丁香葉提取物在抑制豬鏈球菌以及干預(yù)和消除豬鏈球菌生物被膜中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了丁香葉提取物在抑制豬鏈球菌以及干預(yù)或消除豬鏈球菌生物被膜中的用途。本發(fā)明通過結(jié)晶紫法和掃描電鏡方法研究丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形成的干預(yù)作用及對(duì)成熟的豬鏈球菌生物被膜的消除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成有明顯的干預(yù)作用，對(duì)豬鏈球菌成熟生物被膜有顯著的消除作用，表明丁香葉提取物可以抑制豬鏈球菌的黏附，抑制豬鏈球菌生物被膜的形成并對(duì)成熟的生物被膜有消除作用。本發(fā)明為由豬鏈球菌生物被膜引起的相關(guān)感染提供了一種新的治療途徑。
【專利說明】丁香葉提取物在抑制豬鏈球菌以及干預(yù)和消除豬鏈球菌生物被膜中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及丁香葉提取物新的藥理用途，尤其涉及丁香葉提取物在抑制豬鏈球菌以及干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成、消除豬鏈球菌成熟生物被膜中的用途，屬于丁香葉提取物的藥理用途領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]豬鏈球菌(Streptococcus suis, S.suis)是一種重要的人畜共患病病原體,可感染豬導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等，其致病力強(qiáng)、病死率高、耐藥性強(qiáng)，是引起豬發(fā)病的重要致病菌。近年來由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，S.suis對(duì)幾乎所有抗生素的敏感性都在下降，致使S.suis感染率呈逐年上升趨勢(shì)。S.suis的耐藥機(jī)制包括多個(gè)方面，其中一點(diǎn)就是可以在其表面形成一層生物被膜(Biofilm，BF), BF是細(xì)菌產(chǎn)生多聚復(fù)合物基質(zhì)將自身包繞，粘附于無活性物體或活體表面，形成的有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體；它可以抵抗宿主免疫力和抗生素作用，被膜內(nèi)細(xì)菌容易對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性，造成感染難以治愈，反復(fù)發(fā)作。
[0003]細(xì)菌生物被膜是由于單一或多種類細(xì)菌為了適應(yīng)周圍環(huán)境，吸附于異物或組織表面，繁殖并分泌大量多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，使得細(xì)菌相互粘連、聚集、形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的膜樣結(jié)構(gòu)，是細(xì)菌微菌落聚集體。生物被膜的形成包括初始黏附階段、表面微菌落的形成、分化成為成熟3個(gè)過程。導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)生，難以控制，生物被膜一旦形成，膜內(nèi)細(xì)菌比浮游細(xì)菌耐藥性增加100~1000倍以上。生物被膜阻止和抑制巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、抗體及抗生素侵入生物被膜中殺滅細(xì)菌，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)生，難以控制。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明十四、十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有干預(yù)或者消除s.SUiS生物被膜的作用，但中藥對(duì)S.SUiS生物被膜的干預(yù)或者消除作用鮮見報(bào)道。
[0005]現(xiàn)代藥理研究證明丁香葉具有清熱解毒、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、祛痰鎮(zhèn)咳等功效。但丁香葉對(duì)豬鏈球菌生物被膜有抑制或消除作用方面的研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的是提供丁香葉提取物的新的藥理用途。
[0007]本發(fā)明首先在體外建立豬鏈球菌(S.suis)生物被膜模型，觀察丁香葉水提物對(duì)s.SUiS生物被膜的作用。通過丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜干預(yù)與消除作用的研究，為豬鏈球菌生物被膜引起的相關(guān)感染提供新的治療途徑。
[0008]本發(fā)明通過結(jié)晶紫法(CV)和掃描電鏡方法評(píng)價(jià)丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)與消除作用以及對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形態(tài)學(xué)影響。掃描電鏡下觀察表明丁香葉提取物在1/2MIC濃度對(duì)豬鏈球菌生物被膜有明顯的干預(yù)與消除作用表明丁香葉提取物可以抑制豬鏈球菌的黏附，干預(yù)豬鏈球菌生物被膜的形成并對(duì)成熟的生物被膜有消除作用。
[0009]此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，丁香葉提取物對(duì)于豬鏈球菌有非常顯著的抑制作用，因此，可以將丁香葉提取物制備成抑制豬鏈球菌的藥物。
[0010]本發(fā)明提供一種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，該藥物組合物包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料和載體。
[0011]本發(fā)明還提供了一種抑制豬鏈球菌生物被膜生長(zhǎng)的藥物組合物，該藥物包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料和載體。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步的提供了一種消除豬鏈球菌生物被膜的藥物組合物，該藥物組合物包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料和載體。
[0013]本發(fā)明中所述的丁香葉提取物可以是丁香葉水醇混合提取物、丁香葉水提取物或丁香葉醇提取物。丁香葉水醇混合提取物、丁香葉水提取物或丁香葉醇提取物的制備方法已在文獻(xiàn)中公開，按照文獻(xiàn)中所公開的各種提取方法(包括水醇混合提取法、醇提法或水提法)所得到丁香葉提取物均能適用于本發(fā)明。
[0014]作為參考，本發(fā)明的一種丁香葉水醇混合提取物的制備方法，包括:丁香葉粉碎后用稀乙醇浸泡后提取，提取液濃縮，即得；所述的稀乙醇為20-50%乙醇，優(yōu)選為40%乙醇；所述的提取為在65°C溫度下提取60min。
[0015]有關(guān)丁香葉藥理作用的研究表明，丁香葉生物活性較高，作用效果持久。目前多采用抗生素對(duì)豬鏈球菌生物被膜進(jìn)行干預(yù)和消除，不僅毒副作用較大、而且易使微生物產(chǎn)生耐藥性的弊端；采用丁香葉提取物能夠有效干預(yù)豬鏈球菌生物被膜的形成或消除豬鏈球菌生物被膜，不存在毒副作用，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，具有抗菌和抗病毒的持久性；丁香葉是一類分布極廣的植物，資源豐富，使用安全，所以將丁香葉提取物應(yīng)用于制備成干預(yù)或消除豬鏈球菌生物被膜的藥物，在臨床上的應(yīng)用前景非常樂觀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 丁香葉提取物1/2MIC對(duì)豬鏈球菌(S.suis)生物被膜的干預(yù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0017]圖2 丁香葉提取物1/2MIC對(duì)豬鏈球菌(S.suis)生物被膜的消除作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018]通過下列實(shí)施例將更具體說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]實(shí)驗(yàn)材料
[0020]I菌株:豬鏈球菌(S.suis)(分離株)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。
[0021]2藥物:丁香葉(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)，發(fā)明人自行采摘)、阿奇霉素。
[0022]3培養(yǎng)基:THB培養(yǎng)基。
[0023]4試劑:pH7.4磷酸鹽緩沖溶液、結(jié)晶紫、甲醇、冰乙酸、犢牛血清、FeCl30
[0024]5材料:卡爾加里生物膜裝置、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、0.22 μ m濾膜。
[0025]實(shí)施例1 丁香葉提取物的制備
[0026]量取丁香葉50g，粉碎后加40%乙醇500mL，溫室浸泡一小時(shí)，65°C提取3h，倒出藥液，12層紗布過濾，再加入40%乙醇300mL65°C提取60min，倒出藥液同樣用12層紗布過濾，合并藥液濃縮至一定濃度，濾液經(jīng)凍干機(jī)凍干。精密稱量?jī)龈煞勰﹍g，用4mL去離子水溶解,離心取上清液,用0.22 μ m濾膜過濾，保存在4°C備用。
[0027] 實(shí)驗(yàn)例I 丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌(S.suis)的干預(yù)和消除作用實(shí)驗(yàn)
[0028]I試驗(yàn)方法
[0029]1.1 丁香葉提物對(duì)S.suis的最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定
[0030]試驗(yàn)操作及結(jié)果判定按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法進(jìn)行測(cè)定丁香葉提取物對(duì)S.suis的最低抑菌濃度(MIC)。
[0031]將豬鏈球菌菌株接種于THB瓊脂平板，37 °C培養(yǎng)過夜。取單個(gè)菌落接種于THB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h~16h。比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)瞎軕乙?LOXlO8Cfu.mL-1),然后用THB培養(yǎng)基稀釋為約1.0 X IO6Cfu.mL'依次向無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入THB培養(yǎng)基，除第I孔加入160 μ L THB培養(yǎng)基外，其余每管加入100 μ L THB,在第I孔加入丁香葉提取液40 μ L混勻,然后吸取100 μ L至第2孔,混勻后再吸取100 μ L至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100 μ L棄去，第12孔為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。然后在每孔內(nèi)加入上述制備好的S.suis菌液各100 μ L，使每管最終菌液濃度約為5X 105CFU/mL.第I孔至第11孔藥物濃度分別為25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、l.5625mg/ml、0.78125mg/ml 等。混勻后蓋好，于 37°C孵育 24h。以肉眼觀察，無細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度孔，即為丁香葉提取物對(duì)S.suis的MIC。
[0032]1.2S.suis生物被膜模型建立
[0033]將豬鏈球菌菌株接種于THB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜。取單個(gè)菌落接種于THB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h~16h。將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尀榧s1.0X IO6Cfu·mL-1,取200 μ L接種于卡爾加里生物被膜裝置中，只含THB培養(yǎng)基的孔為對(duì)照組，混勻后蓋好，37°C,50rmp搖床上孵育72h。取出卡爾加里生物被膜裝置，用移液槍棄去培養(yǎng)基并用滅菌的PBS (pH7.2)輕輕洗滌三次以去除游離菌。將仍然附著在卡爾加里生物被膜裝置上的被膜用200 μ L甲醇固定30分鐘。棄去固定液待自然風(fēng)干后，室溫下用200 μ L0.1%的結(jié)晶紫對(duì)生物被膜染色30min。染色完畢，棄去染色液，用PBS (pH7.2)清洗兩次以去除游離的染色液，風(fēng)干，然后每孔加入200 μ L濃度為33%的冰乙酸溶液，置于振蕩器IOmin以釋放生物被膜中的結(jié)晶紫。酶標(biāo)儀595nm處測(cè)定OD值。
[0034]豬鏈球菌生物被膜的形成能力判定標(biāo)準(zhǔn):臨界值(ODc)=陰性對(duì)照的平均值+(3X陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)差)。當(dāng)OD ≤ ODc時(shí)，判定細(xì)菌無生物被膜形成能力；當(dāng)ODc ≤ OD≤ 2XODc時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力較弱；當(dāng)2X0Dc≤ OD ≤ 4X0Dc時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力中等；當(dāng)4X0DC < OD時(shí)，判定細(xì)菌生物被膜形成能力強(qiáng)。
[0035]1.31/2MIC對(duì)S.suis生物被膜的干預(yù)作用
[0036]將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腟.suis菌液稀釋為約1.0XlO6Cfu.mL—1，向卡爾加里生物被膜裝置每孔中加菌液和丁香葉提取物共200 μ I (濃度1/2MIC)，另設(shè)空白對(duì)照孔(只加培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照孔(未加藥的生物被膜生長(zhǎng)對(duì)照)和陽性對(duì)照孔(濃度1/2MIC的阿奇霉素)；阿奇霉素對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形成具有較好的抑制作用，故本實(shí)驗(yàn)采用阿奇霉素做為陽性對(duì)照，證實(shí)實(shí)驗(yàn)方法正確可行。每個(gè)樣品五個(gè)重復(fù)。37°C，50rmp搖床上孵育72h，PBS清洗2次，固定，染色，測(cè)OD595值。
[0037]1.41/2MIC對(duì)S.suis生物被膜的消除作用[0038]將濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腟.suis菌液稀釋為約1.0XlO6Cfu.mL'取200 μ L接種于96孔板中，37°C，50rmp搖床上孵育72h，PBS清洗2次，向卡爾加里生物膜裝置每孔中加THB培養(yǎng)基和丁香葉提取物200 μ I (1/2MIC)，繼續(xù)于37°C，50rmp搖床上孵育72h，PBS清洗3次，固定，染色，測(cè)OD595值。另設(shè)空白對(duì)照孔(只加培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照孔(未加藥的生物被膜生長(zhǎng)對(duì)照)和陽性對(duì)照孔(1/2MIC的阿奇霉素)。
[0039]1.5 丁香葉提取物對(duì)S.suis生物被膜作用的形態(tài)學(xué)觀察
[0040]首先從卡爾加里生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，并使用滅菌PBS(pH7.2)輕輕洗滌三次以去除游離菌，用pH7.2戊二醛固定，并置于4°C冰箱中固定I小時(shí)。依次用0.1mol pH7.2磷酸緩沖液沖洗兩次，每次均為10分鐘，再用50%、70%、90%乙醇進(jìn)行脫水各一次，每次10~15分鐘，然后用100%乙醇脫水二次，每次10~15分鐘，最后100%乙醇與叔丁醇1: 1、純叔丁醇各一次后，每次15分鐘，用冷凍干燥儀對(duì)樣品進(jìn)行干燥4小時(shí)。樣品表面在真空條件下鍍一層厚100~150A的金屬膜，SEM下觀察。
[0041]1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0042]采用SPSS18.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)資料的比較采用單因素方差分析，P < 0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0044]2.1 丁香葉提取 物對(duì)S.suis的最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)結(jié)果
[0045]通過微量稀釋法分別測(cè)定了阿奇霉素和丁香葉提取物對(duì)S.suis的最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表1。
[0046]表1阿奇霉素和丁香葉提取物對(duì)豬鏈球菌的MIC (單位:μ g.mL—1)
【權(quán)利要求】
1.丁香葉提取物在制備抑制豬鏈球菌或由豬鏈球菌所致疾病藥物中的用途。
2.丁香葉提取物在制備干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的藥物中的用途。
3.丁香葉提取物在制備消除豬鏈球菌成熟生物被膜藥物中的用途。
4.按照權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于:所述的丁香葉提取物是丁香葉水醇混合提取物、丁香葉醇提取物或丁香葉水提取物。
5.按照權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的丁香葉水醇混合提取物的制備方法包括:丁香葉粉碎后用稀乙醇浸泡后提取，將提取液濃縮，即得。
6.按照權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于:所述的稀乙醇為20-50%乙醇，優(yōu)選為40%乙醇；所述的提取為在65°C溫度下提取60min。
7.一種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，其特征在于，包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
8.一種抑制豬鏈球菌生物被膜形成的藥物組合物，其特征在于，包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
9.一種消除豬鏈球菌生物被膜的藥物組合物，其特征在于，包括:有效量的丁香葉提取物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
10.按照權(quán)利要求7-9任何一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于:所述的丁香葉提取物是丁香葉水醇混合提取物、丁香葉水提取物或丁香葉醇提取物；所述的丁香葉水醇混合提取物的制備方法包括:丁香葉粉``碎后用稀乙醇浸泡后提取，將提取液濃縮，即得。
【文檔編號(hào)】A61K127/00GK103585277SQ201310486414
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】李艷華, 韓強(qiáng), 陳儉清, 劉冰, 趙玉林, 盛尊來, 黃全勇, 周永輝 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)