專利名稱：基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的ct造影劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬納米顆粒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，特別是涉及一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法。
背景技術(shù)：
CT (計算機斷層掃描)技術(shù)因其優(yōu)良的空間和密度分辨率而成為最為廣泛的分子影像學(xué)手段之一，在臨床上受到廣泛的使用。雖然對骨組織具有良好的成像效果，但對于各個臟器等軟組織，CT技術(shù)的應(yīng)用卻頗受限制。在具體使用過程中，常需造影劑的輔助。目前臨床上使用的造影劑多為基于碘的小分子造影劑。這種造影劑存在體內(nèi)循環(huán)時間短、具有潛在的腎臟毒性等缺點。因此，開發(fā)新型造影劑具有一定的必要性。至今，新型造影劑的 開發(fā)更多關(guān)注的是金屬納米顆粒。這是因為金屬納米顆粒具有高于碘的原子序數(shù)，能顯示更好的X-射線吸收系數(shù)。此外，納米顆粒的尺寸使其能擁有延長的體內(nèi)循環(huán)時間，更利于長時間體內(nèi)造影。Ai 等[Ai, K.，et al. , Large-Scale Synthesis of Bi2S3 Nanodots as aContrastAgent for In Vivo X-ray Computed Tomography Imaging. Advanced Materials，2011. 23(42) :p. 4886-4891.]以硫化鉍納米顆粒為造影劑，成功用于對大鼠的肝臟等器官的CT造影。金納米顆粒因其獨特的表面等離子體吸收以及光散射特性正受到越來越廣泛的關(guān)注。近年來，金納米顆粒因其良好的生物相容性及優(yōu)良的X-射線衰減特性而逐漸成為一種具有前景的CT造影劑。與傳統(tǒng)的基于碘的小分子造影劑相比，金納米顆粒具有顯著的優(yōu)勢。首先，金具有較高的原子序數(shù)和電荷密度，表現(xiàn)出較高的X-射線衰減系數(shù)，更利于提供高質(zhì)量的CT造影效果。其次，金納米顆粒具有良好的生物相容性。再次，金納米顆粒的表面易于修飾，可賦予其祀向特性及延長的體內(nèi)循環(huán)時間。Wang等[Wang, H. , et al. , Computedtomography imaging of cancer cells using acetylateddendrimer-entrapped gold nanoparticles. Biomaterials, 2011. 32:p. 2979-2988.]以第五代聚酰胺-胺樹狀大分子為模板，制備了具有良好生物相容性和穩(wěn)定性的金納米顆粒。該產(chǎn)品對小鼠腫瘤表現(xiàn)出一定的造影效果，具有潛在的CT造影應(yīng)用前景。樹狀大分子是一類合成的、結(jié)構(gòu)可精確控制的有機大分子。其表面基團具有可修飾性，內(nèi)部空腔可用以穩(wěn)定金屬納米顆粒。與高代數(shù)的樹狀大分子不同，低代數(shù)的樹狀大分子因其代數(shù)低而具有開放式的結(jié)構(gòu)，以及較少的表面基團，故用其作為金屬納米顆粒穩(wěn)定劑的研究報道較少。但低代數(shù)樹狀大分子也具有其獨特的性質(zhì)，如價格低廉，結(jié)構(gòu)更加精確可控。鑒于此，本專利采用末端氨基的第二代聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子為金納米顆粒的穩(wěn)定劑，研究其對金納米顆粒的穩(wěn)定作用以及探索所得納米顆粒的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。金屬納米顆粒的制備方法多種多樣，其中最常采用的是化學(xué)還原法。而本專利中使用的是綠色環(huán)保熱還原法。整個制備過程中沒有任何其它還原劑的添加。整個制備過程簡單易行，具有很強的可操作性。
檢索國內(nèi)外有關(guān)金納米顆粒用以CT造影方面的文獻和專利結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明完成之前，還沒有發(fā)現(xiàn)基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備及其CT造影性能研究方面的報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種樹狀大分子/金納米顆粒的綠色環(huán)保的制備方法，該方法制備的樹狀大分子/金納米顆粒具有良好的水溶液分散性和生物相容性。X-射線衰減強度測試結(jié)果表明，該產(chǎn)品表現(xiàn)出與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相近的X-射線衰減系數(shù)；體內(nèi)造影實驗表明，該產(chǎn)品表現(xiàn)出明顯優(yōu)于碘海醇的全身主要器官造影效果，具有潛在的CT造影應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括
(I)以低代數(shù)的末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子作為金納米顆粒的穩(wěn)定劑，配制摩爾濃度為2. 5-3. 5mM的水溶液，預(yù)熱；
(2)在上述溶液中加入氯金酸溶液，其中樹狀大分子與氯金酸溶液中金的摩爾比為1:3,磁力攪拌；
(3)將反應(yīng)后的溶液室溫冷卻之后，加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5_10倍的乙酸酐，進行乙?；磻?yīng)，攪拌反應(yīng)24h ;隨后透析，得到樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。
所述步驟(2)中，加入氯金酸之前，樹狀大分子溶液要先預(yù)熱20_40min，預(yù)熱的溫度為60°C。
所述步驟(2)中的磁力攪拌反應(yīng)過程持續(xù)3_4h。
所述步驟(3)中的冷卻時間為O. 5_2h。
該方法中，通過水熱合成法制備金納米顆粒，所得產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性和CT造影效果。配制活性元素(金、碘)摩爾濃度為O. lmol/L的樣品，以碘海醇作為對照，進行體內(nèi) CT造影性能評價。
使用NMR (核磁共振)、UV-Vis (紫外可見光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、CT機表征本發(fā)明獲得的樹狀大分子/金納米顆粒的結(jié)果分別如下
(I) NMR測試結(jié)果
NMR圖譜表明樹狀大分子表面基團的類型以及數(shù)量。參照說明書附圖1。附圖1 中出現(xiàn)在1. 87ppm處的化學(xué)位移峰為乙酰基中甲基的特征峰。由此可證明樹狀大分子表面的氨基已通過乙?；饔帽晦D(zhuǎn)化為了乙?；?br> (2) UV-Vis 測試結(jié)果
UV-Vis測試結(jié)果表明本發(fā)明中制備得到的納米顆粒在521nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。參照說明書附圖2。這是金納米顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰，表明本發(fā)明中成功制備得到了金納米顆粒。所得納米顆粒在不同PH (5-8)和溫度(4-50°C)條件下具有良好的穩(wěn)定性。參照說明書附圖3。
(3) TEM測試結(jié)果
TEM測試結(jié)果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布。參照說明書附圖4。乙?；敖鸺{米顆粒的平均尺寸為5. 5nm，；乙?；笃骄叽鐬?. 6nm。乙?；昂?，金納米顆粒的尺寸沒有明顯的改變。
(4)細胞毒性試驗結(jié)果
細胞毒性試驗結(jié)果表明在200-3000nM范圍內(nèi)，乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒顯示良好的細胞相容性，與乙?；暗漠a(chǎn)品相比有明顯的提高。參照說明書附圖5。
(5)體外X-射線衰減性能測試結(jié)果
體外X-射線衰減性能測試結(jié)果表明，樹狀大分子/金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比，表現(xiàn)出相近的X-射線衰減系數(shù)。參照說明書附圖6。與細胞共培養(yǎng)后，對細胞的 CT值顯示出一定的增強作用。參照說明書附圖7。
(6)體內(nèi)CT造影測試結(jié)果
體內(nèi)CT造影測試結(jié)果表明，樹狀大分子/金納米顆粒與傳統(tǒng)造影劑碘海醇相比， 表現(xiàn)出增強的肝臟等器官的造影效果，以及延長的體內(nèi)停留時間。參見說明書附圖8、圖9， 以及圖10。
以第二代聚酰胺-胺樹狀大分子為穩(wěn)定劑，通過水熱合成法制備具有CT造影功能的樹狀大分子/金納米顆粒，本發(fā)明涉及了三個基本原理
(I)聚酰胺-胺樹狀大分子末端氨基的弱還原性。其還原性在加熱條件下有所增強。
(2)水熱合成法簡單、易操作，綠色環(huán)保。
(3)金納米顆粒對X-射線有良好的衰減能力，及延長的體內(nèi)停留時間。
有益效果
(I)本發(fā)明的制備過程簡單，實驗條件溫和，易于操作，具有擴大規(guī)模生產(chǎn)的可能
(2)本發(fā)明方法制備的金納米顆粒具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性；
(3)制備得到的樹狀大分子/金納米顆粒具有優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的活體CT成像效果，為新型造影劑的開發(fā)打下了良好的實驗基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明制備樹狀大分子/金納米顆粒乙?；蟮腘MR譜圖2為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒乙酰化前后的UV-Vis譜圖3為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒在不同pH (5-8) (a)和溫度 (4-50°C) (b)條件下的UV-Vis圖譜。
圖4為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒的TEM圖片，以及相應(yīng)的尺寸分布圖。其中，乙?；?a，b)、乙酰化后(c，d);
比較；
CT造影效果比較。圖5為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒的細胞毒性試驗結(jié)果；圖6為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒與碘海醇的體外X-射線衰減系數(shù)圖7為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒的體外細胞CT造影結(jié)果；圖8為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒(a)與碘海醇(b)對大鼠肝臟、膀胱
圖9為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒(a)與碘海醇(b)對大鼠腎臟、脾臟CT造影效果比較。圖10為本發(fā)明制備的樹狀大分子/金納米顆粒與碘海醇靜脈注射后的體內(nèi)主要器官CT值。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1取HAuCl450mg，溶于蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻，配制成濃度為30mg/ mL的溶液。取第二代聚酰胺-胺樹狀大分子(G2. NH2) 162. 97mg,溶于16mL蒸餾水中，磁力震蕩使之充分溶解均勻。將該溶液置于60°C水浴中預(yù)熱20min。取HAuCl4溶液2. 06lmL，加入預(yù)熱好的樹狀大分子溶液中。溫度維持在60°C，磁力攪拌反應(yīng)3. Oh。反應(yīng)結(jié)束后，對所得溶液進行透析，蒸餾水(6次，2L/次)。然后進行冷凍干燥處理，得到乙?；暗臉錉畲蠓肿?金納米顆粒，-20°C保存。UV-Vis測試結(jié)果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于521nm (附圖2)。這表明體系中成功制備了金納米顆粒。TEM測試結(jié)果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為5.5±1.8nm (附圖4)。乙?；暗臉錉畲蠓肿?金納米顆粒具有良好的單分散性，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。實施例2取實施例1中制備的樹狀大分子/金納米顆粒溶液(G2. NH2, 74. 48mg),室溫冷卻Ih0加入三乙胺308. 7iiL，攪拌0. 5h。之后，加入乙酸酐174. 7 y L，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS緩沖液(3次，2L/次)和蒸餾水(3次，2L/次)對反應(yīng)混和液進行透析，然后進行冷凍干燥處理，得到乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒，_20°C保存。1H NMR譜圖結(jié)果顯示乙酰化反應(yīng)后出現(xiàn)了乙酰甲基的峰(1. 87ppm)，表明乙?；磻?yīng)的成功進行(附圖1)。UV-Vis測試結(jié)果表明譜圖中出現(xiàn)的吸收峰位于521nm (附圖2)。這表明乙酰化后，金納米顆粒的尺寸沒有發(fā)生明顯的改變。TEM測試結(jié)果表明制備得到的金納米顆粒的尺寸分布為5. 6±1. Snm (附圖4)。乙酰化后的樹狀大分子/金納米顆粒具有良好的單分散性，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。實施例3取制備得到的乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒，配制為0. 2mg/mL的水溶液。之后，以0.1M的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH值(5. O、6. 0、7. O、8. O)。室溫放置20min后，進行紫外測試。取制備得到的乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒，配制為0. 2mg/mL的水溶液。之后，放置于不同溫度條件(4、室溫20、37、50°C)下。穩(wěn)定半小時后，進行紫外測試。該產(chǎn)品在不同pH (5-8)和溫度(4_50°C)條件下的紫外圖譜沒有發(fā)生明顯的偏移和改變，表明其具有良好的穩(wěn)定性(附圖3)。
實施例4
取制備得到的乙?；?、后的樹狀大分子/金納米顆粒各3. 2Img和4. 05mg，用無菌PBS緩沖液配置成60000nM的母液。之后梯度稀釋為2000，5000，10000，20000，30000nM的樣品溶液。
取培養(yǎng)好的KB細胞種于96孔板中，按照I萬細胞/孔的密度接種，每孔體積 200 μ L0培養(yǎng)過夜后，加入上述各稀釋梯度的樣品，與細胞共培養(yǎng)24h。每個梯度用培養(yǎng)液稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000, 2000, 3000nM。每個梯度做5個平行孔，以 PBS緩沖液作為空白對照。隨后用MTT法檢測細胞活力。每孔加MTT溶液(5mg/mL)20 μ L， 37°C孵化4h。之后除去孔中液體，加入二甲亞砜溶液200 μ L。搖床混勻20min。之后用酶標儀檢測570nm處吸光度值。
MTT測試結(jié)果顯示，乙?；暗漠a(chǎn)品在試驗濃度范圍內(nèi)，顯示出一定的細胞毒性。 同樣以PBS作為空白對照，乙酰化后的產(chǎn)品在此范圍內(nèi)均不顯示出細胞毒性。表明乙?；茱@著提高納米顆粒的細胞相容性(附圖5)。
實施例5
取制備得到的乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒，以蒸餾水為溶劑，配制金濃度為O.1M的母液。之后梯度稀釋出O. 08，0. 06，0. 04，0. 02，0. 01和O. 005M的樣品。同時， 以臨床用碘海醇為對照材料，以蒸餾水稀釋出相應(yīng)碘濃度的樣品。之后，對這兩組材料進行 CT成像測試。
CT成像測試結(jié)果顯示，在試驗濃度范圍內(nèi)，樹狀大分子/金納米顆粒表現(xiàn)出與碘海醇相近的X-射線衰減系數(shù)，二者具有相似的體外CT成像性能(附圖6)。
實施例6
取培養(yǎng)好的KB細胞種于6孔板中，按照150萬細胞/孔的密度接種，每孔體積2.5mL。培養(yǎng)過夜后，加入上述實施例3中各稀釋梯度的樣品，與細胞共培養(yǎng)3h。每個梯度稀釋10倍，即每孔終濃度分別為200，500，1000，2000，3000nM。之后PBS洗三次，胰酶消化， 分散于O.1mL PBS緩沖液中，進行CT成像測試。
CT成像測試結(jié)果顯示，KB細胞吞噬納米顆粒后，CT值有一定的提高(附圖7)。
實施例7
取制備得到的乙?；蟮臉錉畲蠓肿?金納米顆粒250mg，分散于無菌PBS緩沖液中，制備得到金濃度為O.1M的溶液。取大鼠一只(約170g)，按照每千克體重O. 47mmol金的劑量，尾靜脈注射造影劑，進行活體CT成像實驗。間隔時間點CT掃描。對掃描圖片測量各主要器官的CT值。以碘海醇為對照，注射碘的劑量與金一致。
活體CT成像實驗結(jié)果顯示，所得納米顆粒在30_45min左右顯示最好的肝臟及脾臟造影效果。腎臟中有較少停留，膀胱中緩慢增加。相比之下，碘海醇對肝臟、脾臟幾乎沒有造影效果。相反，在腎臟中有較多停留。這可能會引起潛在的腎臟毒性。在5min左右， 膀胱中即有大量富集，即將被泌尿系統(tǒng)排出體外(附圖8，9)。這與測量到的各個器官的CT 值相吻合(附圖10)?？傊?，本發(fā)明制備的產(chǎn)品在體內(nèi)循環(huán)時間長，未被泌尿系統(tǒng)迅速排出體外，表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)造影劑碘海醇的對肝臟等主要器官的CT造影效果。
權(quán)利要求
1.一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括 (1)以低代數(shù)的末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子作為金納米顆粒的穩(wěn)定齊U，配制摩爾濃度為2. 5-3. 5mM的水溶液，預(yù)熱； (2)在上述溶液中加入氯金酸溶液，其中樹狀大分子與氯金酸溶液中金的摩爾比為1:3,磁力攪拌； (3)將反應(yīng)后的溶液室溫冷卻之后，加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)6-12倍的三乙胺，攪拌10-30min ;之后加入樹狀大分子末端氨基摩爾數(shù)5_10倍的乙酸酐，進行乙?；磻?yīng)，攪拌反應(yīng)24h ;隨后透析，得到樹狀大分子穩(wěn)定的金納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，加入氯金酸之前，樹狀大分子溶液要先預(yù)熱20-40min，預(yù)熱的溫度為60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的磁力攪拌反應(yīng)過程持續(xù)3-4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的冷卻時間為O. 5-2h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于第二代聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒的CT造影劑的制備方法，包括稱取末端為氨基的第二代聚酰胺-胺樹狀大分子溶于水溶液中，在水浴條件下加入氯金酸溶液，磁力攪拌反應(yīng)3h；室溫冷卻后進行乙酰化處理；將反應(yīng)后的溶液進行透析，冷凍干燥處理得到終產(chǎn)品；對產(chǎn)品進行體內(nèi)、體外CT造影性能進行評價。本發(fā)明中涉及的產(chǎn)品制備過程簡單環(huán)保，所得產(chǎn)品具有良好穩(wěn)定性和細胞相容性，同時顯示良好的體內(nèi)CT造影效果。
文檔編號A61K49/04GK102989014SQ20121045484
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者史向陽, 劉輝, 張貴祥, 許艷紅 申請人:東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院