一種抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種抗菌肽及其應(yīng)用?？咕臑樾蛄斜鞸EQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。將抗菌肽用于制備魚類的抗細(xì)菌或病毒感染的抑制劑，即能顯著增強(qiáng)魚類的抗病毒和抗細(xì)菌能力。
【專利說(shuō)明】一種抗菌肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種抗菌肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽(antimicrobial peptide)是一種具廣譜抗菌、抗病毒甚至抗寄生蟲活性的陽(yáng)離子短肽?？咕耐ㄟ^(guò)其特有的兩性分子結(jié)構(gòu)結(jié)合于細(xì)胞膜上，從而破壞細(xì)胞膜，殺死細(xì)菌。不同于傳統(tǒng)的抗生素藥物，抗菌肽這種獨(dú)特的殺菌機(jī)制不會(huì)使靶細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且大部分抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，所以抗菌肽越來(lái)越引起人們的重視?？咕膹V泛存在于微生物以及動(dòng)植物體內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有1800多種。至今在魚類中鑒定出的抗菌月太包括 hepcidin, defensins, pleurocidin, piscidin, moronecidin, misgurain, par daxin, paras in, LEAP-2和NK-1ysin等數(shù)十種。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些抗菌肽具廣譜的抗菌活性，有些還具有抗病毒活性?？咕氖囚~類非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在魚類抵御病原感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，抗菌肽在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中具有巨大的應(yīng)用潛力和良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種抗菌肽及其應(yīng)用。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種抗菌肽，抗菌肽為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
[0006]所述抗菌肽的應(yīng)用，所述抗菌肽用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的抑制劑。
[0007]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的抗菌肽能夠明顯提高魚類抗病毒和抗細(xì)菌感染能力。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0009]實(shí)施例1
[0010]本發(fā)明的抗菌肽(命名為NKLP27)為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。
[0011]序列表SEQ ID N0.1 為:
[0012]KVKARLIKICNKIGFLKSRCHKFVITH
[0013](a)序列特征:
[0014]籲長(zhǎng)度:27
[0015]?類型:氨基酸序列
[0016]籲鏈型:單鏈
[0017]籲拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0018](b)分子類型:蛋白質(zhì)[0019](C)假設(shè):否
[0020](d)反義:否
[0021 ] (e)最初來(lái)源:半滑舌鰨
[0022]結(jié)構(gòu)特點(diǎn):富含堿性氨基酸
[0023]實(shí)施例2
[0024]抗菌肽的應(yīng)用
[0025]步驟I)抗菌肽的合成
[0026]上述實(shí)施例1的抗菌肽NKLP27由“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”合成，純度>90%。
[0027]步驟2)抗菌肽注射
[0028]將上述步驟I)的合成抗菌肽在PBS中稀釋至20ug/ml，即為抗菌肽稀釋液。將20條半滑舌鰨(重約10.1g)隨機(jī)分為4組，每組5條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別注射50ul抗菌肽稀釋液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚分別注射50ul PBS0
[0029]所述PBS 組成成分按重量百分比計(jì):0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量為水。
[0030]步驟3)細(xì)菌和病毒懸液制備
[0031]在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)鰻弧菌C312至OD6tltl為0.8，然后離心(5000g，4 °C，IOmin),收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為106cfu/ml，即為鰻弧菌懸液。將細(xì)胞腫大病毒RBIV-Cl (具體制備方法見(jiàn)Zhang M, Xiao Z, Hu Y, SunL.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀釋至105copies/ml,即為病毒懸液。
[0032]所所述鰻弧菌C312保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.6250，保藏日期2012.6.21,分類命名為鰻弧菌(Vibrio anguillarum)。
[0033]步驟4)攻毒感染
[0034]在上述步驟2)注射后lh，將A和B組的每條魚注射IOOul上述步驟3)的鰻弧菌懸液，將C和D組的每條魚注射IOOul上述步驟3)的病毒懸液。在細(xì)菌感染后第I天，取A和B組魚腎臟和脾臟組織，在2mlPBS中勻漿，將IOOul勻漿液涂布于LB平板。將平板置于30°C培養(yǎng)48h，計(jì)算出現(xiàn)的菌落數(shù)。在病毒感染后第5天，利用DNA提取試劑盒(購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司”)從C和D組魚腎臟和脾臟組織中提取DNA，用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)組織中病毒含量(具體方法見(jiàn)上述參考文獻(xiàn))。結(jié)果表明A組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)(分別為2.1xlO2和7.3xl02)顯著(P〈0.01)低于B組魚腎臟和脾臟的細(xì)菌數(shù)(分別為4.2xl02和2.5x103)；C組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)(分別為2.5xl03和8.7xl05)顯著(Ρ〈0.01)低于D組魚腎臟和脾臟的病毒數(shù)(分別為3.1xlO5和4χ106)。
[0035]這些結(jié)果表明，本發(fā)明的抗菌肽NKLP27能夠顯著增強(qiáng)魚類抵抗細(xì)菌和病毒的侵染。
【權(quán)利要求】
1.一種抗菌肽，其特征在于:抗菌肽為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于:所述抗菌肽用于制備抗細(xì)菌或病毒感染的抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK103804482SQ201410067697
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】孫黎, 張敏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所