Lycojaponicumin C在治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用；Lycojaponicumin?C在制備抑制白血病細胞增殖藥物中的應(yīng)用，Lycojaponicumin?C在制備誘導(dǎo)白血病細胞凋亡藥物中的應(yīng)用。Lycojaponicumin?C通過抑制白血病細胞增殖和誘導(dǎo)白血病細胞凋亡，來對白血病進行治療。對于本發(fā)明涉及的Lycojaponicumin?C在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于白血病細胞的抑制活性強得意想不到。
【專利說明】Lycojapon i cumi n C在治療白血病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Lycojaponicumin C的用途,尤其涉及Lyco japonicumin C在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]急性白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據(jù)統(tǒng)計，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發(fā)病率在世界各國中，歐洲和北美發(fā)病率最高，其死亡率為3.2-7.4/10萬人口。尋找能夠防治急性白血病的藥物顯得非常迫切。
[0003]本發(fā)明涉及的化合物L(fēng)ycojaponicumin C是一個2012年發(fā)表(Wang, X.J.etal., 2012.Lycojaponicumins A-C, Three Alkaloids with an Unprecedented Skeletonfrom Lycopodium japonicum.0rganic Lettersl4 (10)，2614-2617.)的新骨架化合物，對于本發(fā)明涉及的在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于白血病細胞的細胞毒性和凋亡誘導(dǎo)的生物活性強得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質(zhì)性特點，同時用于白血病的防治顯然具有顯著的進步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種Lycojaponicumin C在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用，以增加Lycojaponicumin C在藥物中的應(yīng)用。
[0005]Lycojaponicumin C 在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0006]Lycojaponicumin C通過抑制白血病細胞(HL-60細胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細胞(HL-60細胞)凋亡，來對白血病進行治療。
[0007]所述化合物L(fēng)ycojaponicumin C結(jié)構(gòu)如式(I )所示:
[0008]H3°w
%

N

CH3
式(I)
[0009]本發(fā)明涉及的Lycojaponicumin C在制備治療白血病藥物中的用途屬于首次公開，而且由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于白血病細胞的細胞毒性和凋亡誘導(dǎo)的生物活性強得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質(zhì)性特點，同時用于白血病的防治顯然具有顯著的進步。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C的制備方法參見文獻(Wang, X.J.etal.，2012.Lycojaponicumins A-Cj Three Alkaloids with an Unprecedented Skeletonfrom Lycopodium japonicum.0rganicLettersl4(10)，2614-2617.)。
[0011]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
[0012]實施例1:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C片劑的制備:
[0013]取20克化合物L(fēng)ycojaponicumin C，加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機制成1000片。
[0014]實施例2:本發(fā)明所涉及化合物L(fēng)ycojaponicumin C膠囊劑的制備:
[0015]取20克化合物L(fēng)ycojaponicumin C,加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克,混勻，裝膠囊制成1000片。
[0016]下面通過藥效學(xué)實驗來進一步說明其藥物活性。
[0017]試驗例:Lyco japonicumin C抑制HL-60細胞增殖和誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡
[0018]I材料和方法
[0019]1.1材料RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、羅丹明123為Sigma公司產(chǎn)品；Caspase_3, 9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0020]1.2細胞培養(yǎng)人早幼粒細胞性白血病細胞株HL-60購于中科院上海細胞生物研究所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，青霉素100kU/L，鏈霉素100mg/L，37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。
[0021]L 3人外周血單個核細胞(PBMC)的分離
[0022]無菌采集健康供者靜脈血，肝素抗凝(每毫升全血加0.1ml的200U/ml肝素鈉溶液)，PBS等倍稀釋血液，1:4加入人淋巴細胞分離液，2000rpm離心20min，收集乳白層后用無血清RPM1-1640培養(yǎng)基1500rpml0min離心洗滌2次，獲得單個核細胞，臺盼藍拒染率大于95%，重懸于10%FCS的RPM1-1640培養(yǎng)基中備用。
[0023]1.4 Lycojaponicumin C 對 HL-60 細胞和人 PBMC 生長的影響
[0024]接種HL-60細胞和人PBMC與96孔板，每孔2 X IO4個細胞(IOOul )。37°C、5%C02條件下培養(yǎng) 24h 后，實驗組一次加 0.625、1.25,2.5,5.0,10.0ug/mL 的 Lyco japonicumin C，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72h后，終止培養(yǎng)，設(shè)只加培養(yǎng)液的對照組，每個劑量組設(shè)4個復(fù)孔。實驗結(jié)束前4h，每孔加入20ul MTT溶液(5g/L)，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150uL DMS0，震蕩lOmin，選擇570nm波長，在自動酶聯(lián)檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，重復(fù)實驗3次，并計算其生長抑制率(Cl)。Cl=(陰性對照組A值-實驗組A值)/陰性對照組A值X 100%。
[0025]1.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率
[0026]收集0、2.5、5.0、10.0ug/mL Lycojaponicumin C 處理 48h 的各組細胞，PBS 洗漆2次，加入預(yù)冷的70%乙醇于-20°C固定24h，離心洗滌后加入200uL PI染液，50ul RNA酶，4°C避光放置20min，1500rpm離心5min。調(diào)整細胞濃度為I X IO5個/ml~I X IO6個/ml，上流式細胞儀分析，激發(fā)光源為氬離子激光，激發(fā)波長為488nm。
[0027]1.6統(tǒng)計學(xué)分析本實驗結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計分析
[0028]軟件SPSS13.0處理，所有實驗結(jié)果采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。
[0029]2 結(jié)果
[0030]2.1Lycojaponicumin C 對 HL-60 細胞及 PBMC 生長的影響
[0031]對照組HL-60 細胞生長活躍，經(jīng) 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0ug/mL 的Lycojaponicumin C處理72h后，HL-60細胞生長均不同程度的減慢，并呈濃度依賴性。在相同濃度下，培養(yǎng)72h Lycojaponicumin C對人PBMC幾乎無抑制作用，與HL-60細胞比較有顯著性差異(P〈0.05)(見表1)。
[0032]表1 Lycojaponicumin C 對 HL-60 細胞增殖的影響(x±s, n=4)
[0033]
Lycojaponicu增值抑制率/%
min C72h 72h (PBMC)

(ug/mL)
0.625丨 4.1 土2.1 0.0 土 0.0AA
1.2529.2 土 3.7** 0.5±0.2AA
2.5048.3 ±5.6*0 1.9 ±0.4“
5.0062.4 ±6.1，3.8±0.7aa
10.073.1±2.7**λ 8.1 ±0.5“
[0034]與24h 比較 *ρ〈0.05**ρ〈0.01 ;與 48h 比較 Λ ρ〈0.05 Δ Δ ρ〈0.01 ;與 72h 比較▲p〈0.05AAp<0.0l
[0035]2.2流式細胞術(shù)檢測HL-60細胞凋亡
[0036]HL-60細胞與不同濃度的Lycojaponicumin C作用48h后，經(jīng)流式細胞儀分析，結(jié)果顯示G1期峰前均出現(xiàn)了代表細胞凋亡的亞二倍體峰，在一定濃度范圍內(nèi)隨著LycojaponicuminC 濃度增升高,HL-60 細胞凋亡率升高，其中 10.0ug/mL LycojaponicuminC作用48h凋亡率達到(27.56±4.87)% (表2)。
[0037]表2 Lycojaponicumin C 作用 48h 后對 HL-60 細胞凋亡率的影響(x± s, n=3)
[0038]
組別劑量凋亡率
I ug/mL)%
陰性對照O0.52 ±0.11
LycojaponicuminC2.58.53 ± 1.98*
5.015.24 土 1.1 3**
10.023.55±2.87**
[0039]與陰性對照組比較*ρ〈(λ 05, **p<0.01
[0040]結(jié)論:Lycojaponicumin C能夠抑制白血病細胞(HL-60細胞)增殖和誘導(dǎo)白血病細胞(HL-60細胞)凋亡，因此，可以用來對白血病進行治療。
【權(quán)利要求】
1.Lycojaponicumin C在治療白血病藥物中的應(yīng)用，所述化合物L(fēng)ycojaponicumin C結(jié)構(gòu)如式(I )所示:
【文檔編號】A61K31/438GK103463064SQ201310435482
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】吳俊華, 黃蓉 申請人:南京廣康協(xié)生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司