Enzymol 154 :382-403 (1987) ;Kramer和Fritz通過缺口雙鏈體DNA進(jìn)行突變的寡核苷酸 定向構(gòu)建（Oligonucleotide-directed construction of mutation via gapped duplex DNA)，Methods in Enzymol 154:350-367 (1987) ;Kunkel，《核酸和分子生物學(xué)》(Nucleic Acids and Molecular Biology)中的《寡核苷酸定向誘變的效率》(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis) (Eckstein, F.和 Lilley，D. M. J.編，施普林 格弗萊格公司，桕林）（1987) ;Kunkel等，不進(jìn)行表型選擇的快速有效的定點(diǎn)誘變（Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，Methods in Enzymoll54, 367-382 (1987) ;Zoller和Smith，寡核音酸定向誘變：利用兩種寡核音 酸引物和一種單鏈DNA模板的簡單方法（Oligonucleotide-directed mutagenesis : a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template)，Methods in Enzymol 154:329-350 (1987) ;Carter，定點(diǎn)誘變（Site-directed mutagenesis)，Biochem .1237:1-7 (1986) ;Eghtedarzadeh 和 Henikoff，使用寡核苷酸 產(chǎn)生大缺失（Use of oligonucleotides to generate large deletions)，Nucl Acids 座^14 :5115(1986) ;Mandecki，大腸桿菌質(zhì)粒中寡核苷酸定向的雙鏈斷裂修復(fù)：定點(diǎn)誘 變方法(oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli ：a method for site-specific mutagenesis)，Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181 (1986) ;Nakamaye和Eckstein，通過硫代磷酸酯基團(tuán)抑制核酸內(nèi)切酶NciI 切割和它在寡核苷酸定向誘變中的應(yīng)用（Inhibition of endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis), Nucl Acids Resl4 :9679-9698 (1986) ;Wells 等，氧鍵形成在穩(wěn)定枯草桿菌 蛋白酶的過渡態(tài)中的重要性（Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)，Phil Trans R Soc Lond A317 :415-423 (1986)； Botstein 和 Shortle，體外誘變的方案和應(yīng)用（Strategies and applications of in vitro mutagenesis), Science229:1193-1201 (1985) ;Carter 等，改進(jìn)的利用 M13 載體 的寡核苷酸定向誘變（Improved oligonucleotide site-specific mutagenesis using M13Vector)，Nucl Acids Resl3 :4431-4443 (1985) ; Gmndstrdni 等，通過小規(guī)模'鳥 槍'基因合成進(jìn)行寡核苷酸定向誘變（oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale'shot-gun'gene synthesis), Nucl Acids Resl3 :3305-3316(1985) ；KunkeI, 不進(jìn)行表型選擇的快速有效的定點(diǎn)誘變（Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)，Proc Natl Acad Sci USA82:488-492 (1985)； Smith，體外誘變（In vitro mutagenesis)，Ann Rev Genetl9:423-462 (1985) ；Taylor 等，在限制性酶反應(yīng)中使用硫代磷酸酯修飾的DNA制備帶切口的DNA (The use of phosphorothioat-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA)，Nucl Acids Resl3 :8749-8764(1985) ;Taylor 等，利用硫代磷酸酯修飾的 DNA 高 頻快速產(chǎn)生寡核苷酸定向突變（The rapid generation of oligonucleotide-directed mutaiton at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)， Nucl Acids 旦亞13 :8765-8787 (1985) ;Wells等，盒誘變：在確定位點(diǎn)產(chǎn)生多個突變的有效方法 (Cassette mutagenesis ：an efficient method for generation of multiple mutation at defined sites)，Gene34:315-323 (1985) ;Kramer等，進(jìn)行寡核苷酸定向突變構(gòu)建的缺 口雙鏈體 DNA 方法（The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction), Nucl Acids Resl2 :9441-9456 (1984) ;Kramer 等，點(diǎn)錯配修 復(fù)（Point Mismatch Repair), Cel 138:879-887 (1984) ;Nambiar 等，核糖核酸酶 S 蛋白 編碼基因的總合成和克?。═otal synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein), Science223 :1299-1301 (1984) ;Zoller 和 Smith，考慮到 M13 載體中的DNA片段的寡核苷酸定向誘變（oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragment cloned into M13vector), Methods in Enzymol 100:468-500 (1983);以 及Zoller和Smith，利用M13衍生載體進(jìn)行寡核苷酸定向誘變：在任何DNA片段中產(chǎn)生點(diǎn) 突變的有效的普通方法（oligonucleotide-directed mutagenesis using M13_derived vector ：an efficient and general procedure for the production of point mutation in any DNA fragment), Nucl Acids ReslO: 6487-6500 (1982) 〇 上述方法的其它細(xì)節(jié)可在 《酶學(xué)方法》(Methods in Enzvmol)第154卷中找到，其中也描沭了有關(guān)不同誘奪、某閔分 離、表達(dá)和其它方法的有用問題解決控制方法。
[0166] 用于如本發(fā)明誘變?nèi)鐚⒈景l(fā)明HA和/或NA分子文庫進(jìn)行突變或更改的寡核苷酸 通常根據(jù) Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Letts22 (20) : 1859-1862，（1981)所述固 相亞磷酰胺三酯方法化學(xué)合成，如利用自動合成儀，如Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res, 12:6159-6168(1984)所述。
[0167] 此外，基本上任何核酸均可通過數(shù)種商業(yè)來源定制或標(biāo)準(zhǔn)訂購，如中部認(rèn)證試劑 公司（The Midland Certified Reagent Company) (mcrc@oligos.com)、大美國基因公司 (The Great American Gene Company) (www. genco. com)、快速基因公司（ExpressGen Inc.) (www. expressgen.com)、歐普龍技術(shù)公司（Operon Technologies Inc.)(加州阿拉米達(dá) (Alameda，CA))及其它來源。同樣，也可從任何數(shù)種資源定制肽和抗體，如（派普肽金尼克 公司）（PeptidoGenic) (pkimOccnet. com)、HTI 生物產(chǎn)品公司（HTI Bio-products，Inc.) (www. htibio. com)、BMA生物醫(yī)學(xué)有限公司（BMA Biomedicals Ltd.)(英國）、生物合成公 司（Bio. Synthesis，Inc.)及其它。
[0168] 本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明HA和/或NA分子或其它多肽和/或核酸，如SEQ ID NO: 1-45的宿主細(xì)胞和生物體。利用本發(fā)明載體遺傳工程改造宿主細(xì)胞（如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn) 染），本發(fā)明載體可以是（例如）克隆載體或表達(dá)載體。載體可為，例如，質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸 露多核苷酸或偶聯(lián)多核苷酸的形式。通過以下標(biāo)準(zhǔn)方法將載體引入細(xì)胞或微生物：電穿孔 (參見，F(xiàn)rom等，Proc Natl Acad Sci USA82,5824 (1985)、病毒載體感染、小珠或顆粒基質(zhì) 內(nèi)部或表面具有核酸的顆粒高速彈道穿透（Klein等，Nature327,70-73 (1987) )〇 Berger, Sambrook和Ausubel提供了數(shù)種合適的轉(zhuǎn)化方法。參見上文。
[0169] 本發(fā)明可利用數(shù)種已知在細(xì)菌細(xì)胞中引入靶核酸的方法，它們均可用于本發(fā)明。 這些方法包括：將受體細(xì)胞和含DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、微粒轟擊、用病毒載體 感染等?？墒褂眉?xì)菌細(xì)胞擴(kuò)增含本發(fā)明DNA構(gòu)建物質(zhì)粒的數(shù)目。細(xì)菌生長至對數(shù)期，可利用 本領(lǐng)域已知數(shù)種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒（參見例如Sambrook)。此外，用市售的各種試劑盒 純化細(xì)菌質(zhì)粒（參見例如，來自法瑪西亞生物技術(shù)公司的EasyPrep?，F(xiàn)lexiPrep? ;來自絲 材特基因公司的StrataClean? ;以及凱杰公司的QIApr印?)。進(jìn)一步操作分離并純化的質(zhì) 粒產(chǎn)生其它質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或摻入相關(guān)載體以感染生物體。典型的載體包含轉(zhuǎn)錄、翻譯 終止子和轉(zhuǎn)錄、翻譯起始序列，以及用于調(diào)節(jié)特定靶核酸表達(dá)的啟動子。載體任選包含普通 表達(dá)盒，表達(dá)盒含有至少一個獨(dú)立終止序列，允許表達(dá)盒在真核、原核或兩者中（如穿梭載 體）復(fù)制的序列以及原核和真核系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記。載體可在原核、真核或任選兩者中復(fù) 制和整合。參見，Giliman 和 Smith, Gene8:81 (1979) :Roberts,等，Nature, 328:731 (1987)； Schneider, B. ^,Protein Expr Purif6435:10 (1995) ;Ausubel，Sambrook，Berger (所有 同上）。用于克隆的細(xì)菌和噬菌體目錄由ATCC提供，如，《ATCC細(xì)菌和噬菌體目錄》OM ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage) (1992)Gherna ^ ()ATCC 其 它測序、克隆及分子生物學(xué)其它方面基礎(chǔ)步驟以及其理論探討可參見Watson等（1992)1 組 DNA (Recombinant DNA)第二版（科學(xué)美國人圖書公司)(Scientific American Books)， 紐約。如上所述。在上文有關(guān)流感病毒疫苗生產(chǎn)的章節(jié)及其引用文獻(xiàn)中闡述了用于本文序 列的其它載體。
[0170] 多肽生產(chǎn)和回收
[0171] 在轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系或細(xì)胞株并使其生長至合適細(xì)胞密度后，利用合適方法 誘導(dǎo)所選啟動子（如，改變溫度或化學(xué)誘導(dǎo)），將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。在一些實(shí)施方式中， 可從培養(yǎng)基中回收分泌的多肽產(chǎn)物，如分泌融合蛋白形式中的HA和/或NA多肽。在其它 實(shí)施方式中，細(xì)胞產(chǎn)生含本發(fā)明HA和/或NA多肽的病毒顆粒?；蛘?，可離心收集細(xì)胞，通 過物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞并保留所得粗提物進(jìn)一步純化?？墒褂萌魏畏奖惴椒ㄆ扑楸磉_(dá) 蛋白所使用的真核或微生物細(xì)胞，包括反復(fù)凍融、超聲、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解試劑或其 它方法，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人熟知這些方法。此外，可使用表達(dá)本發(fā)明HA和/或NA多肽產(chǎn)物 的細(xì)胞而不將多肽從細(xì)胞中分離。在此種情況下，本發(fā)明多肽可任選表達(dá)于細(xì)胞表面并因 此可用細(xì)胞表面結(jié)合抗體等檢測（如通過具有HA和/或NA分子或其片段的融合蛋白等形 式）。此類細(xì)胞也是本發(fā)明的特點(diǎn)。
[0172] 可通過本領(lǐng)域熟知的任何方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化表達(dá)的多肽，包括 硫酸銨或或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用 色譜、親和色譜（如使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員指導(dǎo)的任何標(biāo)簽系統(tǒng)）、羥基磷灰石色譜和凝 集素色譜。根據(jù)需要可在完成成熟蛋白構(gòu)型的過程中使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。也可以在 最終純化步驟中使用高效液相色譜（HPLC)。除了本文注明的參考文獻(xiàn)外，本領(lǐng)域熟知數(shù)種 純化方法，包括如下文獻(xiàn)列出的那些：Sandana(1997)《蛋白的生物分離》(Bioseparation of proteins),科學(xué)出版公司（Academic Press，Inc.)和 Bollag 等（1996)《蛋白方 法（第二版）》(Protein Methods, 2nd Edition)韋利李斯公司，紐約(Wiley-Liss，NY); Walker(1996)《蛋白實(shí)驗(yàn)手冊》(The Protein Protocols Handbook)Humana出版公司，紐約， Harris 和 Angal (1990)《蛋白純化應(yīng)用：方法實(shí)踐》(Protein purification application:A practical approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭（Press at Oxford，Oxford, England) ;Harris 和 Angal《蛋白純化方法：方法實(shí)踐》(Protein Purification Methods ： A Practical Approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭(Press at Oxford，Oxford, England) ;Scopes (1993)《蛋白純化：原理和實(shí)踐（第三版）》(Protein Purification ： Principles and PracticeSai Edition 施普林格佛萊格公司，紐約(Springer Verlag，NY); Janson和Ryden(1998)《蛋白純化：原理、高分辨率方法及其應(yīng)用(第二版）》（Pintein Purification ：Principles,High Resolution Methods and Applications,韋利-VCH公司, 紐約（Wiley_VCH，NY):和Walker(1998)CD_R0M上的蛋白實(shí)騎方法（P:rotein P:rotocols on CD-ROM)休曼出版公司(Humana Press)，紐約。
[0173] 在病毒中生產(chǎn)本發(fā)明表達(dá)多肽時，病毒通常從感染（轉(zhuǎn)染）細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中 回收。通常，在濃縮流感病毒前澄清粗培養(yǎng)基。一般的方法包括超濾、硫酸鋇吸附和洗脫 以及離心。例如，來自感染培養(yǎng)物的粗培養(yǎng)基首先離心澄清，如1000-2000x g離心足夠長 的時間以去除細(xì)胞碎片和其它大顆粒物質(zhì)，如離心10-30分鐘。任選的，離心澄清培養(yǎng)基上 清使流感病毒成團(tuán)，如15, OOOx g離心約3-5小時。接下來將病毒團(tuán)塊重懸于合適的緩沖 液，如 STE(0. OlM Tris-HCl ;0· 15M NaCl ;0· 0001M EDTA)或磷酸緩沖鹽水（PBS)pH7. 4 中， 在蔗糖（60% -12% )或酒石酸鉀（50% -10% )中密度梯度離心病毒。連續(xù)梯度或步進(jìn) 梯度均可，如12% -60%的4個12%步長的蔗糖梯度。以一定速度和時間進(jìn)行梯度離心， 所用時間足以使病毒濃縮于可見條帶中用于回收?；蛘?，對于多數(shù)大規(guī)模商用，用分帶離 心轉(zhuǎn)頭以連續(xù)模式從密度梯度中淘選病毒。其它在組織培養(yǎng)物中制備流感病毒的足以指 導(dǎo)技術(shù)人員的細(xì)節(jié)參見Nicholson等（編）《流感教科書》(Textbook of Influenza)第 324-332 頁的 Furminger.《疫苗生產(chǎn)》（Vaccine Production) ;Cohen 和 Shafferman (編） 〈〈設(shè)計和牛.產(chǎn)疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccine) 第141-151頁Merten等（1996)《從細(xì)胞培養(yǎng)物中制生產(chǎn)用于制備疫苗的流感病毒》 (Production of influenza virus incellcultures for vaccine preparation),以及美 國專利號5, 690, 937。需要的話可將回收病毒在作為穩(wěn)定劑的蔗糖磷酸谷氨酸（SPG)存在 下存儲于_8〇°C。
[0174] 或者，可使用無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生包含本文給定序列如SEQ ID NOS :11-20 或27-32或39-44的氨基酸序列或亞序列，或由本發(fā)明多核苷酸序列如SEQ ID NOS :1-10 或21-26或33-38或45編碼的氨基酸序列或亞序列的多肽?？少彽脭?shù)種合適的體外轉(zhuǎn)錄和 翻譯系統(tǒng)。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)驗(yàn)方案的通用指南參見Tymms (1995)《體外轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)驗(yàn) 方案:分子牛.物學(xué)方法》（In vitro Transcription and Translation Protocols ：Methods in Molecular Biology 第 37 卷，加蘭出版公司，紐約(Garland Publishing，NY)。
[0175] 此外，多肽或其亞序列，如含抗原性肽的亞序列，可通過手工或自動化系統(tǒng)合成， 如利用固相技術(shù)直接進(jìn)行肽合成（參見，Stewart等（1969)《固相肽合成》(Solide-Phase Peptide Synthesis) ,WH佛理茫公司，丨日金山(WH Freeman Co, San Francisco) ;Merrifield T(1963) T Am Chem Soc85:2149-2154)。示例性的自動化系統(tǒng)包括應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems)431A肽合成儀（拍金愛爾默公司，加州福斯特城（Perkin Elmer, Foster City，CA)。根據(jù)需要可以分別合成亞序列，并用化學(xué)方法組合提供全長多肽。
[0176] 修飾氨基酸
[0177] 本發(fā)明表達(dá)多肽能含一個或多個修飾氨基酸。修飾氨基酸存在的優(yōu)勢在于，例如， (a)增加多肽血清半衰期，（b)降低/增加多肽抗原性，（c)增加多肽存儲穩(wěn)定性等。例如， 在重組生產(chǎn)的翻譯時或翻譯后（如，在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)時N-X-S/T基序的N連接糖基化） 或通過合成手段（如，通過PEG化）進(jìn)行氨基酸修飾。
[0178] 修飾的氨基酸的非限制性例子包括糖基化的氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊烯基化 (如法尼基化、櫳牛兒基櫳牛兒基化）氨基酸、乙?；被帷Ⅴ；被帷EG化氨基酸、 生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等，以及與脂部分或其它有機(jī)衍生物質(zhì)偶聯(lián)的 修飾氨基酸。文獻(xiàn)中遍布足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行氨基酸修飾的參考內(nèi)容。示例性的實(shí)驗(yàn)方 案參見Walker (1998)《CD-ROM上的蛋白實(shí)驗(yàn)方案》(Protein Protocols on CD-ROM)休曼 出版社iHuman Press}_，新澤西州托瓦它（Towata，NJ)。
[0179] 融合蛋白
[0180] 本發(fā)明也提供融合蛋白，該融合蛋白含有本發(fā)明序列（如SEQ ID NO :11_20、 27-32和39-44示例的編碼HA和/或NA多肽的序列）或其具有如免疫球蛋白（或其部 分）、GFP(綠色熒光蛋白）編碼序列或其它類似標(biāo)記物的片段。編碼此類融合蛋白的核苷 酸序列是本發(fā)明另一方面。本發(fā)明的融合蛋白任選用于，如，與本發(fā)明非融合蛋白類似的應(yīng) 用（包括，如，治療、預(yù)防、診斷、實(shí)驗(yàn)等本文所述的應(yīng)用）。除了與免疫球蛋白序列和標(biāo)記序 列融合，本發(fā)明蛋白也可任選與用于分選融合蛋白和/或使融合蛋白靶向特定細(xì)胞類型、 區(qū)域等的序列融合。
[0181] 抗體
[0182] 本發(fā)明的多肽能用于生產(chǎn)本文給定多肽和/或本發(fā)明多核苷酸（如本文所示的那 些及其保守性變體）編碼多肽的特異性抗體。上述提及多肽的特異性抗體可用于如診斷和 治療目的，如關(guān)于靶多肽的活性、分布和表達(dá)。
[0183] 可通過本領(lǐng)域熟知方法產(chǎn)生本發(fā)明多肽的特異性抗體。此類抗體能包括但不限 于：多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
[0184] 抗體生產(chǎn)所用多肽無需生物學(xué)活性（如，無需全長功能性血凝素或神經(jīng)氨酸酶）。 然而，多肽或寡肽必須具有抗原性。用于誘導(dǎo)特異性抗體的肽通常具有至少4個氨基酸的 序列，常常至少5個或10個氨基酸。多肽的短臂可與另一蛋白，如鑰孔血藍(lán)素及抗嵌合分 子的抗體融合。
[0185] 本領(lǐng)域技術(shù)人員了解數(shù)種制造多克隆和單克隆抗體的方法，這些方法適合生產(chǎn)本 發(fā)明多肽和/或本發(fā)明多核苷酸序列編碼多肽的特異性抗體。參見例如，Coligan(1991) 《新編免疫學(xué)實(shí)騎方案》(Current Protocols in Immunology)紐約韋利/格林公司(Wiley/ Greene，NY) ;Paul (編）（I"8)《基礎(chǔ)免疫學(xué)第四版》(Fundamenta.1 Tmmunology, Fourth Edition), Lippincott-Raven, Lippincott Williams 和 Wilkins ;Harlow 和 Lane (1989) 《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibody :A Laboratory Manual),紐約冷泉滿出版社(Cold Spring Harbor Press, NY) ;Stites等（編）《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)（第四版）》(Basic and Clinical Immunology (4th ed.))，蘭格醫(yī)學(xué)出版公司，加州洛斯阿爾托斯（Lange Medical Publications, Los Altos, CA)及其引用文獻(xiàn)；Goding(1986)《單克隆抗體：原理和實(shí)踐 (第二版）》(Monoclonal antibody ：Principles and Practice (2d ed·))科學(xué)出版社， 紐約（Academic Press, New York, NY) ;Kohler 和 Milstein(1975)Nature256:495_497。 其它合適的抗體制備技術(shù)包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫。參見，Huse等 (1989)Science246 :1275-1281 ;和 Ward 等(1989) Nature341 :544_546。特異性單克隆和多 克隆抗體和抗血清結(jié)合的KD，如至少約0. 1 μ M，至少約0. 01 μ M或更好，并且，通常至少約 0.001 μ M或更好。
[0186] 對于某種治療性應(yīng)用，需要人源化抗體。制備嵌合（人源化）抗體的方法參見美國 專利5, 482, 856。人源化和其它抗體生產(chǎn)和工程改造技術(shù)的其它細(xì)節(jié)參見Borrebaeck(編） (1995)《抗體工程第二版》（Antibody Engineering, 2Μ Edition)佛理茫和公司，紐約 (Borrebaeck) (Freeman and Company，NY(Borrebaeck)) ;McCafTerty 等（I"6)《抗體 工程，實(shí)踐方法》(Engineering, A Practical Approach), IRL牛津出版社,牛津,英格蘭 (McCafferty) (IRL at Oxford Press，Oxford，England (McCafferty))以及和 Paul (1995) 《抗體工程手冊》(Engineering Protocols)休曼出版社，紐約（Paul) (Humana Press, Towata，NJ (Paul))。其它特定步驟的細(xì)節(jié)可參見 Ostberg 等(1983) ,Hybridoma2 :361-367, Ostberg，美國專利號 4, 634, 664,和 Engelman 等，美國專利號 4, 634, 666。
[0187] 由免疫反應(yīng)性定義多肽
[0188] 由于本發(fā)明多肽提供了多種新的多肽序列（如含有HA和NA分子的多肽序列），因 此多肽也提供了可在如免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中被識別的新結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。因此生產(chǎn)能特異性結(jié)合本發(fā)明 多肽的抗血清以及此類抗血清結(jié)合的多肽也是本發(fā)明的特點(diǎn)。
[0189] 例如，本發(fā)明包括能夠與抗體或抗血清特異性結(jié)合或者對抗體或抗血清具有特異 免疫反應(yīng)性的多肽（如，HA和NA分子），其中抗體或抗血清所抗免疫原包含選自一個或多 個本文給定序列（如，SEQ ID NO :11-20、27-32和39-44)等的氨基酸序列。為了減少與其 它同源物的交叉反應(yīng)，用提交時公共數(shù)據(jù)庫中的HA和/或NA分子如"對照"多肽對抗體或 抗血清進(jìn)行消減。當(dāng)其它對照序列對應(yīng)核酸時，產(chǎn)生由核酸編碼的多肽并用于抗體/抗血 清消減目的。
[0190] 在一個典型形式中，免疫實(shí)驗(yàn)使用的多克隆抗血清是用含一個或多個對應(yīng)本文序 列（如SEQ ID N0:ll-20、27-32和39-44)等或其亞序列（即占所提供全長序列的至少約 30%)的一種或多種多肽產(chǎn)生的。起源于當(dāng)前序列的一套潛在多肽免疫原下文統(tǒng)稱為"免 疫原性多肽"。任意選擇所得抗血清使其對對照血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶同系物具有低交 叉反應(yīng)性，并且在免疫實(shí)驗(yàn)使用多克隆抗血清之前通過免疫吸附消除與一種或多種對照血 凝素和神經(jīng)氨酸酶同系物的交叉反應(yīng)性。
[0191] 為了生產(chǎn)免疫實(shí)驗(yàn)中所用抗血清,按照本文所述生產(chǎn)一種或多種免疫原性多肽并 純化。例如，能在重組細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。按照標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫實(shí)驗(yàn)方案（參見例如， Harlow 和 Lane (1988)《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibody, A Laboratory Manual),冷泉滿出 版公司（Cold Spring Harbor Publications),紐約），用免疫原性蛋白和標(biāo)準(zhǔn)佐劑如弗氏 佐劑免疫純系小鼠（用于本實(shí)驗(yàn)的原因是由于該小鼠遺傳背景基本相同導(dǎo)致結(jié)果更具重 現(xiàn)性），上述文獻(xiàn)中包含關(guān)于可用于測定特異性免疫反應(yīng)性的抗體產(chǎn)生、免疫實(shí)驗(yàn)形式及條 件的標(biāo)準(zhǔn)描述。其它抗體參考資料和討論可在本文中找到，并可用于利用免疫反應(yīng)性定義 多肽?；蛘?，將源于本文公開序列的一種或多種合成或重組的多肽與載體蛋白偶聯(lián)，并用作 免疫原。
[0192] 收集多克隆血清，并在免疫實(shí)驗(yàn)中測定抗免疫原性多肽的滴度，例如，使用在固體 支持物上固定一種或多種免疫原性蛋白的固相免疫實(shí)驗(yàn)。選擇滴度為IO 6或更高的多克隆 抗血清，匯集并用對照血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多肽消減以產(chǎn)生消減、匯集的已知滴度的 多克隆抗血清。
[0193] 在比較性免疫實(shí)驗(yàn)中檢測消減、匯集的已知滴度多克隆抗血清抗對照同系物的交 叉反應(yīng)性。在此比較性實(shí)驗(yàn)中，使用差異性結(jié)合條件檢測消減的已知滴度多克隆抗血清，已 知滴度抗血清與免疫原性多肽結(jié)合的信噪比至少比結(jié)合對照同系物信噪比高5-10倍。艮P， 通過加入非特異性競爭物如清蛋白或脫脂奶粉和/或調(diào)整鹽條件、溫度和或其它來調(diào)整結(jié) 合反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性。在接下來的實(shí)驗(yàn)中使用這些結(jié)合條件，以測定測試多肽（與免疫原性多 肽和/或?qū)φ斩嚯膶Ρ鹊亩嚯模┦欠裉禺愋耘c匯集的消減多克隆抗血清結(jié)合。具體說，在 差異性結(jié)合條件下，測試多肽比對照受試同源物信噪比高2-5倍，且信噪比是免疫原性多 肽的至少約1/2,與已知受體相比與免疫原性多肽具有顯著結(jié)構(gòu)相似性，因此是本發(fā)明的多 肽。
[0194] 在另一個實(shí)施例中，用競爭結(jié)合形式的免疫實(shí)驗(yàn)檢測受試多肽。例如，利用對照多 肽免疫吸附將交叉反應(yīng)抗體從匯集抗血清混合物中去除。然后將免疫原性多肽固定于固體 支持物上，隨后接觸消減、匯集的抗血清。將受試蛋白加入實(shí)驗(yàn)，以競爭結(jié)合匯集、消減的抗 血清。與固定蛋白相比，受試蛋白競爭結(jié)合匯集、消減的抗血清的能力與加入實(shí)驗(yàn)的免疫原 性多肽競爭結(jié)合的能力（免疫原性多肽與固定的免疫原性多肽有效競爭結(jié)合匯集的抗血 清）作比較。使用標(biāo)準(zhǔn)計算方法計算受試蛋白的交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)。
[0195] 在平行實(shí)驗(yàn)中，任選測定對照蛋白競爭結(jié)合匯集、消減的抗血清的能力，與免疫原 性多肽競爭結(jié)合抗血清的能力作比較。再次使用標(biāo)準(zhǔn)計算方法計算受試蛋白的交叉反應(yīng)百 分?jǐn)?shù)。當(dāng)受試蛋白交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)是對照多肽的至少5-10倍或受試多肽的結(jié)合大約在免 疫原性多肽結(jié)合范圍內(nèi)，則稱受試多肽特異性結(jié)合匯集、消減的抗血清。
[0196] 通常，可在如本文所述比較任何多肽與免疫原性和/或?qū)φ斩嚯牡母偁幗Y(jié)合免疫 實(shí)驗(yàn)中使用免疫吸附并匯集的抗血清。為了進(jìn)行比較，免疫原性、受試和對照多肽分別進(jìn)行 寬濃度范圍實(shí)驗(yàn)，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定每一多肽抑制50%消減抗血清結(jié)合固定對照、受試或 免疫原性多肽的多肽量。如果競爭實(shí)驗(yàn)中結(jié)合所需受試多肽的量小于所需免疫原性多肽量 的兩倍，則稱受試多肽特異性結(jié)合免疫原性蛋白的抗體，只要該量至少是比對照多肽的約 5-10 倍。
[0197] 作為特異性的另一測定，任選用免疫原性多肽（而非對照多肽）完全免疫吸附匯 集抗血清，直至檢測到所得免疫原性多肽消減、匯集的抗血清很少或沒有結(jié)合于免疫吸附 中使用的免疫原性多肽。然后測試該完全免疫吸附抗血清與受試多肽的反應(yīng)性。若觀察到 很少或沒有反應(yīng)（即，不超過完全免疫吸附抗血清結(jié)合免疫原性多肽信噪比的2倍），則受 試多肽特異性結(jié)合于免疫原性蛋白產(chǎn)生的抗血清。
[0198] 核酸和多肽序列變體
[0199] 如本文所述，本發(fā)明提供核酸多核苷酸序列和多肽氨基酸序列，如血凝素和神經(jīng) 氨酸酶序列，以及包含所述序列的組合物和方法。本文公開所述序列的例子（如SEQ ID NO: 1-45)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到本發(fā)明提供的這些序列并不限制本發(fā)明，并且本發(fā) 明也提供許多具有本文所述功能的相關(guān)和非相關(guān)的序列，如編碼HA和/或NA分子的序列。
[0200] 技術(shù)人員也將意識到本發(fā)明包括許多所公開序列的變體。例如，本發(fā)明包括所公 開序列通過保守性變異產(chǎn)生的功能相同的序列。如果核酸多核苷酸序列的變體能與至少一 條公開序列雜交，那么該變體也應(yīng)該包括在本發(fā)明中。本發(fā)明也包括通過如標(biāo)準(zhǔn)序列比對 技術(shù)確定的本文公開序列的獨(dú)特亞序列。
[0201] 沉默變異
[0202] 由于遺傳密碼的簡并性，可任選產(chǎn)生任何編碼本發(fā)明多肽和/或病毒的多種核酸 序列，其中一些與本文HA和NA核酸和多肽序列具有較低水平的序列相同性。下文提供了 詳細(xì)遺傳密碼的密碼子表，可在許多生物學(xué)和生化教科書中找到。
[0203] 表 1
[0204] 密碼子表
[0205]
【權(quán)利要求】
1. 一種6:2重配流感病毒，其中所述病毒包含來自一個或多個供體病毒的6個內(nèi)部基 因組區(qū)段以及編碼HA多肽和NA多肽的2個基因組區(qū)段，其中所述HA多肽具有SEQ ID NO: 39的氨基酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的重配流感病毒，其中所述NA多肽具有SEQ ID NO :40的氨基酸 序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的重配流感病毒，其中所述編碼HA多肽的基因組區(qū)段具有SEQ ID NO :33的核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的重配流感病毒，其中所述編碼NA多肽的基因組區(qū)段具有SEQ ID NO :34的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感病毒，其中所述一個或多個供體病毒包括 A/Ann Arbor/6/60 供體病毒。
6. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感病毒，其中所述一個或多個供體病毒包括 A/Ann Arbor/6/60以外的供體病毒。
7. 如權(quán)利要求6所述的重配流感病毒，其中所述一個或多個供體病毒是PR8或A/ Leningrad/17〇
8. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感病毒，其中所述一個或多個供體病毒選自 一種或多種下列表型：減毒、冷適應(yīng)性和溫度敏感性。
9. 一種免疫原性組合物，其含有免疫有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感 病毒。
10. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述HA多肽包含修飾的多堿性 切割位點(diǎn)。
11. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感病毒在藥物制備中的用途，所述藥物以 免疫有效量于生理有效載體中給予個體來刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對抗流感病毒的保護(hù)性免疫 應(yīng)答。
12. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重配流感病毒在藥物制備中的用途，所述藥物以 免疫有效量給予個體來產(chǎn)生對抗病毒感染的免疫原性應(yīng)答用于所述病毒感染的預(yù)防或治 療性處理。
13. -種減毒的活流感疫苗，其含有權(quán)利要求9所述的組合物。
14. 一種分裂病毒或死病毒疫苗，其含有權(quán)利要求9所述的組合物。
15. -種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重配流感病毒的方法，所述方法包括： i) 將多個載體引入一群宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞群能夠支持流感病毒的復(fù)制，所述載 體含有對應(yīng)于來自一個或多個供體病毒的6個內(nèi)部基因組區(qū)段以及編碼HA多肽和NA多肽 的2個基因組區(qū)段的多種多核苷酸，其中所述HA多肽具有SEQ ID NO: 39的氨基酸序列； ii) 培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞群；和， iii) 回收流感病毒。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述NA多肽具有SEQ ID NO :40的氨基酸序列。
17. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述編碼HA多肽的基因組區(qū)段具有SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。
18. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述編碼NA多肽的基因組區(qū)段具有SEQ ID NO: 34的核苷酸序列。
19. 如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個或多個供體病毒選自一種 或多種下列表型：減毒、冷適應(yīng)性和溫度敏感性。
20. 如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個或多個供體病毒包括A/Ann Arbor/6/60供體病毒。
21. 如權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個或多個供體病毒包括A/Ann Arbor/6/60以外的供體病毒。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述一個或多個供體病毒是PR8或A/ Leningrad/17〇
【文檔編號】A61K39/145GK104278014SQ201410269606
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2006年8月9日
【發(fā)明者】楊青芬, G·坎寶, K·蘇巴拉奧, B·默菲 申請人:米迪繆尼有限公司, 美國政府健康及人類服務(wù)部