功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，包括：（1）制備MWCNT/PEI；（2）制備MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液，然后制備MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)；（3）最后制備MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K或MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K。本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化多壁碳納米管復(fù)合材料的制備；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了小鼠的體內(nèi)MR血管和主要器官成像，同時(shí)可以利用腫瘤組織的EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的MR成像檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說(shuō)明】功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)成像造影劑領(lǐng)域，特別涉及一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磁共振成像(MR)是斷層成像的一種(M.M.Britton, Chem.Soc.Rev.2010, 39，4036.)，它利用磁共振現(xiàn)象從人體中獲得電磁信號(hào)，并重建出人體信息。它可以得到任何方向的斷層圖像，三維體圖像，甚至可以得到空間一波譜分布的四維圖像。 但是要實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度，以及圖像的高清晰度來(lái)完成疾病的早期檢測(cè)，還需磁共振成像造影劑(magnetic resonance imaging contrast agents, MRICA)的輔助才能完成 (E.L.Que, C.J.Chang, Chem.Soc.Rev.2010，39，51.XMRICA是一些順磁性和超順磁性物質(zhì)， 可縮短局部質(zhì)子弛豫時(shí)間，間接改變這些質(zhì)子所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度，提高正常與患病部位的成像對(duì)比度，從而顯示體內(nèi)器官的功能狀態(tài)。按照造影中以縮短T1弛豫時(shí)間為主或以縮短 T2弛豫時(shí)間為主，可將MRICA分為T1弛豫增強(qiáng)或T2弛豫增強(qiáng)，T1和T2弛豫時(shí)間的倒數(shù)R1和 R2為兩者的弛豫率。
[0003]由于Gd (f7)具有7個(gè)不成對(duì)電子，磁矩較大，又具有相對(duì)較長(zhǎng)的電子-自旋弛豫時(shí)間，是設(shè)計(jì)MRICA的最理想選擇。目前應(yīng)用于臨床的低分子量MRICA能快速擴(kuò)散到細(xì)胞外基質(zhì)，因此其血液循環(huán)時(shí)間和在組織中的駐留時(shí)間較短，信噪比較小，且沒(méi)有靶向性，影響了其成像質(zhì)量和在臨床上的應(yīng)用(P.Caravan, Chem.Soc.Rev.2006，35，512.)。因此尋找在血液循環(huán)中停留的時(shí)間長(zhǎng)以及具有靶向性的MRICA成為解決此問(wèn)題的關(guān)鍵。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，各種納米顆粒應(yīng)運(yùn)而生，并在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。納米材料在體內(nèi)的降解及排泄比小分子慢，因而在血管內(nèi)的停留時(shí)間延長(zhǎng)，是負(fù)載釓離子用于MR成像的優(yōu)良材料(H.Kobayashi1M.ff.Brechbiel1Adv.Drug Deliv.Rev.2005，57，2271.)。
[0004]碳納米管(CNTs)由石墨原子單層繞同軸纏繞而成或由單層石墨圓筒沿同軸層層套構(gòu)而成的一種新型納米碳材料，按照石墨烯片的層數(shù)可分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。由于管狀結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的力學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、電磁特性和熱學(xué)特性，CNTs在高強(qiáng)度復(fù)合材料、探測(cè)器、傳感器等諸多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用前景。同時(shí)研究表明，CNTs可通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞而不產(chǎn)生毒性(Yang ff., Thordarson P., Gooding J.J., Ringer S.P., Braet F.Nanotechnology, 2007.18:412001.)? Shen 等 (M.Shen, S.H.Wang, X.Shi, X.Chen, Q.Huang, E.J.Petersen, R.A.Pinto, J.R.Baker, Jr., ff.J.Weber, Jr.，J.Phys.Chem.C2009, 113，3150.)利用聚乙烯亞胺(PEI)修飾 MWCNTs,并進(jìn)行不同表面電勢(shì)改性，提高了 MWCNTs的分散性和生物相容性。因此將MRICA與CNTs結(jié)合， 可`以增強(qiáng)其體內(nèi)穩(wěn)定性、改變疏水性質(zhì)、降低分子的旋轉(zhuǎn)速率、提高弛豫率、延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間和在組織中的駐留時(shí)間，另外CNTs可進(jìn)行專屬性化學(xué)修飾，增強(qiáng)對(duì)組織或器官的靶向性，可對(duì)全身多部位進(jìn)行診斷。[0005]然而，檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)磁共振成像方面的文獻(xiàn)和專利表明:以功能化聚乙烯亞胺修飾的MWCNTs為載體材料，通過(guò)共價(jià)接枝將小分子釓離子螯合劑負(fù)載在其表面，達(dá)到較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間方面的研究還沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化多壁碳納米管，具有很好的實(shí)用價(jià)值。
[0007]本發(fā)明的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，包括:
[0008](I)將100-150mg的羧基化多壁碳納米管MWCNTs分散在40_60mL的DMSO中，然后加入120-180mg的EDC和62_94mg的N-羥基丁二酰亞胺NHS，在室溫下攪拌反應(yīng)2_4h，再逐滴加入含有100-150mg PEI的DMSO溶液，超聲反應(yīng)1_3天，透析反應(yīng)液，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT/PEI ；
[0009](2)將 140-210mg 的MWCNT/PEI 分散在 50-75mL 的 DMSO溶液中，并逐滴加入 8-12mL 含有4.85-7.27mg FI的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)12_24h得到MWCNT/PE1-FI的DMSO 溶液；將27-40mg的DOTA-NHS溶解在10_15mL的DMSO中，然后加入29.1-43.7mg的六水合硝酸釓(Gd (NO3) 3.6H20)，在室溫下攪拌反應(yīng)2-4h后得到DOTA (Gd)的DMSO溶液，逐滴加入到上述MWCNT/PE1-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)1_2天，將反應(yīng)液透析，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)。
[0010](3 )將步驟(2 )得到的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)溶于 DMSO 中，然后加入 EDC/ NHS活化后的分子量為2000或5000的mPEG-COOH (羧基端聚乙二醇)的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)2-4d，然后進(jìn)行透析，冷凍干燥，得到功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管MWCNT/ PE1-F1-D0TA(Gd)-mPEG2K 或 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG5K。
[0011]所述步驟(1)中MWCNTs和PEI的質(zhì)量比為1:0.8-1.5。
[0012]所述步驟(1)中透析的具體工藝為采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析。
[0013]所述步驟(2)中`MWCNT/PEI 和 DOTA(Gd)的質(zhì)量比為 1:0.15-0.3。
[0014]所述步驟(2)中透析的具體工藝為采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析。
[0015]所述步驟(3)中的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)和分子量為 2000 的 mPEG-COOH 的質(zhì)量比為1:0.8-1.4 ;所述的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)和分子量為5000的mPEG-COOH的質(zhì)量比為 1:2-3.5。
[0016]所述步驟(3)中透析具體工藝為采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析， 再在蒸餾水中透析。
[0017]本發(fā)明的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K 或 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 不僅可以顯著提高血池成像質(zhì)量，還可以實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的被動(dòng)靶向成像。因此本發(fā)明的制備方法將拓展MR成像造影劑在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用范圍。
[0018]本發(fā)明中將FI和DOTA(Gd)接枝到MWCNT/PEI表面，F(xiàn)I和DOTA (Gd)采用在快速攪拌下逐滴滴加的方式加入到MWCNT/PEI溶液中，以保證MWCNT/PEI接枝FI和DOTA(Gd)的均一性。
[0019]本發(fā)明中使用5-10倍量EDC和NHS活化羧基和氨基的反應(yīng)，增強(qiáng)反應(yīng)活性。以聚乙二醇化屏蔽表面剩余的氨基以降低其表面電勢(shì)，提高材料的生物相容性并延長(zhǎng)其血液循環(huán)時(shí)間以達(dá)到較好的血池MR成像的效果。
[0020]對(duì)基于功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備、生物相容性評(píng)價(jià)及體外、體內(nèi)MR成像效果研究，進(jìn)行了 UV-Vis (紫外可見(jiàn)光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、TGA (熱失重分析)和MTT (細(xì)胞活力分析)，體內(nèi)血池成像以及體內(nèi)腫瘤被動(dòng)靶向MR 成像研究:
[0021](I)1H NMR 測(cè)試結(jié)果
[0022]以1H NMR測(cè)試表征PEI對(duì)MWCNTs的修飾，PEI的特征峰在2.2-3.2ppm出現(xiàn)，結(jié)果表明已經(jīng)成功將PEI接枝在MWCNTs表面合成得到MWCNT/PEI。參見(jiàn)【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】2。
[0023](2) UV-Vis 測(cè)試結(jié)果
[0024]MWCNTs 在 260nm 處有較強(qiáng)的吸收峰，同時(shí) MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)、MWCNT/ PE1-F1-D0TA (Gd) -mPEG2K 和 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K 還在 501nm 處有較強(qiáng)的吸收峰，表明FI的成功接枝。UV-Vis圖譜參見(jiàn)附圖3。
[0025](3) TGA測(cè)試結(jié)果
[0026]用TGA對(duì)功能化PEI分子在MWCNTs上的接枝量進(jìn)行了分析，參見(jiàn)附圖
4。以547°C作為計(jì)算熱重?fù)p失的溫度，在此溫度下，MWCNTs僅有4.5%的重量損失， 而 MWCNT/PEI, MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd), MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)-mPEG2K 和 MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K 的熱重?fù)p失分別為 31.4%, 39.6%, 61.5% 和 80.4%。
[0027](4) TEM 表征
[0028]為了驗(yàn)證樹(shù)狀大分子的修飾化作用對(duì)MWCNTs形貌的影響，對(duì)MWCNTs，MWCNT/PEI， MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K 和 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd)` _mPEG5K 的形貌做了 TEM 表征， 參見(jiàn)附圖5。從圖中可以看出，MWCNTs經(jīng)過(guò)超聲作用下多功能化修飾后，長(zhǎng)度明顯變短，不過(guò)仍然是中空的管狀結(jié)構(gòu)。
[0029](5) MRI測(cè)試結(jié)果
[0030]MRI測(cè)試結(jié)果表明所制備的材料具有較大的F1弛豫率。與MWCNT/ PE1-F1-DOTA(Gd)相比，兩種不同分子量聚乙二醇修飾后馳豫率從3.2mM^s^分別提高到
3.6和3.QmT1S'參見(jiàn)說(shuō)明書附圖6。
[0031](6) MTT細(xì)胞相容性分析
[0032]用KB 細(xì)胞來(lái)研究 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)，MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K 和 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 的細(xì)胞相容性。將不同 Gd 濃度(0，2.5，5，10，20，40， 80 PM)的三種不同復(fù)合物與KB細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，參見(jiàn)附圖7。 從圖中可以看出，相對(duì)于未處理的KB細(xì)胞，MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)復(fù)合物對(duì)KB細(xì)胞具有很大的毒性(P〈0.05)。這是因?yàn)镻EI表面大量的氨基使得其具有很高的正電性，從而展示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但是兩種分子量的聚乙二醇化修飾都沒(méi)有毒性，表明聚乙二醇化可以顯著提高材料的細(xì)胞相容性。
[0033](7 ) MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K 小鼠體內(nèi) MR 成像[0034]將150 u L MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG2K ([Gd] =0.02M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，通過(guò)MR掃描檢測(cè)得到的圖片(附圖8)，從圖中能夠清楚地看到小鼠的下腔靜脈、肝臟和腎臟，且下腔靜脈成像時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4h，證明本方法合成的MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K具有較好的MR成像效果。
[0035](8 ) MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 小鼠體內(nèi) MR 成像
[0036]將150 ii L MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K ([Gd] =0.02M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，通過(guò)MR掃描檢測(cè)得到的圖片(附圖9)，從圖中能夠清楚地看到小鼠的下腔靜脈、肝臟和腎臟，且下腔靜脈成像時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12h，證明本方法合成的MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K具有較好的MR成像效果和較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。
[0037](9) MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 裸鼠體內(nèi)腫瘤 MR 成像
[0038]將150 u L MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K ([Gd] =0.02M)尾部靜脈注射進(jìn)體重為21g的荷瘤裸鼠體內(nèi)，通過(guò)MR掃描檢測(cè)得到腫瘤部位的圖片(附圖10)，從圖中能夠清楚地看到裸鼠腫瘤部位的信號(hào)增強(qiáng)效果，且腫瘤亮度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。證明本方法合成的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K可以通過(guò)EPR效應(yīng)富集在腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的被動(dòng)靶向成像檢測(cè)。
[0039]本發(fā)明充分利用PEI分子表面眾多的功能基團(tuán)，通過(guò)共價(jià)鍵修飾到MWCNTs表面， 增強(qiáng)了 MWCNTs分散性，然后利用氨基的反應(yīng)活性，連接熒光成像分子和MR成像分子，最后再通過(guò)聚乙二醇化修飾，不僅提高碳納米管的水溶液分散性和生物相容性，還賦予碳納米管MR成像性能。通過(guò)MR成像分子，可以實(shí)現(xiàn)小鼠的體內(nèi)MR血管和主要器官成像。由于材料具有較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，可以利用腫瘤組織的EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的MR成像檢測(cè)。
[0040]有益效果
[0041](I)本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化MWCNTs的制備，具有很好的實(shí)用價(jià)值；
[0042](2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了小鼠的體內(nèi)MR血管和主要器官成像；同時(shí)可以利用腫瘤組織的 EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的MR成像檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊；
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】`
[0043]圖1為本發(fā)明制備的基于功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的的合成路線；
[0044]圖2為本發(fā)明制備的MWCNT/PEI的1H NMR圖譜；
[0045]圖3 為 MWCNTs (a)，本發(fā)明制備的 MWCNT/PEI (b)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) (c)、 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)-mPEG2K(d)和 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG5K(e)的 UV-Vis 圖
[0046]圖4 為 MWCNTs (a)，本發(fā)明制備的 MWCNT/PEI (b)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) (c)、 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K (d)和 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K (e)的 TGA 分析圖片;
[0047]圖5 為 MWCNTs(a)，本發(fā)明制備的 MWCNT/PE 1(b)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K (c)和 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K (d)的 TEM 圖片；
[0048]圖6 為本發(fā)明制備的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) (I)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K (2)和 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K (3)在不同 GcT 濃度的 T1成像圖片(a)和T1弛豫時(shí)間的倒數(shù)隨釓濃度變化的線性關(guān)系圖(b)；
[0049]圖1 為本發(fā)明制備的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K 和MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K在不同GcT濃度處理的KB細(xì)胞活力的MTT分析；
[0050]圖8 為尾靜脈注射 0.15mL MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K ([Gd] =0.02M)不同時(shí)間后，小鼠體內(nèi)MR成像效果圖，從左至右依次為注射前，注射后0.5，l，2，4，12h ；
[0051]圖9 為尾靜脈注射 0.15mL MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K ([Gd] =0.02M)不同時(shí)間后，小鼠體內(nèi)MR成像效果圖，從左至右依次為注射前，注射后0.5，l，2，4，12h ；
[0052]圖10 為尾靜脈注射 0.15mL MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K ([Gd] =0.02M)不同時(shí)間后，荷瘤裸鼠腫瘤部位MR成像效果圖，從左至右依次為注射前，注射后0.5，l，2，4h;星號(hào)指示腫瘤的位置。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0054]實(shí)施例1
[0055]將MWCNTs (IOOmg)分散在40mL的DMSO溶液中，在攪拌的情況下，加入IOmL含 EDC (120mg)的DMSO溶液，再加入5mL含NHS (62mg)的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)2h 后。然后將IOOmg PEI (IOmL DMS0)逐滴滴加入到上述EDC/NHS活化了的MWCNTs的DMSO 溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)2天。最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWC0=50，000)中，通過(guò)透析法將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析3次，每次2L，再用蒸餾水透析5次，每次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT/PEI ；
[0056]將140mg制備的MWCNT/PEI分散在50mL的DMSO溶液中，在攪拌狀態(tài)下，逐滴加 A 8mL含4.85mg的FI的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)12h得到未純化的MWCNT/PE1-`FI 的DMSO溶液；然后稱取27mg的D0TA-NHS，溶解在IOmL DMSO溶液中，并加入29.1mg的六水合硝酸釓(Gd(NO3)3.6H20)，在室溫下攪拌反應(yīng)2h得到DOTA(Gd)的DMSO溶液，最后逐滴加入到上述MWCNT/PE1-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)I天得到未純化的MWCNT/ PE1-F1-D0TA (Gd)的DMSO溶液，取8mL反應(yīng)液，通過(guò)透析法將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)；
[0057]取30mL 未純化的上述 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)的 DMSO 反應(yīng)液，再加入 15mLDMS0 稀釋。將65mg羧基端聚乙二醇(分子量為2000)溶解在IOmL DMSO中，然后分別加入5mL 含有65mg EDC的DMSO溶液和3mL含有38mg NHS的DMSO溶液，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2h 后，然后在攪拌狀態(tài)下逐滴滴加到稀釋后的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng) 2d，然后進(jìn)行透析，冷凍干燥處理，得到MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K ;再取30mL未純化的上述MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)的DMSO反應(yīng)液，并加入15mL DMSO稀釋。另外將162mg羧基端聚乙二醇(分子量為5000)溶解在15mL DMSO中，然后分別加入5mL含有65mg EDC的 DMSO溶液和3mL含有38mg NHS的DMSO溶液，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2h后，然后在攪拌狀態(tài)下逐滴滴加到稀釋后的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)2d，然后進(jìn)行透析， 冷凍干燥處理，得到 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG5K ；
[0058]整個(gè)反應(yīng)過(guò)程如附圖1所示。產(chǎn)物MWCNT/PEI的1H NMR圖譜如附圖2，PEI的特征峰在2.2-3.2ppm出現(xiàn)，結(jié)果表明已經(jīng)成功將PEI接枝在MWCNTs表面合成MWCNT/PEI。同時(shí)UV-Vis圖譜(見(jiàn)附圖3)也可以看到MWCNTs的特征吸收峰在260nm，F(xiàn)I的特征吸收峰在 501nm，說(shuō)明FI成功接枝在了 MWCNT/PEI表面。
[0059]用TGA對(duì)多功能化MWCNTs表面的接枝量進(jìn)行了分析，參見(jiàn)附圖4。以547°C作為計(jì)算熱重?fù)p失的溫度，在此溫度下，MWCNTs僅有4.5%的重量損失，而MWCNT/PEI，MWCNT/ PE1-F1-DOTA(Gd)，MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG2K 和 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG5K 的熱重?fù)p失分別為31.4%, 39.6%, 61.5%和80.4%。
[0060]對(duì)MWCNT/PEI， MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)， MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG2K 和 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG5K做了 TEM表征，參見(jiàn)附圖5。從圖中可以看出，MWCNTs經(jīng)過(guò)在超聲作用下多功能化修飾后，長(zhǎng)度明顯變短，不過(guò)仍然是中空的管狀結(jié)構(gòu)。
[0061]進(jìn)一步以電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定產(chǎn)物中Gd的含量，結(jié)果見(jiàn)表 I，MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)，MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)-mPEG2K 和 MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG5K中釓含量分別為7.936%，4.415%和2.89%，這些測(cè)試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的MWCNTs。
[0062]所制備材料的表面電勢(shì)見(jiàn)表2，表面修飾PEI之后MWCNTs的表面電勢(shì)由-42.3±7.14變?yōu)?0.5±5.13，這種電荷翻轉(zhuǎn)是由于PEI表面大量氨基造成的，也說(shuō)明 PEI成功接枝在MWCNTs上。進(jìn)一步修飾FI和DOTA(Gd)之后其電勢(shì)變化較小，但是修飾了聚乙二醇之后電勢(shì)顯著降低，分子量為2000和5000的修飾之后電勢(shì)分別變?yōu)?5.27 ±2.59 和 11.96±3.23。
[0063]實(shí)施例2
[0064]以體外MR測(cè)試的T1值來(lái)檢驗(yàn)實(shí)施例1合成的材料MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)， MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K 和 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 的 MR 成像效果。取實(shí)例I樣品MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) 8.46mg溶解在4.8mL的超純水中配制釓濃度為0.892mM 的溶液，再分別稀釋到釓濃度為0.713,0.535,0.357,0.178,0.089mM的溶液各1.5mL ;取實(shí)例I樣品MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG2Kl 1.52mg溶解在4.8mL的超純水中配制釓濃度為0.675mM的溶液，再分別稀釋到釓濃度為0.540,0.405,0.270,0.135,0.068mM的溶液各`
1.5mL ;取實(shí)例 I 樣品 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K22.83mg 溶解在 4.8mL 的超純水中配制釓濃度為0.876mM的溶液，再分別稀釋到釓濃度為0.701,0.525，0.350,0.175，0.088mM 的溶液各1.5mL。用0.5T MR測(cè)試儀測(cè)試各個(gè)樣品的T1值并得出1/1\的值與釓濃度的線性關(guān)系。附圖6 (a)為樣品的T1成像圖片(其中I為MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)，2為MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K, 3 為 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K)。附圖 6 (b)為樣品 1， 2和3的T1弛豫時(shí)間的倒數(shù)隨釓濃度變化的線性關(guān)系圖。從圖6 Ca)中可以看出樣品1，2 和3都顯示出隨著釓離子濃度的增高，Tl信號(hào)逐漸變強(qiáng)。在圖6 (b)中三個(gè)材料的濃度和 IA1值線性關(guān)系良好，且樣品2和3的縱向馳豫率G1)分別為3.6和3.QmT1s'大于樣品 I的1^ (3.2mMH，說(shuō)明聚乙二醇化修飾提高了材料的MR造影效果。
[0065]實(shí)施例3[0066]用MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)研究所制備的材料的細(xì)胞毒性。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 ii L含細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基使細(xì)胞密度至10000/孔，邊緣孔加入200 ii L無(wú)菌PBS緩沖液；然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%C02，37°C)中孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，倒掉培養(yǎng)基并加入180 ii L新鮮培養(yǎng)基，再加入含有不同濃度的MWCNT/ PE1-F1-DOTA(Gd),MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG2K 和 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG5K 的 20 u L PBS緩沖液(各個(gè)材料以釓離子為基準(zhǔn)設(shè)為7個(gè)濃度，即0，2.5，5，10，20，40，80 ii M)， 以驗(yàn)證材料本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所有的試驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)孔為一個(gè)平行組；在培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加入20 ii L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使細(xì)胞與MTT充分反應(yīng)。最后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔加入200 ii L DMS0，置搖床上避光低速振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm處測(cè)量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析借助于ANOVA方法實(shí)施。在所有的評(píng)估中，認(rèn)為P〈0.05時(shí)，樣品之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。 分析結(jié)果以細(xì)胞存活率來(lái)顯示 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)、MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K 和 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K 對(duì) KB 細(xì)胞的毒性作用。
[0067]MTT法檢測(cè)處理后細(xì)胞的活力，參見(jiàn)附圖7。從圖中可以看出，相對(duì)于未處理的 KB 細(xì)胞，MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG2K 和 MWCNT/PE 1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K 在釓離子濃度高達(dá)80 M時(shí)對(duì)KB細(xì)胞都不產(chǎn)生毒性，表現(xiàn)出良好的生物相容性；而聚乙二醇化修飾之前的材料MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)在釓離子濃度達(dá)到5 y M時(shí)就對(duì)KB細(xì)胞產(chǎn)生毒性 (p〈0.01)。
[0068]實(shí)施例4
[0069]將150 u L 實(shí)施例1 中得到的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG2K ([Gd] =0.02M)通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，注射前和注射后0.5，I，2，4，12h對(duì)其通過(guò)MR掃描檢測(cè)得到小鼠下腔靜脈的圖片(附圖8)，從圖中可以看出，與注射前的MR圖片相比，注射后能夠清楚地看到小鼠的下腔靜脈、肝臟和腎臟，且下腔靜脈成像時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4h，證明本方法合成的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K具有較好的MR成像效果和較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。
[0070]實(shí)施例5
[0071]將150 u L 實(shí)施例1 中得到的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG5K( [Gd] =0.02M)通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)體重為22g的小鼠體內(nèi)，注射前和注射后0.5，I，2，4，12h對(duì)其通過(guò)MR掃描檢測(cè)得到小鼠下腔靜脈的圖片(附圖9)，從圖中可以看出，與注射前的MR圖片相比，注射后小鼠下腔靜脈、肝臟和腎臟的MR信號(hào)有明顯的增強(qiáng)，且血管亮度可以維持到12h，證明本方法合成的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K具有較好的MR成像效果和更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。 且其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間要長(zhǎng)于MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG2K，證明聚乙二醇分子量為5000 時(shí)對(duì)MWCNTs的修飾要比分子量2000的修飾`可使MWCNTs具有更好的血池造影效果和更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。
[0072]實(shí)施例6
[0073]將150 ii L 實(shí)施例1 中得到的 MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) _mPEG5K ([Gd] =0.02M) 通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)體重為21g的荷瘤裸鼠體內(nèi)，注射前和注射后0.5，l，2，4h對(duì)其通過(guò) MR掃描檢測(cè)得到裸鼠腫瘤部位的圖像(附圖10)，從圖中可以看出，與注射前的MR圖片相比，注射后裸鼠的腫瘤部位的MR信號(hào)有明顯的增強(qiáng)，且其亮度在4小時(shí)達(dá)到最高的成像對(duì)比效果。證明本方法合成的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)-mPEG5K可以通過(guò)EPR效應(yīng)聚集到腫瘤部位，有效的實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的被動(dòng)靶向MR成像檢測(cè)。證明本方法合成的MWCNT/ PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG5K有望用于臨床MR成像檢測(cè)血管或進(jìn)行腫瘤的早期檢測(cè)。
[0074]表1
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，包括:(1)將100-150mg的羧基化多壁碳納米管MWCNTs分散在40_60mL的DMSO中，然后加入 120-180mg的EDC和62_94mg的NHS，在室溫下攪拌反應(yīng)2_4h，再逐滴加入含有100_150mg PEI的DMSO溶液，超聲反應(yīng)1-3天，透析反應(yīng)液，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT/ PEI ；(2)將140-210mg的MWCNT/PEI分散在50_75mL的DMSO溶液中，并逐滴加入8_12mL 含有4.85-7.27mg FI的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)12_24h得到MWCNT/PE1-FI的DMSO 溶液；將27-40mg的DOTA-NHS溶解在10_15mL的DMSO中，然后加入29.1-43.7mg的六水合硝酸釓，在室溫下攪拌反應(yīng)2-4h后得到DOTA (Gd)的DMSO溶液，逐滴加入到上述MWCNT/ PE1-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)1-2天，將反應(yīng)液透析，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)；(3)將步驟(2)得到的MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)溶于DMSO中，然后加入EDC/NHS活化后的分子量為2000或5000的mPEG-COOH的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)2_4d，然后進(jìn)行透析，冷凍干燥，得到功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd) -mPEG2K或 MWCNT/PE1-F1-DOTA(Gd)_mPEG5K。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中MWCNTs和PEI的質(zhì)量比為1:0.8-1.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)、(2)和(3)中透析的具體工藝均為采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中MWCNT/PEI和DOTA(Gd)的質(zhì)量比為 1:0.15_0.3 o
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)和分子量為2000 的 mPEG-COOH 的質(zhì)量比為 1:0.8-1.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能化聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管磁共振成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的MWCNT/PE1-F1-DOTA (Gd)和分子量為5000 的mPEG-COOH的質(zhì)量比為1:2-3.5。
【文檔編號(hào)】A61K49/12GK103495185SQ201310393560
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】史向陽(yáng), 溫詩(shī)輝, 趙慶華, 安簫 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院